熊新貴，邢之華，黃　衛(wèi)，聶課朝，劉海濤，王　楊，楊　波，張春虎，范　榮

(中南大學湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008)

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UPLC-PDA法測定慢性應激抑郁大鼠灌胃藥對枳殼厚樸后吸收入血、胃腸及腦組織的成分

熊新貴，邢之華，黃衛(wèi)，聶課朝，劉海濤，王楊，楊波，張春虎，范榮

(中南大學湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410008)

目的測定傳統(tǒng)藥對枳殼厚樸中主要活性成分及連續(xù)灌胃枳殼厚樸藥對7周可被慢性應激抑郁大鼠血清、胃腸及腦組織吸收的成分。方法建立UPLC-PDA測定的新方法，色譜條件為Waters Acquity UPLC BEH(R)C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相：乙腈(A)和0.5%醋酸水(B)；梯度洗脫方法；流量0.3 mL/min，柱溫40 ℃；檢測波長300 nm。同步定性測定枳殼厚樸藥對中的主要7種成分及灌胃該方7周后慢性應激抑郁大鼠血清、胃腸及腦組織中的吸收成分。結(jié)果在12 min內(nèi)，該藥對中柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、和厚樸酚及厚樸酚7種成分獲得良好分離，這7種成分均可被慢性應激抑郁大鼠胃腸組織吸收，僅橙皮苷及水合橙皮內(nèi)酯可被慢性應激抑郁大鼠血清及腦組織吸收。各成分的LOD在0.12×10-3～1.32×10-3μL/mL，信噪比(S/N)≥3。結(jié)論該方法簡單、準確、靈敏，為傳統(tǒng)藥對枳殼厚樸的質(zhì)量控制及其抗抑郁、促胃腸動力作用機制的深入研究奠定了分析方法學基礎(chǔ)。

枳殼；厚樸； UPLC-PDA； 抑郁；大鼠； 胃腸組織；腦組織

枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L及其栽培變種或甜橙Citrus sinensis Osbeckr的干燥幼果，性微寒，味苦、辛、酸，具有理氣寬胸、行滯消脹的功效，是中醫(yī)常用理氣藥。厚樸為木蘭科植物厚樸或凹葉厚樸的干燥干皮、根皮及枝皮，味苦、辛，微溫，歸脾、胃、肺、大腸經(jīng)，具有行氣消積、燥濕除滿、降逆平喘的功效。枳殼、厚樸為傳統(tǒng)中藥藥對，臨床上常用來治療功能性消化不良、胃腸脹氣、術(shù)后胃腸功能的恢復等[1]。近期有研究表明枳殼、厚樸亦具有抗抑郁作用[2-5]。而抑郁癥常與功能性胃腸病共病[6-7]，脾胃在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展與治療過程中均發(fā)揮著重要作用[8]，因而調(diào)理脾胃氣機對治療抑郁癥具有重要作用。而中藥成分多樣且中藥復方中成分愈加復雜，研究者普遍認為中藥復方獲得療效的關(guān)鍵是能夠到達作用部位且復方中某些重要成分可被吸收[9-10]。故本研究探討了枳殼、厚樸藥對的質(zhì)量控制及慢性應激抑郁大鼠長期灌服此藥對后可被大鼠血清、胃腸組織及腦組織吸收的成分，從而為下一步研究奠定基礎(chǔ)。

1　實驗資料

1.1儀器超高效液相色譜儀(ACQUITY UPLC system,美國Waters公司)，Empower色譜工作站，包括二元溶劑管理系統(tǒng)、樣品處理器、柱溫箱、自動進樣器、PDA檢測器；SIGMA2-16K離心機(北京華威中儀科技有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限責任公司)；LGJ-10冷凍干燥機(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；HGC-12A氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)。

1.2試劑柚皮苷、柚皮蕓香苷、新橙皮苷、橙皮苷、和厚樸酚及厚樸酚標準品均購自成都曼斯特生物科技有限公司，水合橙皮內(nèi)酯購自美國Sigma公司，純度均≥98%。甲醇和乙腈(tedia公司，美國俄亥俄州)。

1.3藥品及制備枳殼、厚樸均購于湖南省長沙市湘雅路老百姓大藥房，經(jīng)過中南大學中西醫(yī)結(jié)合研究所鑒定，樣品憑證存于中南大學中西醫(yī)結(jié)合研究所。枳殼、厚樸按照1∶1的比例稱質(zhì)量，混合，第1次煎煮：生藥與水按1∶8(g/mL)比例，煎煮之前浸泡30 min，煮沸后煎煮30 min，然后8層紗布過濾獲得藥液；第2次以1∶6比例重復煎煮。將2次煎煮過濾后的藥液合并，60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干，得率為25.62%，凍干粉密封保存于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.4動物及慢性應激抑郁大鼠模型的建立采用雄性SD大鼠進行實驗，體質(zhì)量150～180 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物合格證號：SYXK(湘)2011-0003，實驗前在飼養(yǎng)室正常飼養(yǎng)2周，室溫(22±2)℃，濕度(60±4)%，按照晝夜各12 h循環(huán)，白天7：00—19：00，食物及水自由攝取。除空白組外，模型組接受7周應激刺激，包括：搖晃5 min/d，每天2次，不定時；禁水24 h；禁食24 h；夾尾1 min/d，每天2次，不定時；電擊足底，每次10 s，間隔1 min；冰水游泳15 min/d；噪聲刺激；轉(zhuǎn)換晝夜節(jié)律24 h；制動。實驗過程中每天上午給藥(枳殼厚樸湯劑按20 mg/kg劑量給予)，下午或晚上給予相應刺激[11]，上述刺激每天1種，連續(xù)2 d內(nèi)動物所接受的處理不能相同。

1.5檢測方法

1.5.1色譜條件Waters Acquity UPLC BEH(R)C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相：乙腈(A)和0.5%醋酸水(B)；梯度洗脫：14%A∶86%B(初始)，20%A∶80%B(3 min)，17%A∶83%B(4 min)，18%A∶82%B(5 min)，6%A∶94%B(7 min)，40%A∶60%B(9 min)，60%A∶40%B(10 min)，80%A∶20%B(12 min)，100%A∶0%B(13 min)。流量0.3 mL/min，柱溫38 ℃，檢測波長300 nm，進樣量3 μL。

1.5.2溶液的配置①標準品溶液的配置：將7種標準品精確稱質(zhì)量，分別用甲醇溶解制成標準品溶液；將各種標準品溶液稀釋、混合溶解成適宜濃度的7種標準品混合母液；標準品溶液與混合標準品溶液均保存在棕色容量瓶中，置于4 ℃冰箱待用。②樣本溶液的配置：將藥對枳殼厚樸中藥凍干粉稀釋溶解為3.2 mg/mL(生藥/水)，樣本絕對進樣量3 μL。

1.5.3生物樣本的制備①血清樣本的取得：大鼠造模完成后，先注射乙醚進行麻醉，從下腔靜脈注射肝素，從門靜脈取血，以3 000 r/min的速率離心分離，取上清液，存于-20 ℃待測。血清樣本的處理：將上述方法取得的上清液常溫溶解后分別加入6 mL乙醚及50 μL 1 mmol/L HCl，搖勻1 min，15 000 r/min離心15 min。取上清液在常溫下?lián)]發(fā)干，加入100 μL甲醇，15 000 r/min離心15 min。再取上清液經(jīng)0.22 μm混合纖維素脂微孔濾膜濾過，即得，樣本進樣量3 μL。② 胃腸組織樣本的取得：大鼠造模完成后，斷頭處死，快速將胃及小腸組織取出，用4 ℃生理鹽水漂洗，除去血液、濾紙拭干，放置-40 ℃冰箱保存待用。胃腸樣本的處理：精密稱量胃及小腸組織，按組織和4 ℃雙蒸水1∶2比例配置勻漿液；將胃及小腸組織用手術(shù)剪剪碎，轉(zhuǎn)移已被剪碎的組織至玻璃勻漿器中勻漿；將勻漿完畢后獲得的組織勻漿液保存至-40 ℃冰箱中；將組織勻漿液與甲醇按1∶1的比例配置溶液，渦旋8 min，超聲溶解20 min，15 000 r/min離心15 min，取上清液，氮吹儀(60 ℃水浴)吹干，再次加入適量甲醇，重復上述步驟，最終取得的上清液總液體體積60 μL，取3 μL直接進入UPLC測定。③ 邊緣系統(tǒng)腦組織樣本的取得：造模完成后立即取出大鼠邊緣系統(tǒng)腦組織，稱質(zhì)量后加5 mL生理鹽水，用玻璃研缽研磨。腦勻漿以2 500 r/min的速率離心分離，取上清液存于-20 ℃待測。邊緣系統(tǒng)腦組織樣本的處理：組織勻漿液與甲醇按1∶1的比例配置溶液，渦旋8 min，超聲溶解20 min，15 000 r/min離心15 min，取上清液，氮吹儀(60 ℃水浴)吹干，再次加入適量甲醇，重復上述步驟，樣本絕對進樣量3 μL。

2　結(jié)　　果

通過超高效液相色譜系統(tǒng)，依據(jù)標準品與枳殼厚樸湯劑中對應成分的保留時間及特征性紫外光譜，在不足12 min內(nèi)，7種成分獲得良好分離，7種標準品、枳殼厚樸湯劑及慢性應激抑郁大鼠灌胃枳殼厚樸湯劑7周后血清、胃腸組織及邊緣系統(tǒng)腦組織的典型色譜圖見圖1～6。慢性應激抑郁大鼠灌胃7周后7種成分均可被大鼠胃腸組織吸收，僅橙皮苷及水合橙皮內(nèi)酯可被慢性應激抑郁大鼠血清及邊緣系統(tǒng)腦組織吸收。柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、和厚樸酚及厚樸酚的保留時間依次為3 min 22 s，3 min 24 s，3 min 46 s，3 min 58 s，4 min 16 s，10 min 56 s及11 min 6 s。7種成分的LOD按色譜出現(xiàn)時間依次為1.32，1.16，0.16×10-3，0.26×10-3，0.12×10-3，0.17，0.26 μL/mL。

3　討　　論

枳殼、厚樸為傳統(tǒng)中藥藥對，藥對是我國歷代醫(yī)家長期醫(yī)療實踐的經(jīng)驗總結(jié), 組成簡單卻具備傳統(tǒng)中藥配伍的基本特征，是復雜方劑組成的基礎(chǔ)。枳殼有促胃腸動力、抗消化不良、抗氧化和消炎作用[12-13]，其主要成分為柚皮苷、柚皮蕓香苷、新橙皮苷、橙皮苷及水合橙皮內(nèi)酯[14-16]。厚樸具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化及抗抑郁作用，其主要成分為和厚樸酚及厚樸酚[17-18]。中藥成分復雜多樣，有大分子的和小分子的，有無機的和有機的，這些成分構(gòu)成了中藥的最基本的物質(zhì)基礎(chǔ)。中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是闡釋中藥整體功效及其作用本質(zhì)的核心環(huán)節(jié)，是中藥安全、有效和質(zhì)量控制的重要基礎(chǔ)[19]。而研究者普遍認為中藥發(fā)揮藥效的直接物質(zhì)應該在體內(nèi)，首先必須明確吸收進入體內(nèi)的中藥來源成分，尤其是能到達作用部位的成分[9-10]。

1為柚皮蕓香苷；2為柚皮苷；3為橙皮苷；4為新橙皮苷；5為水合橙皮內(nèi)酯；6為和厚樸酚；7為厚樸酚

1為柚皮蕓香苷；2為柚皮苷；3為橙皮苷；4為新橙皮苷；5為水合橙皮內(nèi)酯；6為和厚樸酚；7為厚樸酚

1為柚皮蕓香苷；2為柚皮苷；3為橙皮苷；4為新橙皮苷；5為水合橙皮內(nèi)酯；6為和厚樸酚；7為厚樸酚

1為柚皮蕓香苷；2為柚皮苷；3為橙皮苷；4為新橙皮苷；5為水合橙皮內(nèi)酯；6為和厚樸酚；7為厚樸酚

3為橙皮苷； 5為水合橙皮內(nèi)酯

3為橙皮苷； 5為水合橙皮內(nèi)酯

本研究通過新建立的UPLC-PDA方法，在不足12 min內(nèi)，同步測定枳殼厚樸湯劑中7種成分和慢性應激抑郁大鼠灌胃該方7周后血清、胃腸組織及邊緣系統(tǒng)腦組織的吸收成分，結(jié)果顯示枳殼厚樸的主要成分在制劑與生物樣本中獲得良好分離，均在最低檢測限范圍以上，柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橙皮內(nèi)酯、和厚樸酚及厚樸酚這7種成分均可被慢性應激抑郁大鼠胃腸組織吸收，僅橙皮苷及水合橙皮內(nèi)酯可被慢性應激抑郁大鼠血清及腦組織吸收。該方法準確度高、靈敏度好、樣品前處理簡單，為傳統(tǒng)藥對枳殼厚樸的質(zhì)量控制及其抗抑郁、促胃腸動力作用機制的深入研究奠定了分析方法學基礎(chǔ)。

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UPLC-PDA determination of compounds absorbed in blood, gastrointestinal and brain tissues by chronic unpredictable stress induced depression rats after administration of Zhiqiao-Houpu herb pair

XIONG Xingui, XING Zhihua, HUANG Wei,NIE Kechao, LIU Haitao, WANG Yang,YANG Bo, ZHANG Chunhu, FAN Rong1

(Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, Hunan,China)

Objective It is to simultaneously qualitative determinate the absorbed compounds in blood, gastrointestinal and brain tissues by chronic unpredictable stress induced depression rats after seven weeks’ administration Zhiqiao-Houpu herb pair (ZQHPHP). Methods A novel UPLC-PDA method was established to simultaneously determinate the compounds in ZQHPHP and those absorbed in blood, gastrointestinal tissue and brain tissue after administration of ZHHPHP for seven weeks. The components were separated with Waters Acquity UPLC BEH(R)C18 (2.1 mm×50 mm，1.7 μm) with a flow rate of 0.3 mL/min at 40 ℃ and detected at 300 nm. The mobile phase contained A-acetonitrile and B-0.5% acetic acid with gradient elution. Results Seven compounds in ZQHPHP were well separated including narirutin, naringin, hesperidin, neohesperidin, meranzin hydrate, honokiol and magnolol within 12 minutes which could be absorbed in gastrointestinal tissue by CUSIDR. However only hesperidin and meranzin hydrate can be absorbed in blood and brain tissue by CUSIDR. LODs of component (μL/mL) were 0.12×10-3-1.32(S/N≥3)． Conclusion The method is quick and sensitive which lays the foundation for the quality control of the above compounds in ZQHPHP and helps to further elucidating the mechanism behind its antidepressant and prokinetic effects.

Zhiqiao-Houpu herb pair; UPLC-PDA; depression rats; gastrointestinal and brain tissues; cerebral tissue

熊新貴，女，博士，主治醫(yī)師，研究方向為消化系統(tǒng)疾病研究。

黃衛(wèi)，E-mail：huangweidavid@aliyun.com

國家自然科學基金青年基金項目(81303098)；湖南省科技廳社會發(fā)展支撐計劃項目(2015SK20322)；湖南省中管局一般項目(201596)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.25.002

R-332

A

1008-8849(2016)25-2741-04

2016-03-10