姚宏波+廉潔+郎尉雅+孫麗慧+張海燕+李林

[摘要]目的探討B(tài)MSCs移植對AD模型大鼠的治療作用。方法將大鼠隨機分成5組，正常組、模型組、模型對照組、治療組、治療對照組，每組10只。雙側(cè)海馬區(qū)注射Aβ建立AD大鼠模型后，治療組進行BMSCs的移植治療。治療對照組用氫溴酸加蘭他敏進行灌胃治療。結(jié)果行為學(xué)實驗檢測各組大鼠平均逃避潛伏期及首次跨越原平臺時間，模型組與正常組比較（P<0.01），治療組與治療對照組與模型組比較（P<0.01），與正常組比較（P<0.05），均有顯著性差異；形態(tài)學(xué)實驗HE染色顯示模型組顆粒細胞及錐體細胞有破壞現(xiàn)象，治療組和治療對照組明顯恢復(fù)。免疫組化檢測顯示正常組和模型對照組可見海馬區(qū)陽性蛋白表達較多而模型組陽性表達明顯減少，治療組和治療對照組陽性表達較模型組明顯增多。結(jié)論BMSCs移植治療AD的作用機制可能與通過調(diào)節(jié)Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響了學(xué)習(xí)記憶相關(guān)酶及蛋白在海馬區(qū)的表達而發(fā)揮作用有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]Wnt/β-Catenin；骨髓基質(zhì)干細胞；阿爾茨海默病

阿爾茨海默病（alzheimers disease，AD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其神經(jīng)組織無法自然恢復(fù)。因此，體外誘導(dǎo)多能干細胞分化進行細胞移植來修復(fù)受損的神經(jīng)組織已經(jīng)成為研究的熱點之一。近年來發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路控制著體內(nèi)多種程序，例如細胞的增殖、自我更新、細胞分化、細胞極性、細胞死亡等過程。Wnt信號通路與AD的病理過程存在著十分密切的關(guān)系，同時在神經(jīng)干細胞的增殖、分化以及遷移等方面也起著重要的作用。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchvmalstem cells，BMSCs）在中樞神經(jīng)組織移植中有明顯優(yōu)勢，是一種良好的細胞替代治療的靶細胞。因此本研究希望通過觀察Wnt通路相關(guān)蛋白β-Catenin的變化，探討B(tài)MSCs移植對AD模型大鼠的治療作用。

1材料與方法

1.1材料

清潔級健康Wistar雄性大鼠50只，體重180～220g，由吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供；Moriss水迷宮；大鼠腦立體定位儀；Aβ美國Biosource公司；氫溴酸加蘭他敏，陜西森弗生物技術(shù)有限公司；β-Catenin測試盒購自武漢眾一生物試劑經(jīng)營部。

1.2實驗動物分組

健康Wistar大鼠雄性50只隨機分成5組，正常組、模型組、模型對照組、治療組、治療對照組，每組10只。

1.3方法

正常組：常規(guī)飼養(yǎng)，不進行任何處理。模型組：稱重，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腦立體定位儀固定，暴露頂骨，根據(jù)大鼠腦立體定位儀圖譜，選擇大鼠海馬區(qū)進行注射雙側(cè)海馬區(qū)注射Aβ每側(cè)10μL，5min內(nèi)注完，注射后留針5min，術(shù)后用牙托粉封固骨孔，縫合皮膚，三日內(nèi)每日肌注青霉素G10萬單位。造模后7天，利用Moriss水迷宮進行試驗，檢測造模是否成功，成功后不進行任何治療。模型對照組，注射生理鹽水代替Aβ方法同模型組。治療組：建立AD大鼠模型后，進行BMSCs的移植治療，將培養(yǎng)好的BMSCs向AD模型大鼠雙側(cè)海馬內(nèi)注射，注射部位為原Aβ的注射部位，術(shù)后處理同模型組。治療對照組：建立AD大鼠模型后，用氫溴酸加蘭他敏，以每日每千克體重0.6mg灌胃，治療30d。

1.4測定方法

1.4.1行為學(xué)實驗在造模后7d及治療30d后，進行Morris水迷宮實驗：定位航行實驗用于測量大鼠對水迷宮學(xué)習(xí)和記憶的獲取能力。將大鼠進行水迷宮學(xué)習(xí)訓(xùn)練3d。記錄其尋找到隱藏在水面下平臺的時間，即逃避潛伏期?？臻g探索實驗用于測量大鼠學(xué)會尋找平臺后，對平臺空間位置記憶的保持能力。定位航行實驗結(jié)束后，即第4d開始撤去平臺，將大鼠從同一個入水點放入水中，測驗大鼠對原平臺的記憶。記錄其第一次到達原平臺位置的時間。

1.4.2形態(tài)學(xué)實驗各組大鼠行為學(xué)檢測完畢，取腦組織海馬進行石蠟切片制作并采用HE染色觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。

1.4.3免疫組化染色

采用PV二步法進行免疫組化檢測各組AD大鼠海馬組織細胞中Wnt信號通路相關(guān)蛋白β-Catenin的表達，其中陰性對照組應(yīng)用0.01MPB緩沖液代替一抗，顯微鏡觀察。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理

采用Image-Proplus5.0圖像分析軟件及SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，進行t檢驗，計量資料以（x±s）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1行為學(xué)檢測

定位航行實驗和空間探索實驗檢測各組大鼠平均逃避潛伏期及首次跨越原平臺時間。模型組大鼠逃避潛伏期及首次跨越平臺時間均比正常組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，治療對照組及治療組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力有明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2形態(tài)學(xué)檢測

各組大鼠行為學(xué)檢測完畢，取腦組織海馬進行石蠟切片制作并采用HE染色觀察海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)改變。見圖1。

A和B兩圖可見海馬區(qū)顆粒細胞及錐體細胞呈多層規(guī)則排列，整齊而緊密。神經(jīng)元內(nèi)胞漿豐富，顆粒細胞核大而圓，染色質(zhì)較淺，核膜清楚，可見清晰嗜堿性核仁；錐體細胞樹突豐富，長而整齊地向海馬伸展；c圖顆粒細胞及錐體細胞有破壞現(xiàn)象，細胞排列稀疏、紊亂，細胞體積縮小，間隙擴大，出現(xiàn)胞漿濃縮深染和胞核固縮，錐體細胞樹突變短，稀疏；D和E圖海馬區(qū)顆粒細胞排列較規(guī)整，細胞清晰，核圓，核仁明顯，細胞數(shù)量減少。

2.3wnt信號通路相關(guān)蛋白β-Catenin的表達

A和B兩圖可見海馬區(qū)陽性蛋白表達較多，可見較多棕黃色顆粒主要位于胞漿內(nèi)；C圖陽性表達明顯減少；D和E圖海馬區(qū)陽性表達與C圖比較明顯增多，接近于A圖和B圖。見圖2。

3討論

AD是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力損害，是老年癡呆最常見的一種。腦內(nèi)老年斑形成、含有tau蛋白的神經(jīng)纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元缺失變性是其三大病理學(xué)特征。Wnt信號通路的激活能夠阻止β-淀粉樣蛋白引起的神經(jīng)毒性對神經(jīng)元的損害。此外，突觸丟失誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡也是AD發(fā)病的危險因素之一。如果突觸組裝與去組裝行為發(fā)生失衡，那么便可能會引起神經(jīng)退行性病變，激活Wnt信號通路能夠通過促進突觸發(fā)生而保護神經(jīng)元。大量研究表明，Wnt信號通路參與了有功能的完整的神經(jīng)元產(chǎn)生的大部分過程，故Wnt信號通路在AD的發(fā)生中起著重要的作用。Wnt蛋白通過自分泌或旁分泌作用與位于細胞膜上的受體相結(jié)合，激活細胞內(nèi)信號通路，調(diào)節(jié)靶基因的表達，在胚胎的發(fā)育過程中對細胞的增殖、分化、遷移、極性化和凋亡均起到重要的作用。神經(jīng)元死亡是神經(jīng)退行性疾病如AD、帕金森病以及腦中風(fēng)、腦外傷等最為重要的病理特征。研究發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥患者腦內(nèi)Wnt信號通路失調(diào)，通路中的胞內(nèi)β-Catenin含量明顯減少。β-Catenin基因位于3p21，編碼蛋白分子量約92kD，是Wnt信號通路中的重要一員，是正向調(diào)節(jié)因素。Wnt信號的傳遞取決于胞漿內(nèi)游離β-catenin的水平。Wnt/β-Catenin信號途徑對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、神經(jīng)干細胞的增殖和分化都有著重要的作用，細胞內(nèi)游離β-Catenin的水平能夠影響-神經(jīng)元樹突的形態(tài)發(fā)生，同時，高水平的β-Catenin還可促進神經(jīng)元樹突的分枝。

BMSCs是存在于骨髓腔內(nèi)的多能干細胞，具有獨特的免疫學(xué)特征，是理想的組織工程種子細胞。因其來源廣泛，取材方便，增殖能力強，并且具有多向分化能力，在特定的條件下能被誘導(dǎo)分化為骨、軟骨、脂肪等中胚層細胞，所以被廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)行列，在一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病如神經(jīng)退行性疾病的治療中發(fā)揮作用。Lee等發(fā)現(xiàn)，將BMSCs移植到AD大鼠海馬的齒狀回附近，細胞移植組的β-淀粉樣蛋白水平下降，并且β-淀粉樣蛋白沉積的減少伴隨著小膠質(zhì)細胞的激活，小膠質(zhì)細胞常常出現(xiàn)在β-淀粉樣蛋白沉積的附近，因此BMSCs具有清除β-淀粉樣蛋白沉積和/或阻斷β-淀粉樣蛋白沉積形成的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植治療后，在AD模型大鼠的行為學(xué)、形態(tài)學(xué)以及免疫組化等檢測方面，均有明顯改變，符合上述研究發(fā)現(xiàn)。因此，深入闡明Wnt信號在干細胞中的精確功能，在干細胞增殖分化中的具體機制及其與AD的關(guān)系，對將來臨床BMSCs治療AD等神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病方面具有非常重要的意義。