張振乾，胡慶一，官春云

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙 410128)

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高油酸油菜研究現(xiàn)狀、存在的問題及發(fā)展建議

張振乾，胡慶一，官春云*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙 410128)

高油酸菜油具有很好的營養(yǎng)保健功能，其品質(zhì)可與茶油、橄欖油等高級(jí)食用植物油媲美，對(duì)于改變我國食用植物油自給不足、促進(jìn)油菜產(chǎn)業(yè)升級(jí)等方面有很好的作用。總結(jié)了國內(nèi)外相關(guān)研究機(jī)構(gòu)在高油酸油菜方面的研究動(dòng)態(tài)及應(yīng)用情況，同時(shí)對(duì)油酸的遺傳特性、高油酸油菜選育途徑(小孢子培養(yǎng)、遠(yuǎn)緣雜交、誘變和轉(zhuǎn)基因技術(shù))和分子生物學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并針對(duì)當(dāng)前存在的問題提出了一些建議。

油菜；高油酸；遺傳；育種

高油酸油菜是指種子中油酸含量大于75%的油菜品種。高油酸菜油具有以下優(yōu)點(diǎn)：①降低超重人群的心血管疾病和血漿中的低密度脂蛋白膽固醇含量，有利于人體心血管健康，對(duì)心臟起保護(hù)作用。②高油酸油在高溫下不易氧化變質(zhì)，保質(zhì)期長，加熱到較高溫度時(shí)不冒煙，烹飪時(shí)間減少，損耗也較少，非常適用于家庭烹調(diào)及要求存放時(shí)間長的快餐食品類和糕點(diǎn)類；同時(shí)，其煎炸產(chǎn)品還擁有較好的香味。③用高油酸油生產(chǎn)的生物柴油穩(wěn)定性強(qiáng)，點(diǎn)火溫度低，冬季操作性能好。

高油酸菜油是可與茶油、橄欖油媲美的高級(jí)食用植物油，且油菜種植簡單易行，可有效提高我國高級(jí)食用植物油的供給水平；同時(shí)依據(jù)優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)原則，農(nóng)民的種植積極性將大幅提高，可有效增加我國油菜種植面積，改變我國食用植物油嚴(yán)重依賴進(jìn)口的局面。為了更好的發(fā)展高油酸油菜，促進(jìn)油菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，本文綜述了高油酸油菜研究的最新進(jìn)展，歸納了目前高油酸油菜研究的一些情況，并提出了一些建議和意見。

1　油菜高油酸研究現(xiàn)狀

1.1國外高油酸油菜發(fā)展情況

1992年，Auld等[1]利用EMS誘變獲得世界上第一個(gè)油菜高油酸突變體。1995年，第一個(gè)高油酸油菜品種(油酸含量81%)由Rücker和R?bbelen選育成功[2]。1992年，芬蘭開始白菜型油菜的高油酸育種研究[3]。2004年，歐洲第一個(gè)獲得注冊(cè)的HOLL油菜品種‘SPLENDOR’(油酸含量76.48%)問世[4]，隨之，V140OL、V141OL、V161OL(油酸含量均高于75%)等高油酸常規(guī)品種相繼推出，主要用于訂單農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[5]。2004年，加拿大Cargill種子公司CNR604(油酸含量75%)、CNR603(油酸含量85%)等品系參加品比試驗(yàn)[6]。2006年，澳大利亞投放了兩個(gè)高油酸品種，2007年又推出替代品種[7]。這些品種的培育為高油酸品種進(jìn)入初具規(guī)模的生產(chǎn)應(yīng)用創(chuàng)造了條件。

1.2國內(nèi)高油酸油菜發(fā)展情況

我國高油酸油菜研究從21世紀(jì)初開始，與國外相比雖然起步晚但發(fā)展速度快。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)及浙江省農(nóng)科院等單位都開展了品種培育及分子機(jī)理方面的研究。2006年，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)采用輻射誘變方法得到高油酸突變體[8]，通過多年的定向培養(yǎng)，2015年已經(jīng)得到48個(gè)性狀穩(wěn)定的高油酸品系，2個(gè)材料參加區(qū)試，10個(gè)材料參加品比試驗(yàn)；并同步與湖南省春云農(nóng)業(yè)科技股份有限公司及湖南盈成油脂工業(yè)有限公司聯(lián)合開展了訂單農(nóng)業(yè)生產(chǎn)示范。此外，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2012年在江陵縣馬家寨鄉(xiāng)建立高油酸油菜籽生產(chǎn)基地；浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育出油酸含量接近80%的新品系‘浙油20’，推出了“愛是?！备哂退峤】挡俗延蚚9]；并使高油酸品種產(chǎn)量水平得到進(jìn)一步提高，新育成的高油酸品系‘I10’產(chǎn)量和株型接近主栽品種‘浙雙72’，2010年轉(zhuǎn)讓給浙江農(nóng)科糧油股份有限公司進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化開發(fā)[10]，并于2015年通過浙江省品種審定，成為我國第一個(gè)高油酸油菜新品種——‘浙油80’。安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所2011年與大平集團(tuán)和巨興大平油料合作社合作，由巨興大平油料合作社生產(chǎn)試種高油酸油菜。由于品種審定標(biāo)準(zhǔn)出臺(tái)較晚，審定通過的高油酸油菜新品種較少，我國迄今尚無在生產(chǎn)上大面積應(yīng)用的高油酸油菜品種[9]。

2　高油酸油菜育種研究情況

2.1常規(guī)方法

一般常用定向選擇(從現(xiàn)有的高油酸材料中選擇油酸含量較高的材料。該方法周期長，且不能創(chuàng)造新品種和新的類型)或雜交轉(zhuǎn)育(含高油酸性狀的材料間進(jìn)行雜交，并在其雜種后代中通過選擇而育成純合品種)的方法培育高油酸油菜，具體如表1。

表1　常規(guī)方法培育高油酸油菜的研究情況Table 1　The breeding situation of high oleic acid rapeseed by traditional methods

2.2高油酸油菜育種材料早期篩選

王敬喬等[17]發(fā)現(xiàn)，可通過將葉片置于含有次氯酸鈉和吐溫的混合溶液中，觀察葉片氧化變白的快慢，在早期階段區(qū)分具有高油酸性狀的FAD2基因突變體。高建芹等[18]研究發(fā)現(xiàn)，除花期外，各生育期營養(yǎng)器官與生殖器官中的油酸相對(duì)含量呈極顯著正相關(guān)，可通過檢測(cè)營養(yǎng)器官的油酸含量預(yù)測(cè)和篩選種子高油酸含量。

2.3誘變

誘變是當(dāng)前高油酸油菜育種材料創(chuàng)新的主要方法，包括物理誘變和化學(xué)誘變。大多數(shù)高油酸突變都是由“A”插入或氨基酸替代引起的[19]。主要有兩個(gè)突變機(jī)制：一是控制油酸脫飽和生成亞油酸的Δ12-油酰脫飽和酶基因FAD2中發(fā)生了一個(gè)或多個(gè)核苷酸突變，產(chǎn)生了終止密碼子，導(dǎo)致翻譯過程中肽鏈的過早終止，使所翻譯的多肽不能作為有活性的脫飽和酶起作用，油酸因此不能脫飽和生成亞油酸而大量積累[8，20]；二是FAD2基因中的核苷酸突變引起所編碼的Δ12-油酰脫飽和酶FAD2中氨基酸的改變，影響蛋白質(zhì)的折疊和空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響酶的活性或酶與底物結(jié)合的能力，最終導(dǎo)致高油酸突變體的產(chǎn)生[21～23]。

2.3.1化學(xué)誘變

化學(xué)誘變產(chǎn)生點(diǎn)突變的頻率較高，誘發(fā)染色體畸變相對(duì)較少且多為顯性突變體，對(duì)油料作物脂肪酸品質(zhì)改良具有一定的特異性[24]。

化學(xué)誘變多采用甲基磺酸乙酯(EMS)。Auld等[1]利用EMS誘變，分別獲得了油酸含量88%以上的甘藍(lán)型油菜突變體X-82 M3、M4株系及亞油酸、亞麻酸含量大幅降低的白菜型油菜突變體M-30，將M-30與低芥酸親本Tobin雜交，F(xiàn)4株系油酸含量超過87%。Rücker和R?bbelen利用誘變方法培育出高油酸品種Expander(油酸含量達(dá)81%)[25]；通過誘變甘藍(lán)型冬油菜品種Wotan，使得油酸含量由60.3%提高到80.3%[26]。Spasibionek[27]用EMS處理甘藍(lán)型冬油菜種子，對(duì)脂肪酸組成發(fā)生顯著變化的M2代種子再次處理，篩選出2個(gè)油酸含量76%左右的突變體。湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)用1.5%的EMS處理甘藍(lán)型油菜品種湘油15號(hào)，從M2代篩選到一株油酸含量達(dá)71%的高油酸植株[20]，多代自交篩選后得到油酸含量80%以上的材料。黃永娟等[23]也利用EMS誘變得到高油酸油菜突變體。

此外，還有利用其它誘變劑獲得高油酸材料的報(bào)道。加拿大通過8 mM亞硝酸乙酯的二甲亞酸溶液處理油菜品種Regent Topas和Amdor，獲得油酸含量為78%的突變系[28]。和江明等[29]用秋水仙堿溶液處理經(jīng)200 mg/kg EMS誘變的甘藍(lán)型油菜小孢子24 h，用NLN 13培養(yǎng)基進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，得到了一份油酸含量為80.3%的突變材料。

2.3.2物理誘變

物理誘變一般采用60Co照射。官春云等[8]用8萬～10萬倫琴60Coγ射線輻射湘油15號(hào)干種子，對(duì)輻射后代進(jìn)行連續(xù)選擇。由于高油酸突變體FAD2基因中DNA分子中發(fā)生鳥嘌呤轉(zhuǎn)換為腺嘌呤，經(jīng)過幾個(gè)世代才能完成，因此直到M5多數(shù)植株油酸含量在70%以上，最高油酸含量達(dá)93.5%。

此外，西南大學(xué)利用航天誘變方法也獲得了油酸含量為87.22%的甘藍(lán)型油菜突變體[30]。

2.4基因工程方法

在植物體內(nèi)，Δ12-油酰脫飽和酶FAD2是油酸合成與積累的重要調(diào)控位點(diǎn)[31]。目前常用反義表達(dá)和RNA干擾(RNA interference，RNAi)等[32]方法對(duì)其進(jìn)行調(diào)控，以獲得較高的油酸含量，尤其是RNA干擾技術(shù)，在擬南芥中證明了其作用后[33]，在油料作物脂肪酸組成改良方面獲得了突破性進(jìn)展[34]，相關(guān)研究見表2。

表2　利用基因工程技術(shù)獲得高油酸材料的研究進(jìn)展Table 2　The study advances of high oleic rapeseed materials obtained by gene engineering technology

(續(xù)表2)

方法實(shí)驗(yàn)材料獲得結(jié)果文獻(xiàn)油菜子葉柄內(nèi)獲得了轉(zhuǎn)基因植株[38]RNA干擾甘藍(lán)型油菜油酸含量達(dá)到89%[39]甘藍(lán)型油菜構(gòu)建了甘藍(lán)型油菜FAD2基因的ihpRNA表達(dá)載體,獲得轉(zhuǎn)基因植株,19個(gè)單株種子油酸含量大于75%,有11個(gè)單株種子油酸含量大于80%[40～42]甘藍(lán)型油菜油酸含量83.9%的無篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因油菜新種質(zhì),且這種新種質(zhì)未表現(xiàn)出高油酸突變體的一些不良農(nóng)藝性狀[43]低芥酸轉(zhuǎn)基因株系和甘藍(lán)型油菜FAE1基因和FAD2基因的協(xié)同干涉,獲得了高油酸(油酸含量75%)、低芥酸和低多不飽和脂肪酸的轉(zhuǎn)基因材料[44]甘藍(lán)型油菜油菜試管苗的帶柄子葉為外植體,得到9株抗PPT苗[45]構(gòu)建了甘藍(lán)型油菜FAD2、FAD3、FATB基因共干擾載體,轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜中雙9號(hào),2株油酸含量在75%以上[46]構(gòu)建了FAD2與FAE1基因雙干擾載體,獲得144株抗性再生植株[47]轉(zhuǎn)基因植株FFRP4-4油酸含量提高到85%,F1代種子油酸含量在80%以上,飽和脂肪酸10%,芥酸未檢出[48]

2.5分子標(biāo)記輔助選擇

利用與控制油酸含量的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)攜帶有高油酸基因的植株進(jìn)行早期選擇[25]，可以減少大田選擇的工作量，增加育種的選擇反應(yīng)和成本效益[49]。目前，已鑒定的油酸含量有RAPD(random amplified polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)、SNP (single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性)、SSR (Simple Sequence Repeats，簡單重復(fù)序列)和AFLP(amplified fragment length polymorphism，擴(kuò)增片段長度多態(tài)性)等標(biāo)記。

2.5.1RAPD標(biāo)記

Tanhuanp??等[50]在白菜型春油菜中發(fā)現(xiàn)8個(gè)RAPD標(biāo)記與油酸含量有關(guān)，其中最合適的標(biāo)記是OPH-17，這些標(biāo)記也位于LG6并與油酸位點(diǎn)相應(yīng)的FAD2基因連鎖。Sharma等[51]利用芥菜型油菜重組自交系發(fā)掘出7個(gè)與油酸含量顯著相關(guān)的RAPD標(biāo)記，其中3個(gè)標(biāo)記在連鎖群LG9上連鎖，另外各有2個(gè)標(biāo)記在連鎖群LG1和LG17上連鎖。將2個(gè)油酸含量QTL作圖在連鎖群LG9和LG1上，2個(gè)位點(diǎn)總共解釋32.2%的油酸含量變異，其中連鎖群LG9上的主要QTL解釋油酸含量變異的28.5%，定位于RAPD標(biāo)記OPF 081000和OPI 101000之間。Javidfar等[52]在甘藍(lán)型油菜中鑒定出6個(gè)相互獨(dú)立的油酸含量RAPD標(biāo)記，其中UBC2830可解釋43%的油酸含量遺傳變異。

2.5.2SNP標(biāo)記

Hu等[21]發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜FAD2突變基因中發(fā)生了單核苷酸變異，基于這一單核苷酸差異，開發(fā)了FAD2突變等位基因特異的SNP標(biāo)記并在連鎖群N5上作圖，該圖可解釋76.3%的油酸含量變異。Tanhuanp??等[22，53]開發(fā)了一個(gè)白菜型春油菜油酸含量相關(guān)的SNP標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)野生型和高油酸的FAD2基因位點(diǎn)只有一個(gè)核酸序列差異，導(dǎo)致一個(gè)氨基酸改變。SNP標(biāo)記對(duì)油酸含量選擇比SCAR標(biāo)記更為有效[52]，而且，采用PCR產(chǎn)物直接染色而不是電泳的方法可使等位基因特異檢測(cè)進(jìn)一步簡化。Falentin等[54]根據(jù)突變體和野生型等位基因的序列差異，開發(fā)兩個(gè)SNP標(biāo)記，分別對(duì)應(yīng)FAD2C基因和FAD2A基因的突變。Yang等[55]以SW Hickory(油酸含量大約為78%)×JA177(油酸含量64%)F1花蕾進(jìn)行小孢子培養(yǎng)獲得DH群體。QTL定位表明，控制油酸含量的主效QTL位于甘藍(lán)型油菜的A5連鎖群上，可解釋89%的表型變異。

2.5.3SSR標(biāo)記

王欣娜[56]以低油酸高亞麻酸10L421和高油酸低亞麻酸10L422親本雜交獲得的F2群體為材料，在A1、A5、Cl和C5連鎖群定位到油酸含量相關(guān)的標(biāo)記，其中A5和A1連鎖群上的標(biāo)記分別解釋18.6%和9.5%表型變異。劉列釗等[30]對(duì)航天誘變高油酸突變體材料系進(jìn)行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)A05和A01染色體上的FAD2位點(diǎn)發(fā)生雙隱性突變，兩位點(diǎn)對(duì)表型的遺傳變異貢獻(xiàn)率分別達(dá)到31.1%和29.4%，為主效位點(diǎn)。陳偉等[57]在SWHickory×JA177產(chǎn)生的SJDH群體的A5染色體上定位到1個(gè)控制油酸含量的主效QTL，可解釋油酸表型變異的85.3%；并利用該QTL兩側(cè)的SSR標(biāo)記BRMS007和BRGMS630進(jìn)行輔助育種，獲得了油酸含量高且遺傳背景基本恢復(fù)為JA177的改良單株。Zhao等[58]以德國冬油菜品種Sollux和中國高油材料構(gòu)建DH群體作圖，發(fā)現(xiàn)7個(gè)油酸含量相關(guān)的QTL，解釋59%的遺傳變異。Smooker等[59]的研究表明，SSR標(biāo)記比區(qū)間作圖法和多個(gè)QTL定位方法更有效。

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)用高油酸油菜品系HOP和甘藍(lán)型油菜湘油15號(hào)為父母本，在A5和C5連鎖群上各檢測(cè)到1個(gè)油酸含量主效QTL，這2個(gè)QTL能解釋60%～70%油酸含量變異，其中位于A5連鎖群的QTL效應(yīng)值較大，與FAD2基因緊密連鎖[60]；在N5連鎖群上標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)1個(gè)控制油酸的QTL，處于CNU398與CN53之間，LOD值為4.83，貢獻(xiàn)率達(dá)到59.37%[61]；構(gòu)建了導(dǎo)入A5、C5兩個(gè)油酸QTL及只分別導(dǎo)入一個(gè)油酸QTL的BC2F1株系，背景回復(fù)率達(dá)90%以上[62]。

2.5.4AFLP標(biāo)記

Lionneton等[63]篩選到2個(gè)油酸含量QTL，位于連鎖群LG2上E4M1_4處的QTL解釋51.8%的油酸含量變異，位于連鎖群LG6上E1M2_6處的QTL解釋9.5%的油酸含量變異。Schierholt等[12]對(duì)來自7488×DH11.4Samoutai后代進(jìn)行AFLP分子標(biāo)記研究，篩選到3個(gè)引物組合(E32M61、E38M62、E35M62)，在親本系及群體種子之間各表現(xiàn)為一個(gè)多態(tài)性帶。將這3個(gè)AFLP標(biāo)記(E32M61-141、E38M62-358、E35M62-256)用于F2群體作圖，發(fā)現(xiàn)它們與高油酸等位基因連鎖。最緊密連鎖的AFLP標(biāo)記E32M61-141距高油酸位點(diǎn)3.7 cM，可用于對(duì)高油酸性狀分子選擇的標(biāo)記。在Brassica基因組中fad2位點(diǎn)在A基因組第15個(gè)連鎖群上，在油菜LG15中的fad2位點(diǎn)是一個(gè)作用拷貝(圖1)。

2.5.5其它方法

此外還有利用TRAP(target region amplified polymorphism，利用靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性)[64]和RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性)[65]等方法對(duì)油酸含量進(jìn)行的標(biāo)記。

圖1　利用HO突變體群體構(gòu)建的遺傳連鎖圖(Schierholt A et al，2000)Fig.1　The genetic linkage map of HO mutation populations注：a)7488×DH 11.4 Samourai；b)19661×DH 11.4 Samourai；c)the corresponding LG15 of the mapping population DH 11.4 Samourai DH Mansholts Hamburger Raps of Uzunova et al.(1995) with integrated AFLP markers (Ecke et al.unpublished results)。

3　遺傳規(guī)律

油酸含量受硬脂酸和亞油酸含量影響。促進(jìn)油酸減飽和基因有兩個(gè)：FAD2基因(存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中)和FAD6基因(存在葉綠體中)[28](圖2)。油酸含量從60%到近90%不等的事實(shí)也說明高油酸性狀遺傳比較復(fù)雜。

圖2　脂肪酸生物合成示意圖Fig.2　The figure of fatty acid synthesis

近年來有大量高油酸遺傳特性方面的研究，如表3所示。

表3　高油酸遺傳特性研究Table 3　Study about the genetic characteristics of high oleic acid rapeseed

由表3可以看出，高油酸遺傳特性研究主要有3種觀點(diǎn)：多基因控制，多基因控制和受環(huán)境影響，單基因控制。多數(shù)研究認(rèn)為油酸遺傳特性由多基因控制。遺傳結(jié)果不盡相同，可能與試驗(yàn)材料的不同有關(guān)。

4　高油酸油菜研究

4.1產(chǎn)量與農(nóng)藝性狀

Hitz等[35]發(fā)現(xiàn)，高油酸突變體IMC129(油酸含量77.8%)農(nóng)藝性狀較好，但再次突變(油酸含量87%)后，植株農(nóng)藝性狀較差，可能是由于該突變體葉片和根系等器官中的油酸含量相應(yīng)提高，使其在較低溫度下種植時(shí)會(huì)出現(xiàn)明顯的生長發(fā)育障礙，也有可能是由于FAD2基因突變改變了葉片表面蠟的沉積結(jié)構(gòu)并增大了葉片表層的溶液滲透性[17]。

浙江省農(nóng)科院培育的“浙油80”生產(chǎn)試驗(yàn)比對(duì)照減產(chǎn)3.7%，產(chǎn)油量比對(duì)照增加0.4%，差異不顯著。周銀珠[75]和黃永娟等[23]研究認(rèn)為，高油酸性狀對(duì)油菜主要農(nóng)藝產(chǎn)量性狀沒有明顯的不利影響。本實(shí)驗(yàn)室的研究也發(fā)現(xiàn)，高油酸品系與普通油酸品系間產(chǎn)量差異未達(dá)到顯著水平[82，83]，且2014、2015年度的品比試驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)量與普通品種無明顯差異。

Guguin等[5]報(bào)道，HOLL雜交種產(chǎn)量比HOLL常規(guī)種高15%以上，最好的HOLL雜交種產(chǎn)量與當(dāng)家雙低雜交種非常接近。油菜種子油酸含量與種子產(chǎn)量是否呈負(fù)相關(guān)，目前還不是很清楚，但現(xiàn)在鑒定的有些品系(組合)產(chǎn)量降低并不明顯[28]，可通過育種的努力來補(bǔ)償產(chǎn)量的降低[68]。Antje等[84]發(fā)現(xiàn)，高油酸冬油菜(油酸含量大于75%)產(chǎn)量與葉子和種子中的油酸含量呈負(fù)相關(guān)，油酸含量高會(huì)延遲種子發(fā)芽。

4.2油酸與含油量及其它脂肪酸含量之間的關(guān)系

M?llers等認(rèn)為油酸含量和含油量呈正相關(guān)[68]，可提高0.6%的含油量[84]；Zhao等[58]也認(rèn)為脂肪酸組分與含油量之間有密切關(guān)系。但Smooker等[59]及本實(shí)驗(yàn)室的研究都認(rèn)為，高油酸油菜的油酸含量與含油量并無線性關(guān)系。因此，油酸含量與含油量之間的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

油酸含量與其它脂肪酸含量間關(guān)系的研究較多，但目前尚無一致結(jié)論。Zhao等[58]認(rèn)為油酸含量與芥酸、亞油酸含量和含油量負(fù)相關(guān)。閻星穎[76]發(fā)現(xiàn)油酸與其他脂肪酸呈極顯著負(fù)相關(guān)；尚國霞[80]發(fā)現(xiàn)硬脂酸與油酸含量呈正相關(guān)，棕櫚酸與油酸含量呈負(fù)相關(guān)，與亞油酸、亞麻酸呈極顯著負(fù)相關(guān)；Guy等[85]發(fā)現(xiàn)芥酸含量對(duì)油酸含量有顯著影響。

4.3環(huán)境及栽培因素對(duì)高油酸性狀的影響

油酸是由一些主效基因控制的遺傳性狀(99%)[59]，種子中的油酸含量在不同環(huán)境下均能穩(wěn)定表達(dá)[86，87]，高油酸性狀表達(dá)是穩(wěn)定的[72]，同時(shí)還受到環(huán)境及栽培因素影響。

4.3.1O3對(duì)油酸含量的影響

Karine等[88]研究了對(duì)流層O3升高對(duì)春油菜(甘藍(lán)型油菜品種)的影響，在一個(gè)開頂式氣室進(jìn)行了3年試驗(yàn)。在整個(gè)生長季節(jié)，每天有8 h，O3濃度比環(huán)境濃度增加20和40 ppb。結(jié)果顯示：O3濃度對(duì)春油菜種子質(zhì)量特性有影響，其中油酸含量顯著降低。本實(shí)驗(yàn)室研究也發(fā)現(xiàn)低溫處理會(huì)導(dǎo)致油酸減飽和反應(yīng)的活性降低。

4.3.2栽培措施對(duì)油酸含量的影響

Baux等[89]發(fā)現(xiàn)，HOLL冬油菜品種產(chǎn)量低于常規(guī)品種，但與品比試驗(yàn)預(yù)期值接近，農(nóng)民采用適當(dāng)?shù)脑耘喙芾泶胧?duì)決定油菜最終品質(zhì)起到關(guān)鍵性作用。

本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，氮肥施用量與油酸含量負(fù)相關(guān)；在一定范圍內(nèi)，施用磷肥、鉀肥有利于油菜油酸含量的提高，過量則降低油酸含量；硫肥施用量與油酸含量正相關(guān)[90]。

4.4生物學(xué)機(jī)制研究

4.4.1FAD2基因相關(guān)研究

FAD2基因是油酸合成的關(guān)鍵基因，提高油酸含量可通過降低油酸脫氫酶FAD2的活性來獲得[35]。FAD2基因是功能保守的基因，各物種之間的序列具有較高的相似性[73]。

梁會(huì)娟等[91，92]構(gòu)建了油菜FAD2基因的RNAi植物表達(dá)載體。Yang等[55]在高油酸親本SW Hickory中BnaA.FAD2.a(LG A5)拷貝發(fā)現(xiàn)一個(gè)4 bp的插入，該突變?cè)斐砷_放閱讀框的移碼，最終導(dǎo)致提前終止密碼子，屬于一種新的高油酸等位基因。BnaA.FAD2.a基因在脂肪酸合成最為旺盛的種子發(fā)育中后期(14～25 d)表達(dá)量急劇上升，為營養(yǎng)生長時(shí)期的7～20倍。Suresha等[93]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AD2基因表達(dá)量與早期的開花后15 d和晚期的開花后45 d種子發(fā)育階段相比，開花后30 d表達(dá)量上升。低溫處理下表達(dá)量提高1倍以上，而較高溫度處理上升3倍以上。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，油菜授粉后25～40 d為油酸形成期[94]；利用近等基因系材料授粉后25 d種子構(gòu)建了SSH文庫，得到480個(gè)克隆，其中88個(gè)基因?yàn)橛退岷康纳险{(diào)基因，18個(gè)為下調(diào)基因，大部分基因與代謝和調(diào)控相關(guān)[95]；構(gòu)建了授粉后25 d種子的均一化文庫，滴度為2.61×106cfu/mL，重組率100%，插入片段長度在800～2000 bp[96]；從甘藍(lán)型油菜中克隆了fad2基因一段2374 bp的上游序列，并用5-RACE技術(shù)確定了fad2基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，通過啟動(dòng)子分析以及順式作用元件分析，確定fad2基因的基本啟動(dòng)子在-220～-1 bp區(qū)域，還發(fā)現(xiàn)fad2基因啟動(dòng)子序列中含有一段1254 bp的內(nèi)含子，該內(nèi)含子序列中包含多個(gè)種子特異性表達(dá)特異性元件和植物激素響應(yīng)元件，F(xiàn)AD2基因受脫落酸調(diào)控，在-538～-544 bp處的脫落酸響應(yīng)元件使fad2基因在脫落酸的處理下提高了表達(dá)水平[97]；克隆了1個(gè)FAD2拷貝基因，定位到C1染色體上，命名為BnFAD2-C1，其開放閱讀框?yàn)?155 bp。采用RACE技術(shù)獲得了175 bp的5′ UTR序列和212 bp的3′ UTR序列。采用熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BnFAD2-C1在根、花和角果皮中僅保持本底水平的表達(dá)，在種子發(fā)育中期呈現(xiàn)高效表達(dá)，具有種子特異性誘導(dǎo)表達(dá)的特征，茉莉酸可能在BnFAD2-C1基因的表達(dá)過程中發(fā)揮一定的調(diào)控作用[98]。

此外，陳松等[99]發(fā)現(xiàn)，W-4的T2代單株的基因組含有一個(gè)T-DNA拷貝，T-DNA左邊界序列完全整合到油菜基因組中，僅有1個(gè)堿基由G轉(zhuǎn)換成了A，而右邊界則缺失了包括RB border在內(nèi)的62個(gè)堿基。陳松等[100]還比較了轉(zhuǎn)基因高油酸油菜品系W-4的T5、T6和T7種子以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ誛estar種子中的脂肪酸組成，結(jié)果表明油菜種子中FAD2基因下調(diào)表達(dá)對(duì)種子的脂肪酸合成與積累影響較大，其不僅顯著降低種子中多不飽和脂肪酸含量，增加油酸的含量；而且也顯著降低飽和脂肪酸含量，并促進(jìn)長鏈單烯酸的合成。

4.4.2FAD2基因拷貝數(shù)的研究

FAD2基因以多拷貝形式存在，不同拷貝之間在堿基序列和氨基酸序列上存在一定差異[66]。多拷貝現(xiàn)象對(duì)分子育種有不利影響，如在轉(zhuǎn)基因植物中，插入外源基因的拷貝數(shù)過多，則會(huì)導(dǎo)致表達(dá)不穩(wěn)定甚至轉(zhuǎn)基因沉默現(xiàn)象[101，102]。相關(guān)研究如表4所示。

表4　油菜FAD2基因拷貝數(shù)的研究Table 4　Study about the number of fad2 gene copies of rapeseed

由表4可知，目前多認(rèn)為油菜FAD2基因?yàn)槎嗫截?，但具體的拷貝數(shù)仍需進(jìn)一步研究。

4.4.3基因芯片方面研究

本實(shí)驗(yàn)室采用基因芯片技術(shù)檢測(cè)到差異表達(dá)基因562個(gè)，上調(diào)表達(dá)基因194個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因368個(gè)，以基因芯片中油菜上調(diào)基因NM_100489和下調(diào)基因NM_130183為材料，用實(shí)時(shí)熒光定量方法驗(yàn)證基因芯片的結(jié)果，二者完全相符。丙酮酸激酶、果糖二磷酸、?；鶄鬟f/酰基ACP硫脂酶、作用于酯鍵的水解酶、Δ9硬脂酰-乙酰載體蛋白去飽和酶(ADS1)、Δ9?；?油脂減飽和酶2(ADS2)、ω-3脂肪酸減飽和酶(FAD3)等被鑒定為差異表達(dá)基因。硬脂酸(18∶0)減飽和形成油酸的FAD1基因在表達(dá)時(shí)明顯上調(diào)，可能在油酸合成中也發(fā)揮重要作用[106]。采用超表達(dá)方法研究發(fā)現(xiàn)，SAD(FAD1)和FAD3基因?qū)τ退嵝纬煞e累確有一定影響。

4.4.4蛋白質(zhì)組學(xué)方面研究

本實(shí)驗(yàn)室還以湘油15號(hào)品種(對(duì)照)和高油酸油菜7 d幼苗為材料提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行雙向電泳分析，共發(fā)現(xiàn)277個(gè)差異點(diǎn)，126個(gè)點(diǎn)的差異在2～4倍之間，對(duì)其中50個(gè)點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF/TOF 4800串聯(lián)質(zhì)譜分析，42個(gè)差異點(diǎn)鑒定成功，分別為磷酸核酮糖羧化酶(23個(gè))及其前體蛋白(4個(gè))、黑芥子酶(2個(gè))、ATP合酶亞基蛋白(4個(gè))、葉綠體a/b結(jié)合蛋白(2個(gè))及其它蛋白(7個(gè))，并對(duì)差異蛋白對(duì)應(yīng)的基因(15個(gè))進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，有4個(gè)基因的表達(dá)量在高油酸油菜幼苗中增加，3個(gè)降低[107]；以一組高油酸油菜近等基因系自交授粉后20～35 d的種子為材料，分別進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組和同位素相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量技術(shù)分析，結(jié)合前人研究發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)或蛋白表達(dá)發(fā)生顯著變化的基因gi|260505503(多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白)、gi|226346102(HSR203J類蛋白)和gi|470103214(鈣調(diào)蛋白類)與抗病相關(guān)；而gi|297843222(結(jié)合蛋白)、gi|18397961(2-鐵，2-硫-鐵氧化還原類蛋白)、gi|196052306(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞基)、gi|18423437(還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶(輔酶)1α-復(fù)形5)和gi|297794581(激酶家族蛋白)等基因?yàn)椴町愶@著[108]。

5　高油酸油菜研究中的主要問題

5.1高油酸油菜育種研究進(jìn)展緩慢

國內(nèi)外雙低油菜從育成到實(shí)現(xiàn)雙低化均為10多年時(shí)間，而自1995年世界上第一個(gè)高油酸品種[11]問世至今，國外有報(bào)道的品種不足10個(gè)，國內(nèi)目前也僅有一個(gè)新品種，進(jìn)展較為緩慢。主要原因：①品種適應(yīng)性、增產(chǎn)潛力還在進(jìn)一步研究。②企業(yè)新產(chǎn)品的推出和廣大市民對(duì)高油酸菜油認(rèn)識(shí)的提高還需一定時(shí)間。③宣傳不夠。今后應(yīng)從發(fā)展高油酸油菜有利于保障我國食用油安全，提高國民健康水平和企業(yè)產(chǎn)品提質(zhì)等方面進(jìn)行宣傳。

5.2高油酸遺傳改良途徑有待進(jìn)一步拓寬

目前培育高油酸油菜主要采用化學(xué)誘變方法，但也有研究表明，輻射[8]或太空誘變[30]方法也可得到性狀穩(wěn)定的高油酸油菜材料，這為誘變育種提供了新的思路。分子標(biāo)記育種方法有RAPD標(biāo)記、SNP標(biāo)記、SSR標(biāo)記和AFLP標(biāo)記等。SNP標(biāo)記被稱為第三代DNA分子標(biāo)記技術(shù)，有望成為最重要、最有效的分子標(biāo)記技術(shù)，在分子育種中廣泛應(yīng)用。

5.3油菜高油酸生物學(xué)機(jī)理研究需進(jìn)一步加強(qiáng)

目前多數(shù)研究認(rèn)為，油菜高油酸性狀遺傳主要受基因型影響，為多個(gè)基因控制，甘藍(lán)型油菜控制油酸性狀的主效基因位于A5連鎖群。但劉列釗等[30]在A5、C5連鎖群上都發(fā)現(xiàn)了主效基因，可能是由于育種材料不同引起的。因此在今后的研究中也要綜合考慮不同的材料。此外，高油酸遺傳性狀還受環(huán)境和栽培措施影響等方面的研究都還需進(jìn)一步加強(qiáng)。

此外，油酸合成的關(guān)鍵基因的研究多集中在FAD2基因。FAD2基因?yàn)槎嗫截?，有一些拷貝是無功能的假基因，但具體拷貝數(shù)的多少及各個(gè)拷貝的功能仍需要進(jìn)一步研究。

油脂的積累和脂肪酸的合成是一個(gè)龐大的網(wǎng)絡(luò)，F(xiàn)AD2基因表達(dá)機(jī)理與很多因素有關(guān)，所以在繼續(xù)探索FAD2基因的調(diào)控表達(dá)作用機(jī)理的同時(shí)，還要進(jìn)一步研究十六碳烯酸、二十碳烯酸含量及芥酸含量對(duì)油酸含量積累的影響作用。

6　建議

(1)加快品種培育進(jìn)程。要綜合利用各種育種方法及分子標(biāo)記技術(shù)，同時(shí)結(jié)合一些早期鑒定的方法輔助育種，加快育種進(jìn)程。

(2)弄清油酸合成的分子機(jī)理。深入研究FAD2基因?qū)τ退岷铣傻恼{(diào)控作用，包括其拷貝數(shù)及每個(gè)拷貝的功能等；同時(shí)搞清其它脂肪酸合成對(duì)油酸的影響。

(3)利用各種新技術(shù)進(jìn)行新基因發(fā)掘。充分利用即將完成的油菜基因組測(cè)序結(jié)果，采用基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)新技術(shù)，研究基因表達(dá)譜變化情況，結(jié)合生物信息學(xué)分析，發(fā)掘出FAD2以外影響油酸合成的新基因。

(4)加快推廣開發(fā)進(jìn)程。種子管理部門要高度重視高油酸油菜發(fā)展，充分認(rèn)識(shí)到高油酸油菜是油菜產(chǎn)業(yè)繼雙低油菜后的又一次新機(jī)遇；加大對(duì)高油酸油菜材料在區(qū)試等方面的支持力度，加快新品種的培育和審定及后續(xù)推廣。

(5)堅(jiān)持優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)原則，提高農(nóng)民種植積極性。在生產(chǎn)實(shí)踐中，依照優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)原則，適當(dāng)提高高油酸油菜籽的收購價(jià)格，增加農(nóng)民種植效益，提高其生產(chǎn)積極性，迅速擴(kuò)大高油酸油菜種植面積，促進(jìn)油菜產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展，提高我國食用油自給水平。

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Present Research Situation，Questions and Developmental Advises of High Oleic Acid Rapeseed

ZHANG Zhenqian，HU Qingyi，GUAN Chunyun*

(College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China)

High oleic acid rapeseed oil has very good nutrition and health functions，and its quality can be comparable with the camellia oil，olive oil and other senior edible vegetable oil，which is helpful to increase the edible vegetable oil supply of China and promote the upgrading of the rape industry.The study trend and application situation of Hunan Agricultural University and the other domestic and foreign research institutions were summarized in this paper.At the same time，the genetic characteristics of oleic acid，high oleic acid rapeseed breeding (microspore culture，distant hybridization，induced and transgenic technology)，advances of high oleic acid rapeseed breeding by different methods (such as，microspore culture，distant hybridization，mutation and transgenic technology)，and the molecular biology research were summarized.In addition，several advices were proposed according to the currently existing questions.

rapeseed；high oleic acid；genetic；breeding

2016-01-20

張振乾(1977-)，男，博士，副教授，Email：zzq770204@163.com。*通信作者：官春云，教授，博士生導(dǎo)師，從事油菜育種、栽培研究。

國家自然科學(xué)基金(31201240)；國家863計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA101107-3)；湖南省科技重大專項(xiàng)(2014FJ1006)；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物學(xué)開放基金(ZWKF201502)。

S565.403.2

A

1001-5280(2016)04-0462-13

10.16848/j.cnki.issn.1001-5280.2016.04.27