劉芳瑛，陸　贏，王　卓，劉顯軍，胡學(xué)芳，劉旭東，徐海鵬，劉忠松

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所，長沙 410128)

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芥菜型油菜A9染色體BAC物理圖譜構(gòu)建及比較基因組分析

劉芳瑛，陸贏，王卓，劉顯軍，胡學(xué)芳，劉旭東，徐海鵬，劉忠松*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物研究所，長沙 410128)

為獲得高精確度的芥菜型油菜A9染色體物理圖，本研究利用定位在A9染色體上的標(biāo)記對芥菜型油菜BAC文庫進行三維混合PCR篩選，共得到陽性BAC 3200個；構(gòu)建了由16個重疊群、5個單拷貝組成的芥菜型油菜A9染色體物理圖譜。根據(jù)最小路徑原則挑選代表整個物理圖的種子BAC 435個，并進行雙末端測序，得到質(zhì)量良好的序列862條；按照BAC平均插入片段為126 kb，可知所有重疊群累積達52.08 M，覆蓋A9染色體的1.37倍。利用BLAST軟件(按參數(shù)值E<1e-10)將種子BAC末端序列比對到白菜和甘藍型油菜A9染色體假分子上，結(jié)果顯示該物理圖譜分別覆蓋了36.4、31.0 Mb的物理距離，相當(dāng)于全基因組組裝長度的93.9%、91.8%；在862條BESs中，分別有702條(81.40%)定位在白菜A9染色體上，646條(74.9%)定位在甘藍型油菜A9染色體上，表明芥菜型油菜A9染色體同白菜A9染色體同源性高于甘藍型油菜A9染色體；芥菜型油菜A9染色體同甘藍型油菜A9染色體，相對白菜A9染色體6413031～7827177、14856710～18458808的位置發(fā)生了兩處相同的分別長為1.4、3.6 Mb的倒位，白菜和芥菜型油菜A9染色體相對于甘藍型油菜15676847～16064302的區(qū)域存在長為0.98 Mb的插入片段，該區(qū)域位于前述的倒位區(qū)域，而且與預(yù)測但未組裝出的甘藍型油菜著絲粒位置一致。

芥菜型油菜；A9染色體；物理圖譜；比較基因組

芥菜型油菜屬于十字花科蕓薹屬中芥菜的油用類型，是由白菜和黑芥通過雜交和染色體自然加倍形成的異源四倍體(AABB，n=2x=18，1068 Mb)[1]。在其進化過程中經(jīng)歷了多次全基因組倍增事件(α，β，γ，bU復(fù)制事件)[2，3]，產(chǎn)生了大量重復(fù)序列。多倍性和重復(fù)序列使基因組增大且更復(fù)雜，從而增加了測序成本，降低了測序的準(zhǔn)確性[4]。目前，獲得基因組序列主要有兩種方法[5]：全基因組鳥槍法測序策略(WGS)和基于物理圖的克隆連克隆測序策略(CBCS)。新一代測序技術(shù)以高通量、時間少、低成本[6]受到科學(xué)家們的關(guān)注和青睞，但其產(chǎn)生的大量短序列不僅加大組裝過程中計算機的運行量，而且對測序錯誤率敏感，在基因組重復(fù)區(qū)甚至出現(xiàn)組裝錯誤或序列丟失的現(xiàn)象[7]。CBCS選擇能覆蓋整個基因組的最低數(shù)目BAC進行測序，一個克隆長約126 kb，可以跨越重復(fù)區(qū)，從而減少空隙(GAP)數(shù)，提高了組裝質(zhì)量。完整、高質(zhì)量的基因組參考序列是進行基因預(yù)測、基因組功能注釋、進化及比較基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)，而克隆連克隆測序策略是獲得精細基因組序列的前提[8，9]。 BAC重疊群的構(gòu)建主要有酶切指紋分析、分子標(biāo)記篩選、BAC末端測序[10]等方法。酶切指紋分析利用HICF[11](高信息量酶切指紋技術(shù))根據(jù)相同的指紋圖譜確定BAC之間的重疊關(guān)系，再通過指紋重疊群(FPC)或線性拓撲重疊群(LTC)兩種軟件修飾[12]組裝成重疊群。該方法可用于未知基因組測序。分子標(biāo)記法包括核酸雜交[13]和PCR篩選[14]。兩者都需要參考已知序列設(shè)計探針或引物對BAC文庫進行篩選確定陽性克隆之間的重疊關(guān)系。該方法可以實現(xiàn)遺傳圖譜和物理圖譜的整合。BAC末端測序則通過把末端序列與已知近緣生物基因組比對，從而把BAC錨定到染色體上[15]，重疊群側(cè)翼的BAC末端序列還可以用來設(shè)計探針或引物進行染色體步移篩選，填補重疊群之間的空隙。完整的物理圖譜往往需要幾種方法綜合使用才能完成。 在蕓薹屬植物A、B、C三個基因組中，A、C基因組高度同源[16]，其中A9染色體與C8、C9染色體部分同源[17]。根據(jù)已測序的白菜[18]和甘藍型油菜[19]基因組數(shù)據(jù)顯示，在A基因組的10條染色體中，A9染色體最長，白菜A9染色體組裝長度為38.8 Mb，而甘藍型油菜A9染色體組裝長度為33.8 Mb，另有4.1 Mb序列組裝方向未知、不均勻地分布在甘藍型油菜A9染色體上。A9染色體是易于發(fā)生重排的染色體，著絲粒區(qū)域是易于發(fā)生重排的地方[20]。Cheng等[21]根據(jù)著絲粒特異序列認為白菜A9染色體的著絲粒位于10.4～11.3 Mb的位置，而在19.0～19.1 Mb也存在失活的著絲粒痕跡。Mason等[22]采用半四分體(half-tetrad)分析方法，認為甘藍型油菜A9染色體的著絲粒位于15.6～15.9 Mb的區(qū)域，對應(yīng)白菜A9染色體14.8～15.4 Mb的區(qū)域。A9染色體攜帶許多控制重要性狀的基因如種子大小、種皮顏色、油脂合成、硫苷合成[23～26]等相關(guān)的基因，因而構(gòu)建A9染色體物理圖不僅具有理論意義，更具實用價值。

本研究利用定位在A9染色體的標(biāo)記對構(gòu)建的ZBjuH BAC文庫，進行三維混合PCR 步移篩選，構(gòu)建A9染色體BAC物理圖譜，依據(jù)最小瓦片路徑(Minimal Tiling Path，MTP)原則，挑取盡可能覆蓋全基因組的BAC作為種子BAC，進行雙末端測序，將測序成功的BES與已測序的白菜和甘藍型油菜A9染色體序列進行BLAST，分析蕓薹屬植物A9染色體的結(jié)構(gòu)變異。

1　材料與方法

1.1芥菜型油菜BAC文庫的構(gòu)建

提取芥菜型油菜作圖群體親本紫葉芥S8自交系葉片總DNA，構(gòu)建芥菜型油菜紫葉芥BAC文庫(187個384孔板)。構(gòu)建步驟參照文獻[27]操作，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)羅美中教授實驗室協(xié)助完成。

1.2BAC質(zhì)粒池的混池方法

BAC質(zhì)粒DNA的提取參照《分子克隆實驗指南》(薩姆布魯克等，2005)進行。為簡化PCR篩選過程，本實驗室構(gòu)建了3個水平的BAC質(zhì)粒DNA池(一級池、二級池和三級池)。一級池：由每相鄰10塊384孔板的BAC克隆質(zhì)粒DNA混和成一管，共19管。二級池：由每塊384孔板的BAC克隆質(zhì)粒DNA混和成一管，共187管。三級池分為橫向三級池和縱向三級池。橫向三級池由一個384孔板中的每相鄰2行共48個BAC克隆質(zhì)粒DNA(如002號平板的002-A/B、002-C/D、……、002-O/P)混和而成，共187×8管；縱向三級池由384孔板中的連續(xù)2列共32個BAC克隆質(zhì)粒DNA，(如004號平板的002-1/2、002-3/4、……、002-23/24)混合而成，共187×12管。在所構(gòu)建的一級池、二級池、橫向三級池、縱向三級池中都包含了整個BAC文庫。

1.3引物的設(shè)計

共設(shè)計了引物1728對，其中參考白菜基因組[18]序列設(shè)計STS引物311對，參考芥菜型油菜四川黃籽種皮的非冗余轉(zhuǎn)錄本(unigene)序列設(shè)計STS引物107對，參考芥菜型油菜Survey序列設(shè)計STS引物126對，利用BAC末端序列設(shè)計引物1184對。引物設(shè)計采用Primer premier 3或Primer premier 5軟件。設(shè)計引物時設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)為：產(chǎn)物大小200～500 bp，引物長度控制在20～23個堿基，正反引物Tm值60℃左右，GC含量盡量大于50%。

1.4BAC單克隆的篩選

(1)用程序降落PCR篩選BAC文庫。95℃預(yù)變性5 min；94℃預(yù)變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，3個循環(huán)；94℃預(yù)變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，3個循環(huán)；94℃預(yù)變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，28個循環(huán)；72℃延伸10 min，22℃保存。退火溫度根據(jù)引物進行適當(dāng)調(diào)整。

(2)BAC文庫篩選步驟。對19個一級池進行篩選，確定陽性克隆位于哪組相鄰的10塊384孔板中；篩選陽性一級池包含的所有二級池，確定陽性克隆位于哪塊384孔板中；篩選陽性二級池對應(yīng)的橫向和縱向三級池，把陽性克隆定位于384孔板中橫向和縱向交叉所包含的4個單克隆；對4個單克隆進行篩選，得到單個陽性克隆。PCR產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5BAC末端測序和序列分析

BAC末端序列由上海生物工程技術(shù)公司采用Sanger方法進行測序，測序引物為M13R和S2。利用chromas軟件分析BES測序峰圖以判斷測序質(zhì)量，利用BLASTN程序與BRAD、NCBI上白菜、甘藍型油菜基因組數(shù)據(jù)等進行序列比對分析，利用比對聯(lián)配長度和E值等數(shù)據(jù)初步排除假陽性BAC，推斷BAC在染色體序列假分子上的大概位置，并設(shè)計末端引物用于驗證和延伸。 挑選被最多標(biāo)記篩選到、代表整個物理圖譜的BAC作為種子BAC，利用BLAST軟件將種子BAC的兩個BES分別比對到甘藍型油菜和白菜A9染色體假分子上(E<1e-10)，對芥菜型油菜A9染色體BAC物理圖譜與白菜、甘藍型油菜A9染色體進行共線性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1芥菜型油菜A9染色體物理圖

利用PCR方法進行染色體步移篩選，得到陽性BAC共3200個，將其中2070個BAC進行末端測序，獲得BAC末端序列(BES)3410條，構(gòu)建了由16個重疊群、5個單拷貝(BAC數(shù)低于5個)組成的芥菜型油菜A9染色體物理圖譜。按照最小瓦片路徑原則挑選了代表整個物理圖的種子BAC 435個，并送往生工進行末端測序，共獲得862條BES用于序列比對分析(表1)。按照每個BAC的平均插入片段為126 kb估算，所有重疊群累積共52.08 M，芥菜型油菜A9約為38 Mb，可知該物理圖譜覆蓋A9染色體的1.37倍，因此估計每個BAC延伸長度約為87.6 kb。其中最長的重疊群包含62個BACs，長約5.4 Mb，覆蓋A9染色體的14.3%。N50值(達到總長度一半時，最小的contig長度)為2.8 Mb，包含32個BACs。Contig包含的BACs越多表明組裝越準(zhǔn)確。排除BAC數(shù)小于5的5個單拷貝，重疊群的平均覆蓋長度約為1.68 Mb。

表1　芥菜型油菜A9染色體物理圖及比對到白菜、甘藍型A9染色體的區(qū)域Table 1　BAC physical map of Aj9 and positions mapped to Ar9、An9

注：Ar9表示白菜A9染色體，Aj9表示芥菜型油菜A9染色體，An9表示甘藍型油菜A9染色體。BAC數(shù)少于5個的被定義為單拷貝。N表示未比對到A9上，—表示錨定到A9上的區(qū)域長度未知。

2.2蕓薹屬植物A9染色體結(jié)構(gòu)比較

甘藍型油菜和芥菜型油菜的A基因組都來源于白菜[1]，但它們的基因組組成不同，前者為AACC，后者為AABB。A、C基因組親緣關(guān)系近，但與B基因組親緣關(guān)系遠[16]。有研究表明，種間雜種的基因型會影響減數(shù)分裂時的染色體配對聯(lián)會及以后的交換重組[28]。不同的基因組遺傳背景下，芥菜型油菜和甘藍型油菜是否發(fā)生同樣的結(jié)構(gòu)變化有待研究。本研究利用芥菜型油菜A9染色體的種子BAC末端序列，與白菜和甘藍型油菜的假分子序列進行比較，研究A9染色體在進化過程中的結(jié)構(gòu)變異。

2.2.1A9染色體宏觀共線性比較

將種子BES與白菜scaffold序列[18]進行比對，芥菜型油菜A9物理圖對應(yīng)白菜基因組上50個scaffold。Li等[29]利用蕓薹屬60 K Infinium SNP芯片對472份甘藍型油菜種質(zhì)進行關(guān)聯(lián)分析，對甘藍型油菜各染色體序列支架的排列和方向也進行了整理。將3種油菜A9染色體結(jié)構(gòu)進行比較(圖1，封三)可知：相較于白菜，同是異源四倍體的芥菜型油菜和甘藍型油菜A9染色體上錨定了之前白菜沒有進行定位的多個序列支架，如BraScf178、BraScf321、BraScf17_front、BraScf344、BraScf185；芥菜型油菜和甘藍型油菜又有其特異的支架，芥菜型油菜包含特異的BraScf960、BraScf70、BraScf282、BraScf460、BraScf496及插入BraScf006內(nèi)的BraScf174，甘藍型油菜包含特異的BraScf311、BraScf103、BraSc120、BraSc106，白菜包含特異的BraScf393；BraScf481在甘藍型油菜中未找到，在芥菜型油菜中發(fā)生轉(zhuǎn)座；芥菜型油菜中BraScf159和BraScf113的位置與白菜一致，與甘藍型油菜發(fā)生顛倒；BraScf66～BraScf134與甘藍型油菜一致，與白菜發(fā)生顛倒。

2.2.2A9染色體微觀共線性比較

用BLAST將862條種子BAC末端序列(BES)定位到白菜和甘藍型油菜A9染色體假分子上，分別覆蓋了36.4、31.0 Mb的區(qū)域，分別占假分子組裝長度的93.9%、91.8%。在這862條BESs中，分別有702條(81.40%)定位在白菜A9染色體上、646條(74.9%)定位在甘藍型油菜A9染色體上，表明芥菜型油菜A9染色體與白菜A9染色體的同源性高于甘藍型油菜A9染色體。甘藍型油菜基因組測序時，75個總長33.8 Mb的scaffolds通過遺傳標(biāo)記定向錨定在A9染色體上，另有163個總長4.1 Mb的scaffolds不能通過遺傳標(biāo)記定向錨定到A9染色體因而被歸為“chrA9_random”；“chrA9_random”上的scaffolds不均勻地分布在甘藍型油菜A9染色體上[19]。上述646條定位到甘藍型油菜A9染色體的BES中，591條比對在A9染色體上，55條定位在 “chrA9_random”上(圖2紅色區(qū)域，封三)；在未定位到甘藍型油菜A9上的224條BESs中，有47條BESs定位在“chrAnn_random”上(圖2中綠色區(qū)域，封三)。與白菜A9染色體假分子[18]相比，BAC重疊群中，075M22R ～159A17L對應(yīng)白菜A9染色體6413031～7827177區(qū)域有約1.4 Mb大小的倒位，對應(yīng)白菜scaffold57的末端。185J13L ～176B07R之間對應(yīng)白菜A9染色體14888415 ～18347321區(qū)域有約3.6 Mb倒位，對應(yīng)白菜scaffold134～scaffold66。而與甘藍型油菜A9染色體假分子[19]相比，BAC重疊群中，094O07R～108C15L之間的BES均比對到chrAnn_random上，對應(yīng)甘藍型油菜15676847～15769286的區(qū)域，該區(qū)域與預(yù)測的甘藍型油菜著絲粒位置一致。因而，推測該缺失區(qū)域很可能是由于著絲粒區(qū)域序列高度重復(fù)或缺乏可利用的遺傳標(biāo)記而無法組裝到A9染色體上造成的。

3　討論

3.1BAC物理圖譜構(gòu)建中的問題

本研究使用A9特異性標(biāo)記及BAC末端序列標(biāo)記步移篩選法，構(gòu)建了芥菜型油菜A9染色體BAC物理圖譜。在物理圖譜的構(gòu)建過程中，BAC文庫的篩選是最關(guān)鍵也是最耗時的步驟，三級DNA池的逐步篩選法大量減少了文庫篩選過程，而且每個陽性克隆都經(jīng)過了4次驗證，結(jié)果可靠。但是，文庫篩選過程中由于基因組中的重復(fù)序列仍存在假陽性現(xiàn)象，因而在引物設(shè)計過程中可以與白菜或甘藍型油菜A9假分子序列比對，使引物唯一比對在預(yù)測目的區(qū)域。另外可以增加引物長度、提高退火溫度、采用PCR產(chǎn)物驗證等方法減少假陽性出現(xiàn)的概率。目前所構(gòu)建的芥菜型油菜A9染色體物理圖仍然存在一些空隙，且多對應(yīng)白菜scaffold的末端。scaffold的末端一般是因為位于重復(fù)序列而無法將相鄰scaffold連接起來。 因此空隙存在的地方很可能是重復(fù)區(qū)域，但也可能是由于HindIII內(nèi)切酶的偏好型，導(dǎo)致某些區(qū)域難以形成126 kb左右的片段，而導(dǎo)致BAC文庫中沒有代表該區(qū)域的陽性克隆。因此，在BAC文庫構(gòu)建過程中通常需要采用多酶切的方法。

3.2蕓薹屬植物A9染色體比較分析

通過芥菜型油菜種子BAC末端序列與白菜、甘藍型油菜基因組序列比對，發(fā)現(xiàn)芥菜型油菜和甘藍型油菜A9染色體在異源四倍體的形成過程中發(fā)生了兩處相同的染色體倒位。預(yù)測的甘藍型油菜A9染色體著絲?？缭狡渲幸惶幍刮?，同Parkin等[20]認為的A9染色體是易于發(fā)生重排的染色體，著絲粒是易于發(fā)生重排的區(qū)域結(jié)論一致。芥菜型油菜A9染色體物理圖和白菜基因組包含了預(yù)測的甘藍型油菜著絲粒區(qū)域，表明針對大而復(fù)雜基因組測序時，基于物理圖的克隆連克隆測序策略優(yōu)于全基因組鳥槍法測序策略。芥菜型油菜A9染色體與白菜A9染色體的同源性高于甘藍型油菜A9染色體。甘藍型油菜全基因組序列顯示A、C亞基因組之間，特別是A1與C1，A2與C2，A9與C9之間的同源交換非常頻繁[19]，因此推測這有可能是因為甘藍型油菜在進化過程中，A基因組與高度同源的C基因組之間的同源重組使甘藍型油菜A9產(chǎn)生了異于白菜和芥菜型油菜的變異，也可能是甘藍型油菜組裝時，遺傳標(biāo)記數(shù)目有限導(dǎo)致scaffolds無法特異定位在A9上。

4　結(jié)論

本研究構(gòu)建了由16個重疊群、5個單拷貝組成的芥菜型油菜A9染色體物理圖，選擇其中435個BAC作為A9染色體測序的候選克隆，通過BAC末端序列與Ar9、An9假分子比對，發(fā)現(xiàn)Aj9與Ar9同源性高于An9；Aj9同An9，相對Ar9發(fā)生了兩處相同的分別長為1.4、3.6 Mb的倒位；Aj9物理圖覆蓋了An9未組裝出的著絲粒區(qū)域。

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Construction of BAC Physical Map on Chromosome A9 in Brassica juncea and Comparative Genome Analysis

LIU Fangying，LU Ying，WANG Zhuo，LIU Xianjun，HU Xuefang，LIU Xudong，XU Haipeng，LIU Zhongsong*

(Oil Crops Research Institute，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China)

To abtain a precise physical map ofBrassicajunceachromosome A9，the markers located on the A9 chromosome were used in this study to screenBrassicajunceaBAC library by three-dimensional mixed PCR screening.A total of 3200 positive BAC were screened out；constructing a physical map composed of 16 contigs and 4 singletons.According to the principle of the minimum path，435 BACs were chosen as seed BACs to represent the whole physical map and were subject to end sequencing，at last，862 qualified sequences were received.As the average insert size of BAC is 126 kb，the contigs accounted up to 52.08 M，covering 1.37 times of chromosome A9.By BLAST，the seed BAC end sequences were mapped to chromosome A9 pseudomolecule ofBrassicarapaandBrassicanapusrespectively，results showed that the physical map covered 36.4 Mb and 31.0 Mb，equivalent to 93.9%、91.8% of the whole genome assemble length.Among the 862 BAC end sequences，702 sequences (81.4%) were located onBrassicarapaA9 chromosome and 646 sequences(74.9%)toBrassicanapusA9 chromosome，which meansBrassicajunceaA9 chromosome have higher homology withBrassicarapaA9 chromosome thanBrassicanapusA9 chromosome.Compared withBrassicanapusA9 pseudomolecule and BAC end sequence ofBrassicajunceaA9 chromosome，there are two chromosome inversions about 1.4 Mb、3.6 Mb in length at the position of 6413031-7827177 and 14856710-18458808 inBrassicarapaA9.While compared with BAC end sequence ofBrassicajunceaA9，there is a inserted mutation about 0.98 Mb in length at the position of 15676847-16064302 ofBrassicanapusA9 pseudomolecule，which lie in one of the two chromosome inversions and was consist with the predicted position of centromere ofBrassicanapusA9 chromosome remained to assembled.

Brassicajuncea；chromosome A9；physical map；compare genomics

2016-03-07

劉芳瑛(1991-)，女，碩士研究生，Email：365698105@qq.com。*通信作者：劉忠松，博士，教授，Email：zsliu48@sohu.com。

國家自然科學(xué)基金(30971799)。

S565.403.2

A

1001-5280(2016)04-0347-07

10.16848/j.cnki.issn.1001-5280.2016.04.01