劉雪輝張　思張志旭康信聰李　堅(jiān)謝紅旗,3,4劉東波,3,4

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙　410128；2. 國(guó)家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙　410128；3. 湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙　410128；4. 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙　410128)

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大孔吸附樹脂純化薄荷總黃酮工藝優(yōu)選

劉雪輝1,2張思1,2張志旭1,2康信聰1,2李堅(jiān)2謝紅旗1,2,3,4劉東波1,2,3,4

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410128；2. 國(guó)家中醫(yī)藥管理局亞健康干預(yù)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410128；3. 湖南省作物種質(zhì)創(chuàng)新與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410128；4. 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙410128)

以吸附—解吸率和總黃酮含量為考察指標(biāo)，采用靜態(tài)和動(dòng)態(tài)吸附兩種方法，進(jìn)行大孔吸附樹脂純化薄荷總黃酮工藝優(yōu)選。試驗(yàn)考察ADS-7、ADS-17、NKA-9、AB-8、D101、HPD-100 六種大孔吸附樹脂對(duì)薄荷總黃酮的純化能力。結(jié)果表明：AB-8對(duì)薄荷總黃酮吸附與分離性能最佳，確定純化薄荷總黃酮的最佳工藝條件為：流速1 mL/min，上樣液中薄荷總黃酮質(zhì)量濃度為2.56 mg/mL，上樣量3 BV，解析液為4 BV 30%乙醇，最終得到含量90.35%的薄荷總黃酮。上述工藝對(duì)薄荷總黃酮的分離高效、穩(wěn)定、可靠，為薄荷資源的綜合利用提供理論依據(jù)。

薄荷；黃酮；分離；吸附；解析

薄荷(MenthahaplocalyxBrip．)又稱“銀丹草”、“魚香草”，為唇形科(Lamiaceae)薄荷屬(GenusMentha)多年生藥食兩用草本植物[1]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，薄荷含有機(jī)酸、黃酮、揮發(fā)油、萜類等化學(xué)成分，對(duì)消化、呼吸、神經(jīng)中樞等生理系統(tǒng)的藥理作用顯著[2]，其中的黃酮類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗菌[3]、抗氧化[4-5]及抗腫瘤[6]能力，故被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)[7-8]。薄荷總黃酮顯著的生理活性催生了極大的市場(chǎng)需求，也對(duì)其產(chǎn)業(yè)化研究提出了更高的要求。傳統(tǒng)的硅膠柱分離以及溶劑萃取方式存在有機(jī)溶劑用量大、溶劑殘留等缺點(diǎn)，而制備色譜、高速逆流等分離方法也受到有機(jī)溶劑殘留以及無(wú)法大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等弊端的限制[9-10]，而現(xiàn)有的關(guān)于薄荷總黃酮產(chǎn)業(yè)化分離純化方面的研究不多。鐘昆芮等[11]采用聚酰胺樹脂分離純化了薄荷總黃酮，其方法雖然操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，但所得薄荷總黃酮純度僅達(dá)50%，在分離效果效率以及經(jīng)濟(jì)成本等方面稍有不足，無(wú)法滿足其后續(xù)針對(duì)性的藥理藥效研究和市場(chǎng)推廣的需求，制約了薄荷資源的綜合開發(fā)利用。 大孔吸附樹脂是一種可重復(fù)利用的新型分離材料，具有對(duì)目標(biāo)組分針對(duì)性吸附能力強(qiáng)、分離方法簡(jiǎn)單、高效，溶劑無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，常用于藥用植物中活性化合物的分離[12]，本研究擬通過(guò)對(duì)不同極性的樹脂進(jìn)行篩查，并結(jié)合工廠大生產(chǎn)設(shè)備條件，對(duì)薄荷總黃酮純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在探索出綠色、高效、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)的適用于產(chǎn)業(yè)化大生產(chǎn)的工藝路線。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

薄荷干燥莖葉：北京同仁堂藥材公司；

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：含量>98%，中國(guó)藥品生物制品檢定所；

ADS-7樹脂、ADS-17樹脂、NKA-9樹脂、AB-8樹脂、D101樹脂、HPD-100樹脂：滄州寶恩吸附材料科技有限公司；

氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、硝酸鋁：分析純，國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2主要儀器設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-1800型，島津儀器(蘇州)有限公司；

電子分析天平：Mettler Toledo XS205型，上海梅特勒—托利多儀器有限公司；

恒溫培養(yǎng)震蕩器：ZHWY-2102C型，上海合恒儀器設(shè)備有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52型，上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1上樣液制備稱取薄荷干燥莖葉500 g，加入60%乙醇置80 ℃恒溫水浴鍋中回流提取1.0 h，料液比分別為1∶10和1∶8(g/mL)提取2次，合并提取液，60 ℃真空濃縮回收乙醇至無(wú)醇味，加水分散溶解，定容至2 000 mL，采用亞硝酸鈉—硝酸鋁—?dú)溲趸c顯色法測(cè)定提取液中黃酮含量[13]，作為上樣液備用。

1.3.2靜態(tài)吸附與解析試驗(yàn)準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的ADS-7、ADS-17、NKA-9、AB-8、D101、HPD-100樹脂各1.0 g，裝入50 mL錐形瓶中，分別加入上樣液25 mL，置恒溫振蕩搖床上(溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速100 r/min)振蕩吸附，每隔1 h吸取上層清液1 mL進(jìn)行黃酮含量測(cè)定，按式(1)計(jì)算吸附量，優(yōu)選出最佳吸附樹脂。

(1)

式中：

X——吸附量，mg/g；

a——上樣液中總黃酮濃度，mg/mL；

b——吸附后溶液中總黃酮濃度，mg/mL；

v——上樣液體積，mL；

m——樹脂質(zhì)量，g。

將充分吸附薄荷總黃酮的大孔樹脂過(guò)濾后分別加入25 mL 80%乙醇，置恒溫振蕩搖床上(溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速100 r/min)振蕩解吸24 h，充分解吸后取1 mL上層清液測(cè)定總黃酮含量，按式(2)、(3)計(jì)算解吸量和解吸率，并綜合吸附率與解析率優(yōu)選出最佳樹脂型號(hào)進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)。

(2)

(3)

式中：

a——上樣液中總黃酮濃度，mg/mL；

b——吸附后溶液中總黃酮濃度，mg/mL；

Y——解吸量，mg/g；

Z——解吸率，%；

c——解吸液中總黃酮濃度，mg/mL；

V——解吸液體積，mL；

1.3.3上樣液濃度及上樣量的篩選準(zhǔn)確量取已預(yù)處理好的AB-8型大孔吸附樹脂各30 mL濕法裝柱，取一系列質(zhì)量濃度(1.53，1.92，2.56，3.84 mg/mL)的上樣液分別上柱，以流出液中黃酮濃度達(dá)到上樣液中黃酮濃度的10%作為泄漏點(diǎn)，測(cè)定不同上樣濃度下樹脂的飽和吸附量，從而優(yōu)先出最佳上樣濃度及上樣量。

1.3.4洗脫溶劑的篩選按上述確定的最佳吸附條件進(jìn)行上樣，先水洗至流出液無(wú)色，然后依次用10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%的乙醇各1 BV進(jìn)行解析，流速1 mL/min，分別收集各段解析液進(jìn)行黃酮含量檢測(cè)，繪制洗脫曲線并優(yōu)選出最佳洗脫溶劑。

1.3.5洗脫量的篩選選用上述確定好的洗脫溶劑，流速1 mL/min，分別用1，2，3，4，5，6 BV的溶劑進(jìn)行解析，計(jì)算解析量，并繪制解析曲線并優(yōu)選出最佳解析體積。

2　結(jié)果與分析

2.1不同樹脂對(duì)薄荷黃酮的靜態(tài)吸附量與解析率

ADS-7、ADS-17、NKA-9、AB-8、D101、HPD-100 六種吸附材料對(duì)薄荷黃酮的靜態(tài)吸附量與解析量見(jiàn)表1，ADS-7樹脂對(duì)薄荷黃酮的吸附量最大，AB-8樹脂次之，但在靜態(tài)解析試驗(yàn)中，AB-8樹脂的解析率最高，達(dá)到63.57%，具有較好的吸附解析效果，而同樣條件下ADS-7樹脂對(duì)薄荷黃酮的死吸附較多以致解析率只有15.8%，推測(cè)可能是薄荷黃酮類化合物極性較強(qiáng)，根據(jù)“相似相吸引”原則，ADS-7樹脂作為強(qiáng)極性樹脂，與薄荷黃酮極性相似度較高，具有較強(qiáng)的吸附效應(yīng)，從而形成了死吸附。而AB-8樹脂相對(duì)極性較弱，在針對(duì)薄荷黃酮類化合物時(shí)能夠達(dá)到一種較佳的吸附—解析效應(yīng)，因此綜合吸附量與解析率兩個(gè)因素，最終選擇AB-8樹脂作為薄荷總黃酮的純化填料。

2.2不同上樣液濃度下樹脂對(duì)薄荷總黃酮的吸附量

將薄荷提取濃縮液稀釋至黃酮含量分別為3.84，2.56，1.92，1.53 mg/mL，以泄露點(diǎn)為終點(diǎn)進(jìn)行最大吸附量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。當(dāng)薄荷黃酮濃度為2.56 mg/mL時(shí)，樹脂對(duì)薄荷總黃酮的吸附量最大，隨著濃度的減少，吸附量逐漸降低，而濃度增大也會(huì)導(dǎo)致泄露點(diǎn)提前而吸附量減少，且樹脂容易堵塞。因此選擇濃度為2.56 mg/mL的上樣液進(jìn)行上柱試驗(yàn)。

表1不同樹脂對(duì)薄荷黃酮的靜態(tài)吸附量與解析率

Table 1Static adsorption capacities and desorption rates of total flavonoids inMenthahaplocalyxby various macroporous adsorption resins

樹脂名稱極性吸附量/mg解析量/mg解析率%ADS-7強(qiáng)極性67.6210.6815.80ADS-17中極性41.8419.4746.54NKA-9極性 47.3024.3651.53AB-8弱極性48.5830.8863.57D101非極性47.2625.0352.96HPD-100非極性48.0328.4559.22

圖1　不同上樣液濃度下樹脂對(duì)薄荷總黃酮的吸附量

2.3上樣量的確定

按上述確定好的上樣濃度進(jìn)行上柱，分別接收各段上樣流出液，檢測(cè)其中黃酮含量，見(jiàn)圖2，當(dāng)上樣量達(dá)到3 BV時(shí)，流出液中薄荷總黃酮濃度達(dá)到上樣液濃度的10%，并且泄露量逐漸增大，參考前人[14]研究結(jié)果并綜合薄荷原料價(jià)格、薄荷總黃酮產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)成本、品價(jià)格等經(jīng)濟(jì)因素，最終選擇上樣體積為3 BV。

2.4不同濃度的乙醇對(duì)薄荷總黃酮的解析率

如圖3所示，隨著醇濃度的增大，洗脫液中薄荷總黃酮的洗脫率也依次增大，當(dāng)洗脫劑醇濃度達(dá)30%時(shí)，洗脫率達(dá)到了60%，繼續(xù)增加乙醇濃度，洗脫率增加趨勢(shì)減緩，且部分醇溶性雜質(zhì)被洗脫下來(lái)而導(dǎo)致黃酮純度降低(圖4)。因此綜合經(jīng)濟(jì)、效率等因素最終選擇先用水洗除去多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再用體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇作為洗脫劑，并考慮通過(guò)增加洗脫量來(lái)提高洗脫率。

圖2　泄漏曲線

圖3　乙醇梯度洗脫曲線

圖4　乙醇梯度解析液中黃酮純度

2.5洗脫溶劑用量的篩選

選擇30%的乙醇作為洗脫溶劑，依次增加洗脫劑的用量，并分別接收每個(gè)BV的解析液，進(jìn)行黃酮含量檢測(cè)。由圖5可知，當(dāng)洗脫劑用量達(dá)到4 BV時(shí)，絕大部分黃酮已經(jīng)被洗脫下來(lái)，因此選擇4 BV的洗脫劑用量。

圖5　洗脫劑用量與洗脫率的關(guān)系

3　結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)靜態(tài)吸附及解吸試驗(yàn)進(jìn)行樹脂型號(hào)的篩選，確定AB-8型樹脂對(duì)薄荷總黃酮的吸附量較大且解析率最高，且AB-8樹脂再生工藝簡(jiǎn)單、重復(fù)利用批次可達(dá)數(shù)百次，因此選擇AB-8型樹脂做后續(xù)動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)并優(yōu)化其工藝參數(shù)，篩選出的最佳工藝條件為：上樣濃度2.56 mg/mL，上樣體積3 BV，水洗至流出液澄清透亮，再用4 BV 30%的乙醇

進(jìn)行洗脫，洗脫率為79.49%，將解析液濃縮冷凍干燥，測(cè)得干粉中黃酮含量為90.35%。本試驗(yàn)建立的AB-8型大孔吸附樹脂分離純化薄荷總黃酮的工藝，具有綠色環(huán)保、操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠、高效經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，適合大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

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Optimization of purification technology for total flavonoids from Mentha haplocalyx by macroporous resin

LIU Xue-hui1,2ZHANGSi1,2ZHANGZhi-xu1,2KANGXin-cong1,2LIJian2XIEHong-qi1,2,3,4LIUDong-bo1,2,3,4

(1.CollegeofHorticultureandLandscape,Hunanagriculturaluniversity,Changsha,Hunan410128,China; 2.StateKeyLaboratoryofSubhealthInterventionTechnology,Changsha,Hunan410128,China; 3.HunanProvincialKeyLaboratoryofCropGermplasmInnovationandUtilization,Changsha,Hunan410128,China; 4.NationalresearchCenterofEngineeringTechnologyForUtilizationofFunctionalIngredientsFromBotanicals,Changsha,Hunan410128,China)

Based on the adsorption-desorption rate and the content of total flavonoids, static and dynamic adsorption methods were adopted to evaluate the purification ability of 6 macroporous resins, including ADS-7, ADS-17, NKA-9, AB-8, D101, and HPD-100, for purifying total flavonoids from ofMenthahaplocalyx. The results showed that AB-8 was adsorbed best among all the candidates. The optimum purification condition was as follows. The flow rate was 1 mL/min, and the loading volume of sample was 3 BV containing flavonoids 2.56 mg/mL in it, desorbed by 4 BV 30% ethanol. Finally, 90.35% total flavonoids fromMenthahaplocalyxwere obtained. The method above is characteristic of high separation efficiency, convenient operation and reliable stability. This study could provide theory support for the comprehensive utilization ofMenthahaplocalyx.

Menthahaplocalyx; flavonoids; separation; adsorp-tion; desorption

國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目(編號(hào)：2013DFA31790)

劉雪輝，女，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。

劉東波(1970-)，男，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，博士。

E-mail：chinasaga@163.com

2015—10—22

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.038