?

9種市售阿膠蛋白質特性比較分析

CHANG Bing-yu1CHENMao-shen1HAOXiang-hui2,3GUOShang-wei2,3MAJian-guo1ZHONGFang1

(1.SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China;2.Dong’eE-jiaoCo.,LTD,Liaocheng,Shandong252201,China;3.NationalEngineeringResearchCenterforGelatineTCM,Liaocheng,Shandong252201,China)

對9種市售阿膠(E1～E9)進行蛋白質特性分析比較，包括氨基酸組成、等電點、二級結構和分子量分布。結果表明，9種市售阿膠的蛋白質等電點均在4.38～4.88，無明顯差異；圓二色譜表明所有樣品中蛋白質的三螺旋結構均被破壞，呈無規(guī)則卷曲狀態(tài)；氨基酸組成大致相似，而亞氨基酸(脯氨酸和羥脯氨酸)組成有一定差異，E2、E3、E4、E9的亞氨基酸含量較低，小于23.8%，其余5種樣品的含量較高，大于25.0%；蛋白質分子量分布有較大差異，E2、E4、E7、E8的阿膠蛋白質分布更分散，含有較多的高分子蛋白(占比>4.46%)，且主要蛋白質的重均分子量較大，為120～132 kD，而其余5種樣品的分子量分布較集中，高分子蛋白占比小于1.16%，且主要蛋白質的重均分子量較小，為36～42 kD。市售阿膠的蛋白質差異主要是蛋白質的降解程度不同造成的。阿膠差異化評價的蛋白質特性評價，為進一步考察工藝對蛋白質特性的影響提供依據。

阿膠；氨基酸；分子量分布；蛋白質特性

阿膠(Asini Corri Collas，ACC)與人參、鹿茸并稱“中藥三寶”，是中國傳統(tǒng)名貴中藥，有滋陰補血、潤燥止血的功效[1]。針對阿膠的藥理作用機制，研究人員作了很多研究。通過分析阿膠的主要成分發(fā)現(xiàn)其中含有豐富的氨基酸和微量元素[2]，為人體提供必要的營養(yǎng)物質；還有研究發(fā)現(xiàn)阿膠中含有較多的羧基、硫酸酯基、硫酸基等負電荷，可形成聚負離子基結構，電泳時偏向陽極[3]，每個分子可形成一個穩(wěn)定的大分子晶體結構，使其不必進入細胞內部，僅通過細胞外間質的代謝來調節(jié)細胞功能，參與生理與病理過程[4]。

阿膠的主要成分有蛋白質、氨基酸及微量元素，還有硫酸皮膚素等多糖類物質。其中，蛋白質類含量約為60%～85%，是阿膠的主要成分[5]。多肽和氨基酸主要是在制膠過程中膠原蛋白部分肽鍵斷裂所形成的一系列降解產物[6]。阿膠補血補益作用的物質基礎與阿膠中蛋白質類物質有密切關系，研究阿膠中蛋白質、多肽的特性和結構尤為重要。如今，對阿膠蛋白質的特性已有一定的研究，李峰等[7]對阿膠和其它動物膠進行了SDS-PAGE分析，得出了阿膠蛋白質各電泳譜帶的泳動率Rf值；陳振江等[8]采用IFE法測定出阿膠及其偽品中幾種主要蛋白質的等電點在4.15～4.80。這些研究多側重于真?zhèn)舞b別和阿膠與其它動物膠的對比，沒有對阿膠蛋白質的特性進行系統(tǒng)的研究，同時，尚未有對市售阿膠中蛋白質特性差異進行研究。

本研究從市場上收集了具有代表性的9種阿膠樣品，擬對其蛋白質特性如氨基酸組成、等電點、二級結構和分子量分布進行詳細的分析對比，從而揭示不同廠家所產阿膠的內在差別所在，對生產優(yōu)質阿膠有一定的指導意義，補充完善現(xiàn)有的阿膠評價中蛋白質特性評價部分，并為下一步研究加工工藝對蛋白質特性的影響提供依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

樣品E1～E9：9種市售某品牌阿膠；

牛血清白蛋白、疊氮化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等試劑均為分析純；

高效液相色譜儀：Agilent1260型，美國安捷倫公司；

多角度激光散射凝膠色譜儀：DAWN HELEOS Ⅱ型，美國懷雅特技術公司；

圓二色光譜儀：MOS-450型，法國Biologic公司；

Zeta電位及納米粒度分析儀：ZetaPALS型，美國布魯克海文儀器公司；

電子天平：AL204型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司。

1.2成分測定

(1) 水分含量：直接干燥法[9]。

(2) 蛋白質含量：凱氏定氮法[10]。

1.3阿膠蛋白質的提純

稱取適量阿膠于熱水中充分溶解，4 000 r/min離心10 min，加入預冷的無水乙醇至乙醇終濃度為75%，4 ℃保存1 h后，于4 ℃，5 000 r/min條件下冷凍離心15 min。去上清液，加入25 mL預冷的75%乙醇，4 ℃保存30 min，冷凍離心，去上清液，反復洗滌3次。沉淀物于通風櫥揮盡酒精味后，水洗至培養(yǎng)皿中，冷凍干燥得蛋白提純物[11]。提純后的阿膠蛋白中，蛋白含量均大于94%，糖含量均小于0.82%。該方法的蛋白提取率高于85.31%，糖去除率高于91.20%，提取出的蛋白可以代表阿膠中的主要蛋白。

1.4阿膠蛋白的氨基酸組成分析

精密稱取提純物放入水解管中，加入8 mL鹽酸溶液(6 mol/L)和2滴辛醇，將水解管抽真空密封，于110 ℃烘箱中水解21 h。取出冷卻后定容至25 mL，過濾。吸取1 mL濾液放入燒杯中，置于含有氫氧化鈉的干燥器中50 ℃保溫過夜。加入1 mL鹽酸溶液(0.02 mol/L)，混勻，離心，將上清液轉移至樣品瓶中待測[12]。

采用OPA-PMOC柱前衍生化分析方法。色譜條件：色譜柱250 mm×4.6 mm，5 μm；柱溫：40 ℃；流動相：A相，稱取8.0 g結晶乙酸鈉于1 000 mL燒杯中，加入1 000 mL開水攪拌至所有結晶溶解，再加225 μL三乙胺，攪拌并加5%的醋酸，調pH 7.2，加入5 mL四氫呋喃，混合后備用；B相，稱取8.0 g 結晶乙酸鈉于800 mL燒杯中，加入400 mL開水攪拌至所有結晶溶解，滴加2%的醋酸，pH調至7.2，將此溶液加入800 mL乙腈和800 mL甲醇備用；流速：1.0 mL/min；紫外檢測器：262 nm(脯氨酸和羥脯氨酸)，338 nm(其余氨基酸)；梯度洗脫[13]。

1.5阿膠蛋白的等電點分析

阿膠蛋白質等電點的測定根據Nalinanon等[14]的方法修改如下：稱取提純物加水溶解后配制成0.4 mg/mL溶液，用0.02 mol/L的NaOH和HCl調節(jié)pH，每隔0.5個pH取樣，測定其Zeta電位。

1.6阿膠蛋白的二級結構分析

采用圓二色光譜儀對樣品進行圓二色譜分析。稱取提純物加水溶解后配制成1 mg/mL的溶液，4 000 r/min離心5 min，取上清液供試。樣品吸收池光程為0.01 cm，譜帶寬度：1 nm；測定范圍：180～300 nm；掃描波長間隔：0.1 nm；每點響應時間：1 s；每個供試品重復測定3次；測定溫度：室溫。

1.7阿膠蛋白的分子量分析

采用多角度激光光散射凝膠色譜系統(tǒng)(HPSEC-RI-MALLS)測定阿膠蛋白質分子量分布。流動相采用含0.15 mol/L 氯化鈉的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0,含0.02%疊氮化鈉)；流速為0.35 mL/min，紫外檢測器波長選用220 nm。用牛血清白蛋白(Mw=77 kDa)校準儀器。

稱取適量提純物粉溶解于流動相，配制成1 mg/mL的樣品溶液，過0.45 μm微孔濾膜后進行HPSEC-RI-MALLS分析。采用ASTRA軟件進行數(shù)據處理。dn/dc值取0.185[15]。

1.8數(shù)據分析

使用SPSS 19.0和Origin 8.5軟件進行數(shù)據分析，顯著性分析采用最小顯著差法(LSD)檢驗，P≤0.05認為差異顯著。

2　結果與分析

2.1阿膠蛋白質含量分析對比

阿膠的蛋白質含量可由氮含量乘以換算系數(shù)而計算出，驢皮的換算系數(shù)取5.55。市售阿膠的蛋白質含量見表1。9種阿膠的蛋白質含量在72.15%～89.44%，含量很高，與趙曦等[16]的研究結果類似。

2.2阿膠蛋白的氨基酸組成分析

對提取后的阿膠蛋白質的氨基酸組成進行分析，結果見表2。共檢測出阿膠蛋白質中含有17種氨基酸，含7種必需氨基酸。阿膠屬于膠原蛋白水解產物，不含色氨酸、半胱氨酸。所有樣品中，以甘氨酸含量最高，占總氨基酸含量的21.5%～22.5%，其次為谷氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸、丙氨酸和精氨酸，以上6種氨基酸為阿膠中主要氨基酸，占氨基酸總量的70%以上，與已有的報道[17]一致。分析對比9種阿膠蛋白質的氨基酸組成差異，可以發(fā)現(xiàn)大多數(shù)阿膠蛋白質的組成非常接近，但亞氨基酸(脯氨酸和羥脯氨酸)的組成有一定的差異。據報道[18]，亞氨基酸是膠原蛋白中起到穩(wěn)定三螺旋結構的重要氨基酸，而降解程度過大會導致亞氨基酸較多地釋放。因此，亞氨基酸含量較低的樣品可能與驢皮中膠原蛋白的降解程度有關。

表1　不同阿膠蛋白質含量

表2　不同阿膠氨基酸組成?

?每1 000個氨基酸殘基含有的氨基酸殘基數(shù)；亞氨基酸為脯氨酸和羥脯氨酸之和。

2.3阿膠蛋白的等電點分析

Zeta電位是描述膠粒表面電荷性質的一個物理量，它是距離膠粒表面一定距離處的電位。若膠粒表面帶有某種電荷，其表面就會吸附相反符號的電荷，構成雙電層[19]。在滑動面處產生的動電電位叫做Zeta電位。在溶液pH<等電點(pI)時，由于可電離氨基酸的增加，膠粒表現(xiàn)為帶正電荷；

圖1　阿膠蛋白溶液(E9)在不同pH下的Zeta電位

pH>pI時，膠粒表面所帶電荷為負；當pH=pI時，膠粒表面上的正電荷數(shù)與固定層吸附的負離子數(shù)相等，Zeta電位為零，可以求得此時溶液的pH值，即為溶液的pI。

阿膠蛋白溶液在不同pH下的Zeta電位曲線見圖1(以E9為例)，可以求得其Zeta電位為零時的pI值。各樣品的等電點值見表3。

表3　不同阿膠蛋白溶液的等電點

結果表明，所有樣品的pI在4.38～4.88。由于膠原蛋白的pI在4.8左右，水解的進行使酰胺鍵斷裂，羧基釋放，從而使阿膠的pI略微下降[20]。但是由于阿膠的制作工藝均是膠原蛋白的熱裂解，因此所有樣品的pI相差很小，僅相差0.5，與安廣杰等[21]的研究結果類似。

2.4阿膠蛋白的二級結構分析

圓二色譜(CD)通常被用來研究蛋白分子的空間構象。一般分為遠紫外區(qū)(190～250 nm)與近紫外區(qū)(250～500 nm)，遠紫外區(qū)反映的是主鏈構象，屬于肽鍵的吸收，常被用來表征蛋白的二級結構信息；而近紫外區(qū)則主要反映蛋白的三級結構信息[22]。

阿膠蛋白質的遠紫外區(qū)圓二色譜圖見圖2(以E1為例)，其余樣品的圓二色譜圖與E1相似，均在190 nm左右有一大的負峰，在220 nm左右處幾乎無峰或僅有微弱的小峰。天然膠原蛋白具有三螺旋結構，其圓二色譜特征是在190～200 nm左右有一個強的負吸收峰，在210～230 nm時有一個弱的正吸收峰。而所有阿膠蛋白樣品的圓二色譜圖在220 nm左右處幾乎無峰或僅有微弱的小峰。阿膠中蛋白質經過工藝中的化皮、熬煮處理，其三螺旋結構已被破壞或僅有極少量的三螺旋結構，表明市售阿膠中的蛋白質構象無差異，均呈現(xiàn)無規(guī)則卷曲的狀態(tài)。

2.5阿膠蛋白的分子量分布

各個樣品的分子量分布見圖3。由圖3可知，各個樣品的分子量分布曲線有較大差異，為方便對比樣品，將洗脫曲線分為三部分，分別為20～25 min高分子量區(qū)域，25～32 min中分子量區(qū)域和32～37 min低分子量區(qū)域，并用ASTRA軟件計算出各區(qū)域的重均分子量和所占比例，見表4。由圖3中各樣品的流出曲線可知，阿膠中的蛋白質分子量為連續(xù)分布，集中在中分子量區(qū)域(占比為82.37%～98.02%)，各樣品的重均分子量為37～132 kDa。各樣品的蛋白質重均分子量和分子量分布有較大差異。

圖2　阿膠蛋白質(E1)的圓二色譜圖

樣品名高分子量區(qū)域Mw/kD占比/%中分子量區(qū)域Mw/kD占比/%低分子量區(qū)域Mw/kD占比/%E121370.824296.08363.10E247055.1412882.376112.50E339420.253891.42468.32E442607.4513287.01895.54E532991.163787.502211.34E647720.493694.16295.35E730704.4612085.153310.39E841695.5613090.851733.59E978150.163698.02331.82

圖3　不同阿膠蛋白質分子量分布

由表4可以得出，各樣品的中分子量區(qū)域的重均分子量有較大差異，其中，E2、E4、E7、E8的重均分子量較大(為120～132 kDa)，其余樣品的重均分子量較小(為37～42 kDa)。

由圖3可以看出，各樣品的分子量分布有較大差異?？梢詫⑺袠悠贩譃?類，第一類為E1、E9，僅中分子量區(qū)域有一個較窄的大峰，表明這類樣品的蛋白質分子量分布很集中，集中在中分子量區(qū)域，占比達96%以上；第二類為E3、E5、E6，這類樣品的分子量分布曲線除了有一個中分子量區(qū)域的較窄大峰外，在低分子量區(qū)域還有一個小峰，其蛋白質在高分子量區(qū)域分布很少，在低分子量區(qū)域的分布較多(占比為5.35%～11.34%)；第三類為E8，分子量分布曲線為一個較寬的大峰，呈現(xiàn)出明顯的前沿峰，分子量分布較分散，蛋白質在高分子量區(qū)域有分布(占比為5.56%)；第四類為E2、E4、E7，這類樣品的分子量分布曲線除了有一個較寬的大峰之外，在小分子量區(qū)域還有一個小峰，分子量分布較分散，這類樣品在高分子量區(qū)域有少量分布(占比為4.46%～7.45%)，在低分子區(qū)域也有分布(占比為5.54%～12.50%)。

阿膠生產過程是膠原降解的過程，降解條件的強弱和時間長短直接影響了阿膠分子量分布[23]。降解不充分可能導致高分子量蛋白的殘留，而降解程度過大可能導致產生較多的低分子量蛋白。第二類樣品在大峰之后又出現(xiàn)一個小峰，存在少部分低分子量蛋白質，可能是降解程度較大導致的，第三類樣品呈現(xiàn)出前沿峰，存在大分子量蛋白質，可能是降解程度小導致的。第四類樣品有前沿峰，且在大峰后出現(xiàn)一個小峰，表明同時存在大分子量和低分子量蛋白，則可能是降解條件較為劇烈，產生了較多的低分子量蛋白，但作用時間又較短，使得大分子量蛋白質有一定的殘留。第一類樣品的分子量分布集中，可能與其降解條件適中有關。合適的降解程度是生產高質量阿膠的重要保證，降解驢皮的程度和條件是未來阿膠研究的重要方向。

3　結論

對市售的9種阿膠進行蛋白質特性分析。通過測定Zeta電位計算出阿膠蛋白的等電點，發(fā)現(xiàn)9種市售阿膠的蛋白質等電點無明顯差異。圓二色譜圖顯示9種阿膠蛋白的二級結構均呈現(xiàn)無規(guī)則卷曲狀態(tài)，在加工過程中蛋白質的三螺旋結構被破壞。氨基酸結果顯示，共檢測到17種氨基酸，其中15種氨基酸組成接近，而亞氨基酸(脯氨酸和羥脯氨酸)的組成上有一定的差異，這與加工過程中的過度降解有關。HPSEC-RI-MALLS結果表明，蛋白質分子量大小和分子量分布有較大差異，有4種阿膠的蛋白質分布較為分散，呈現(xiàn)出明顯的前沿峰，存在較多的高分子蛋白質，可能與降解不充分有關。因此，市售阿膠的蛋白質差異主要是驢皮中蛋白質降解程度的不同造成的。本研究補充完善了現(xiàn)有的阿膠差異化鑒別的蛋白質特性部分，可為進一步考察工藝條件對蛋白質降解程度的影響提供依據。

[1] 國家藥典委員會. 中國藥典: 一部[S]. 北京: 化學工業(yè)出版, 2010.

[2] 王京娥, 楊福安. 阿膠作用機理的研究[J]. 中醫(yī)藥學報, 1991(1): 43-46.

[3] 王龍, 張曉華, 吳祖道. 六種補膠的比較研究[J]. 中國中藥雜志, 1992, 17(1): 46.

[4] IVATT R. The biology of glycoproteins[M]. Philadephia: Plenum Press, 2013: 211.

[5] 劉更生. 阿膠與阿膠文化[C]// 王群. 第十二屆全國中醫(yī)藥文化學術研討會論文集. 廬山: 中醫(yī)藥文化, 2009: 50-51.

[6] 祁天壽, 劉丹卓. 阿膠近十年藥理研究進展[C]// 張柏禮. 第十一次全國中醫(yī)婦科學術大會論文集. 鄭州: 中醫(yī)雜志, 2011: 359-361.

[7] 李峰, 韓家珩. 阿膠的凝膠電泳鑒別[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 1999, 10(5): 346-347.

[8] 陳振江, 劉靜芬. 阿膠及其偽品的IFE研究[J]. 中成藥, 1998, 20(12): 31-32.

[9] 中華人民共和國衛(wèi)生部. GB/T 5009.3—2010 食品中水分含量的測定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2010.

[10] 中華人民共和國衛(wèi)生部. GB 5009.5—2010 食品中蛋白質的測定[S]. 北京: 中國標準出版社, 2010.

[11] 周國海, 張泳, 趙力超, 等. 蛹蟲草多糖提取純化工藝研究[J]. 食品與機械, 2014, 30(5): 220-224.

[12] 商文慧, 朱祉默, 孫世廣, 等. 海參體壁膠原纖維簡化制備方法及其特性分析[J]. 食品與機械, 2014, 30(5): 41-44.

[13] 李超. 犬糧誘食劑的制備及其應用效果評價[D]. 無錫: 江南大學, 2013: 26.

[14] NALINANON S, BENJAKUL S, KISHIMURA H, et al. Type I collagen from the skin of ornate threadfin bream (Nemipterus hexodon): Characteristics and effect of pepsin hydrolysis[J]. Food Chemistry, 2011, 125(2): 500-507.

[15] CORREDIG M, WICKER L. Changes in the molecular weight distribution of three commercial pectins after valve homogenization[J]. Food Hydrocolloids, 2001, 15(1): 17-23.

[16] 趙曦, 仲平. 30種商品阿膠的質量比較[J]. 中國藥學雜志, 2000, 35(10): 690-692.

[17] 霍光華. 阿膠氨基酸礦物成分分析與評價[J]. 氨基酸和生物資源, 1996, 18(4): 22-24.

[18] MOURAD Jridi, RIM Nasri, IMEN Lassoued, et al. Chemical and biophysical properties of gelatins extracted from the skin of octopus (Octopus vulgaris)[J]. LWT-Food Science and Technology, 2015, 60(2): 881-889.

[19] 沈鐘, 趙振國, 王果庭. 膠體與表面化學[M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 1991: 57.

[20] DE MORAES M C, CUNHA R L. Gelation property and water holding capacity of heat-treated collagen at different temperature and pH values[J]. Food Research International, 2013, 50(1): 213-223.

[21] 安廣杰, 胡加松, 王章存, 等. 雙酶法制備水解明膠[J]. 食品與機械, 2014, 30(1): 209-213.

[22] PELTON J T, MCLEAN L R. Spectroscopic methods for analysis of protein secondary structure[J]. Analytical Biochemistry, 2000, 277(2): 167-176.

[23] 張貴鋒, 劉濤, 王前. 阿膠生產工藝中膠原蛋白降解過程研究[J]. 中國中藥雜志, 2009, 34(10): 1 211-1 215.

Comparison and analysis of the protein characteristics in 9 kinds of commercial Asini Corii Collas

常冰玉1陳茂深1郝向慧2,3郭尚偉2,3麻建國1鐘芳1

(1. 江南大學食品學院，江蘇 無錫214122；2. 東阿阿膠股份有限公司，山東 聊城252201；3. 國家膠類中藥工程技術研究中心，山東 聊城252201)

The protein characteristics of 9 kinds of commercial Asini Corri Collas (ACC, E1—E9) were compared, including amino acid composition, pI, secondary structure and molecular weight distribution. The differences of pI were negligible and all samples showed a range of 4.38—4.88. Circular dichroism results indicated that only random coil configurations was observed of all ACC samples due to the damage of triple helix structures. The amino acid composition was similar other than some differences in imino acid (Pro and Hyp) composition. E2, E3, E4 and E9 showed lower imino acid content (<23.80%) than that of others (>25.0%). Significant differences in the molecular weight distribution were observed. E2, E4, E7 and E8 appeared to be in a wider distribution containing more high molecular weight (>4.46%) and the major MW fraction was located in the range of 120-132 kD. The other 5 samples, however, showed a narrower distribution (high molecular weight protein <1.16%) and the major MW fraction was located in the range of 36-42 kD. The difference in protein characteristics of commercial ACC attributed to the differences in degradation degree of protein. This study would improve the protein characteristics evaluation system of ACC and lay a foundation to further study the effect of processing on protein characteristics.

Asini Corri Collas; amino acid; molecular weight distribution; protein characteristics

常冰玉，女，江南大學在讀碩士研究生。

鐘芳(1972—)，女，江南大學教授，博士生導師。

E-mail：fzhong@jiangnan.edu.cn

2016-03-15

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.049