衛(wèi)　強 時雪風(fēng)

(安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽 合肥　230088)

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蔥蘭葉揮發(fā)油成分分析及其對鮮牛奶的抑菌作用

衛(wèi)強 時雪風(fēng)

(安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽 合肥230088)

采用水蒸氣蒸餾(SDE)和超臨界二氧化碳(SFE-CO2)提取葉中揮發(fā)油，以GC—MS檢測分析，考察揮發(fā)油在4 ℃、10 d內(nèi)對鮮牛奶致腐菌的抑菌效果。結(jié)果表明：兩者不同成分有39種，其中SDE揮發(fā)油中主要有甲基環(huán)己烷、二十八烷、間二甲苯、鄰苯二甲酸二丁酯；SFE-CO2揮發(fā)油主要有4-(4-乙基環(huán)己基)-1-戊基-環(huán)己烯、甲苯、鄰苯二甲酸二異辛酯、1-乙氧基戊烷、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚。兩者相同成分有16種，含量差異較大。SFE-CO2揮發(fā)油抑菌作用較強，MIC值范圍為0.031～0.125 mg/mL。SFE-CO2揮發(fā)油成分為濃郁香氣和更強的防腐效果提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：蔥蘭葉；揮發(fā)油；鮮牛奶；抑菌活性；SDE；SFE-CO2

鮮奶含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖[1]，營養(yǎng)成分豐富。但極易發(fā)生變質(zhì)、酸敗，如乳酸菌可分解乳糖使牛奶發(fā)酵[2]；胨化菌使牛奶發(fā)生非酸性凝固，產(chǎn)生腐敗氣味[2]；熒光假單胞菌產(chǎn)生脂肪酶分解乳脂而生成具有臭味的低級酮類[3]；產(chǎn)氣菌分解碳水化合物，產(chǎn)生二氧化碳、氫氣、乳酸和有機酸，發(fā)生產(chǎn)氣、酸性凝固現(xiàn)象[3]。目前，牛奶非法添加的化學(xué)防腐劑有不同程度的毒性或副作用，如苯甲酸可引起精子畸形[4]，對消化道內(nèi)微生物以及消化道pH有一定影響[5]，尼泊金酯類對雌性激素有影響[6]，并有試驗[3]表明其對男性睪丸存在危害。揮發(fā)油是多種小分子揮發(fā)性化合物的油狀物質(zhì)，其作為抑菌劑和防腐劑的作用已被證實，如肉桂精油可強烈抑制細菌、霉菌和酵母[7]，柑橘精油及其主要成分D-檸檬烯可抑制大腸桿菌、金葡菌、枯草芽孢桿菌、酵母、黑曲霉，應(yīng)用于橙汁防腐[8]。

蔥蘭(Zephyranthescandida(Lindl.)Herb.)是石蒜科蔥蘭屬植物，別名蔥蓮、玉簾、白花菖蒲蓮、韭菜蓮、肝風(fēng)草，原產(chǎn)南美[9]。由于蔥蘭色澤艷麗、花期長，近年來被廣泛用于城市園林綠化和觀賞植物，世界各國均有引種栽培[10]，在中國栽培廣泛。蔥蘭含有生物堿[11]、黃酮[12]、凝集素[13]、揮發(fā)油[14]等成分，藥理試驗[15]證明其生物堿成分對人上皮癌細胞、人表皮癌細胞、鼠淋巴腫瘤細胞P388-D1等有較強的抗腫瘤活性，揮發(fā)油成分具有清除DPPH和ABTS自由基作用[14]。傳統(tǒng)的SDE提取具有高溫，易引起揮發(fā)油成分氧化[16]。SFE-CO2萃取技術(shù)可實現(xiàn)常溫提取和保持熱敏性成分不被熱分解[17]，可有效富集芳香活性物質(zhì)，使揮發(fā)油更接近天然香韻[18]。蔥蘭葉中揮發(fā)油具有濃郁的香氣，其化學(xué)成分研究國內(nèi)外還未見報道。本研究擬運用SDE和SFE-CO2提取蔥蘭葉中揮發(fā)油，以氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(GC—MS)研究其成分，進一步比較兩種提取揮發(fā)油的成分和對鮮牛奶抑菌作用的差異，從該芳香植物中篩選天然活性成分，擴大在食品行業(yè)的應(yīng)用。

1　材料與方法

1.1材料和儀器

蔥蘭葉：于2014年5月采自安徽合肥大蜀山地區(qū)，標本存于安徽新華學(xué)院藥學(xué)院實驗室；

鮮牛奶：批號20151002，光明乳業(yè)有限公司；

粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、腐敗假單胞菌(Pseudomonadaceaeputrefaciens)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、產(chǎn)氣莢膜桿菌(Clostridiumperfringens)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)：中國菌種保藏中心；

溶菌酶：酶活力> 2萬U/mg，上海谷研實業(yè)有限公司；

所用試劑均為分析純；

超臨界萃取設(shè)備：HA221-50-01型，江蘇南通華安超臨界有限公司；

氣相色譜儀：Agilent 6890-5973N型，安捷倫科技(中國)有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1揮發(fā)油的提取精密稱取干燥粉碎后的蔥蘭葉200 g裝入料筒，等份，一份以水蒸氣蒸餾裝置提取，收集油水混合物，以無水硫酸鈉脫水，得揮發(fā)油，呈近無色，香味較淡；另一份放入超臨界萃取裝置萃取釜內(nèi)，設(shè)置萃取壓力45 MPa，萃取溫度20 ℃，萃取流量20 L/h，萃取1.5 h后，打開分離釜排料閥，收集萃取物。萃取物經(jīng)減壓蒸餾后分別以環(huán)己烷、乙醚萃取，氮氣吹去溶劑，得到揮發(fā)油，揮發(fā)油幾近無色，香氣濃郁。

1.2.2色譜條件HP-5 MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為高純氦，不分流，進樣量1 μL；程序升溫，柱起始溫度為40 ℃，保持1 min后以5 ℃/min升至200 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至300 ℃，保持至完成分析。電子轟擊能量60 eV，掃描范圍m/z25～550，離子源溫度220 ℃，接口溫度280 ℃，全離子掃描。

1.2.3對牛奶的抑菌試驗以溶菌酶為對照，制備溶菌酶、蔥蘭葉SDE、SFE-CO2揮發(fā)油肉膏平板培養(yǎng)基，濃度依次為2.000，1.000，0.500，0.250，0.125，0.062，0.031，0.016 mg/mL。在以上培養(yǎng)基上分別接種粘質(zhì)沙雷氏菌、金黃色葡萄球菌、腐敗假單胞菌、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、大腸桿菌、糞產(chǎn)堿桿菌、保加利亞乳桿菌，移入培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h，計算溶菌酶、蔥蘭葉SDE、SFE-CO2揮發(fā)油的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，選擇整體抑菌效果較好的揮發(fā)油組進行如下試驗。

取800 mL的鮮牛奶均分為8份，鮮牛奶組設(shè)為空白對照組，加入質(zhì)量濃度0.05%的溶菌酶鮮牛奶組設(shè)為陽性對照組，蔥蘭葉SDE和SFE-CO2揮發(fā)油均以10%吐溫-80溶液稀釋，分別按照質(zhì)量濃度0.02%，0.04%，0.06%加入鮮牛奶設(shè)為樣品組。采用平板菌落計數(shù)法(參照GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》)，分別按照一定的稀釋梯度稀釋，貯藏于冰箱4 ℃冷藏一定時間(0，2，4，6，8，10 d)，按式(1)計算菌落總數(shù)：

(1)

式中：

N——樣品中菌落數(shù)，CFU；

∑C——平板菌落數(shù)之和，個；

n1——低稀釋倍數(shù)平板個數(shù)，個。

n2——高稀釋倍數(shù)平板個數(shù)，個。

d——稀釋因子。

1.2.4數(shù)據(jù)處理通過面積歸一化法測定鑒定的化合物的相對含量，檢索為NIST2011數(shù)據(jù)庫。

2　結(jié)果與討論

2.1蔥蘭葉SDE、SFE-CO2揮發(fā)油化學(xué)成分

蔥蘭葉SDE、SFE-CO2揮發(fā)油化學(xué)成分測定結(jié)果見圖1和表1～3。

由表1可知，從蔥蘭葉SDE、SFE-CO2揮發(fā)油中共鑒定出55種化學(xué)成分，主要有烴類、酯類、苯類、醇類、醛類、酮類、酸類、醚類、雜環(huán)類等。其中從蔥蘭葉SDE 和SFE-CO2揮發(fā)油中共鑒定出37，34種揮發(fā)性成分，分別占總揮發(fā)性成分的74.16%，92.40%。由表2可知，SFE-CO2揮發(fā)油中醇類、烴類、苯類、醛類、酮類、酯類含量均高于SDE揮發(fā)油，且不含酸類、醚類、雜環(huán)化合物，說明兩者揮發(fā)油含量和種類差別較大。由表3可知，兩者揮發(fā)油的特征成分具有顯著差異，SDE和SFE-CO2揮發(fā)油中最高含量的化學(xué)成分分別是甲基環(huán)己烷(15.96%)、4-(4-乙基環(huán)己基)-1-戊基-環(huán)己烯(8.73%)。與文獻[14]蔥蘭花SDE揮發(fā)油成分相似。但花

圖1　蔥蘭葉中揮發(fā)油總離子流

Figure 1Total ion chromatogram of SDE and SFE-CO2volatile oil of leaf fromZephyranthescandida(Lindl.)herb.

表1蔥蘭葉SDE、SFE-CO2揮發(fā)油中化學(xué)成分

Table 1SDE and SFE-CO2volatile oils' chemical constituents of leaf fromZephyranthescandida(Lindl.)Herb.

種類保留時間/min化合物名稱相對含量/%SDESFE-CO2烷烴類 4.8341-乙氧基戊烷-6.365.077甲基環(huán)己烷15.96-17.153十二烷-0.4218.8852,6,10-三甲基十四烷0.300.3619.957十三烷-1.2921.9542,6,10-三甲基十二烷-0.7822.614十四烷-2.5225.467十五烷-2.8827.848十六烷0.152.9428.725氯代十八烷0.51-29.5752,6,10,15-四甲基十七烷1.172.9429.586十七烷1.14-30.5714-(4-乙基環(huán)己基)-1-戊基-環(huán)己烯-8.7332.406二十七烷1.322.5835.0313-乙基-5-(2-乙基丁基)-十八烷0.781.7136.281二十一烷3.45-40.974反式角鯊烯0.90-42.116二十八烷5.34-酯類5.364乙酸(6-庚烯-1-基)酯1.02-6.311醋酸正丁酯1.681.9831.843丁基鄰苯二甲酸十四酯2.04-32.601十六酸甲酯0.96-32.963鄰苯二甲酸二丁酯5.103.2132.979鄰苯二甲酸-丁基-8-甲基壬酯-4.8938.198鄰苯二甲酸二異辛酯4.747.17苯類5.045甲苯-8.257.443乙苯2.644.657.654間二甲苯5.25-8.255對二甲苯1.652.5810.1221-乙基-3-甲基苯0.30-10.2251-乙基-2-甲基苯0.18-11.0201,2,3-三甲苯0.150.2412.276鄰甲基苯乙烯-0.1220.3084-乙烯基-2-甲氧基苯酚3.665.9724.8982,4,6-三甲氧基甲苯0.81-25.6782,4-二叔丁基苯酚1.835.58醇類7.0203-己烯-1-醇-3.6313.851α-(1-庚烯基)-α-甲基苯甲醇-0.1225.8623,7,11-三甲基十二醇0.21-31.523葉綠醇2.401.7431.3182-十八烷氧基乙醇0.18-35.491(Z)-2-(9-十八碳烯基氧基)乙醇0.42-40.9742,2,4-三甲-3-(3,8,12,16-四甲基-十八烷基-3,7,11,15-四烯基)-環(huán)己醇0.90-

續(xù)表1

種類保留時間/min化合物名稱相對含量/%SDESFE-CO2醛類5.673辛醛-0.606.409糠醛-0.9612.590苯乙醛-0.2414.371壬醛-0.1522.880十二醛-0.9623.6814,6-二羥基-2,3-二甲基苯甲醛3.482.73酮類8.1142-甲基環(huán)戊酮-1.5029.1422-羥基-4,6-二甲氧基苯乙酮1.441.6230.4193,5,6,7,8,8α-六氫-4,8α-二甲基-6-(1-羥甲基乙烯基)-(1H)-萘-2-酮0.87-雜環(huán)27.0584α-乙酰氧基-5,5,8α-三甲基-八氫苯并[b]吡喃0.36-酸類32.7096-(1,1-二甲基乙基)-2,3-二氫-1,1-二甲基-1H-茚-4-乙酸0.51-醚類27.0364-羥基-3-叔丁基-苯甲醚0.36-

表2　SFE-CO2和SDE揮發(fā)油中不同成分的數(shù)目和含量對比

表3　兩類揮發(fā)油主要成分比較

以脂肪酸(22.05%)、萜類及其含氧衍生物(13.53%)、烷烴(13.19%)和醛(6.93%)為主，主要成分有棕櫚酸(12.12%)、亞油酸(9.67%)、二十三烷(7.57%)、庚醛( 5.90%)、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚(5.36%)、2，6-二叔丁基對甲酚(5.33%)等。花、葉揮發(fā)油共有成分有十五烷、十六烷、十七烷、二十一烷、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、糠醛、苯乙醛。

蔥蘭葉SDE、SFE-CO2揮發(fā)油中共同成分有16種，分別為：2,6,10-三甲基十四烷、十六烷、2,6,10,15-四甲基十七烷、二十七烷、3-乙基-5-(2-乙基丁基)-十八烷、醋酸正丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異辛酯、乙苯、對二甲苯、1,2,3-三甲苯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、葉綠醇、4,6-二羥基-2,3-二甲基苯甲醛、2-羥基-4,6-二甲氧基苯乙酮。相同成分中絕大多數(shù)成分以SFE-CO2揮發(fā)油中含量較高，蔥蘭葉SDE僅有鄰苯二甲酸二丁酯(5.10%)、葉綠醇(2.40%)、4,6-二羥基-2,3-二甲基苯甲醛(3.48%)含量偏高。

2.2對牛奶的抑菌作用

由表4可知，蔥蘭葉SFE-CO2揮發(fā)油對粘質(zhì)沙雷氏菌、金黃色葡萄球菌、腐敗假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、糞產(chǎn)堿桿菌、保加利亞乳桿菌有較強抑制力，其MIC值范圍為0.031～0.062 mg/mL，而蔥蘭葉SDE揮發(fā)油相對抑制力較弱，其MIC值范圍為0.062～2.000 mg/mL。由表5可知，與空白組對照，在4 ℃冰箱中放置0～10 d，隨著蔥蘭葉SDE和SFE-CO2揮發(fā)油添加濃度的提高，對鮮牛奶有明顯抑菌作用，而SFE-CO2揮發(fā)油組抑菌作用強于SDE揮發(fā)油組。溶菌酶對G+菌抑制作用較強，但對G-菌，包括一些主要的食源性病原體無效，在食品應(yīng)用上受到一定限制[19]。

表4蔥蘭葉SDE、SFE-CO2揮發(fā)油抗菌試驗的MIC值

Table 4　Antimicrobial MIC of SDE and SFE-CO2 essential oils from Zephyranthes candida(Lindl.)Herb. (n=3) mg/mL

表5蔥蘭葉SDE、SFE-CO2揮發(fā)油處理前后對鮮牛奶中微生物中菌落數(shù)的影響?

Table 5　Affect on the total count of microorganisms before and after milk processing with SDE and SFE-CO2 essential oils from Zephyranthes candida (Lindl.)Herb. CFU/mL

?放置4 ℃冰箱中。

3　結(jié)論

從蔥蘭葉SDE、SFE-CO2揮發(fā)油中共鑒定出55種化學(xué)成分，其中不同成分39種，分別占41.67%，44.40%；相同成分16種，分別占32.49%，48.00%。其不同成分類別差異明顯，其中SFE-CO2揮發(fā)油不含醚類、酸類和雜環(huán)成分；相同成分含量差異較大，多數(shù)以SFE-CO2揮發(fā)油含量較高。說明成分差異決定揮發(fā)油品質(zhì)，對其香型也產(chǎn)生決定性影響， SFE-CO2揮發(fā)油香氣濃郁的結(jié)果與其成分組成密切相關(guān)。另外，蔥蘭葉揮發(fā)油成分對鮮牛奶的抑菌作用結(jié)果顯示，SFE-CO2揮發(fā)油對引發(fā)牛奶變質(zhì)的粘質(zhì)沙雷氏菌等有較強抑制力，其MIC值范圍為0.031～0.125 mg/mL。研究[20-21]表明，多種酚類成分是抗菌的有效成分。酚羥基是起抗菌作用的主要官能團，鄰位甲氧基能提高抗菌活性，抗菌活性可能還與電性、疏水性和空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。SFE-CO2揮發(fā)油顯示較強的抗菌活性，可能與其含有較高的苯類成分有關(guān)(27.39%)。本試驗從揮發(fā)油成分與香氣和對鮮牛奶的抑菌作用的關(guān)系兩個方面說明SFE-CO2萃取具有更好的技術(shù)優(yōu)勢。

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The analyses on chemical components in the leaf volatile oils of Zephyranthes candida(Lindl.)Herb. and their antimicrobial activities in the fresh milk

WEI QiangSHIXue-feng

(PharmacySchool,AnhuiXinhuaUniversity,Hefei,Anhui230088,China)

Two kinds of volatile oil were extracted by steam distillation extraction (SDE) and supercritical fluid extraction of CO2(SFE-CO2), and then they were identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC—MS). The antimicroble effects of the extract on different rot funguses in fresh milk was evaluated in 4 ℃ within 10 days. There were 39 different components in the two kinds of volatile oil, including methyl cyclohexane, octacosane, 1,3-dimethyl-benzene, and dibutyl phthalate mainly found in the SDE volatile oil, and 4-(4-ethylcyclohexyl)-1-pentyl-cyclohexene, toluene, 1,2-benzenedicar-boxylic acid, diisooctyl ester, 1-ethoxy-pentane, 2-methoxy-4-vinylphenol, and 2,4-bis(1,1-dimethylethyl)-phenol mostly presented in the SFE-CO2volatile oil. The differences among the contents of 20 common components in two oils was great. The SFE-CO2volatile oil showed more effective antimicrobial activity with the MIC range of 0.031～0.125 mg/mL. Moreover, those from SFE-CO2volatile oil coulld also provide better exotic perfume and stronger antiseptic functions.

leaf fromZephyranthescandida(Lindl.)Herb.; volatile oil; fresh milk; antimicrobial activities; SDE; SFE-CO2

安徽省質(zhì)量工程項目(編號：2014zy078)

衛(wèi)強(1977-)，男，安徽新華學(xué)院副教授，碩士。

E-mail: weiqiang509@sina.com

2015—12—21

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.006