岳希潔 蔣雪薇 羅曉明 周　慧 劉永樂(lè) 陳代文 周志明

(1. 長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙　410004；2. 連南瑤族自治縣奇鄉(xiāng)生物科技有限公司，廣東 清遠(yuǎn)　513300)

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釀酒酵母溫度敏感性突變株的選育

岳希潔 蔣雪薇 羅曉明 周慧 劉永樂(lè) 陳代文 周志明

(1. 長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410004；2. 連南瑤族自治縣奇鄉(xiāng)生物科技有限公司，廣東 清遠(yuǎn)513300)

釀酒酵母；紫外誘變；溫度敏感性突變株；自溶

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作為一種模式生物，具有安全可靠、遺傳背景清晰等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是外源基因最理想的真核生物表達(dá)系統(tǒng)[1-2]。由于其不能有效釋放外源基因所表達(dá)的蛋白[3-4]，故在工業(yè)中的應(yīng)用存在著明顯的局限性。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了一些利用酵母細(xì)胞膜通透性提高外源蛋白分泌的研究，多集中在兩個(gè)方面：① 采用物理方法處理[5-7]，通過(guò)超聲波、高壓脈沖及光照等方法對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，提高胞內(nèi)物質(zhì)及外源蛋白的分泌能力；② 利用基因工程的手段[8-10]，重組或改造外源基因中的信號(hào)肽，增強(qiáng)外源蛋白的分泌能力。這兩類方法中，機(jī)械處理對(duì)儀器設(shè)備要求較高、工業(yè)化生產(chǎn)難度大[11-12]；基因工程手段則處理過(guò)程較為繁瑣，技術(shù)難度較大[13]。相比之下，傳統(tǒng)的遺傳育種相對(duì)簡(jiǎn)便得多，但其研究少見(jiàn)報(bào)道，主要集中條件致死突變株的研究上，特別是高滲脅迫突變株的研究[14]。條件致死突變株除高滲脅迫突變株外，還有溫度敏感性突變株。溫度敏感性突變株(Temperature-sensitive mutant，Ts)是一種比較常用的條件致死突變株[15]，其溫度敏感性突變位點(diǎn)經(jīng)常發(fā)生在細(xì)胞膜上，誘變篩選突變位點(diǎn)在細(xì)胞膜上的溫度敏感性突變株亞致死類型，可以通過(guò)改變溫度促使酵母適度自溶，產(chǎn)生細(xì)胞膜通透，促進(jìn)胞內(nèi)物質(zhì)釋放到胞外[16]。本試驗(yàn)擬以釀酒酵母二倍體(2n)及單倍體(n)為出發(fā)菌株，采用紫外誘變的方法，以胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸滲透率及胞外1，6-二磷酸果糖(Fructose-1, 6-diphosphate，F(xiàn)DP)濃度為考察指標(biāo)，篩選出溫度敏感性突變株亞致死類型，利用其適度自溶特性，簡(jiǎn)便高效地構(gòu)建能有效釋放胞內(nèi)產(chǎn)物的宿主系統(tǒng)，為酵母工程菌工業(yè)化的應(yīng)用提供一條新的思路。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

1.1.1菌種

釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)Y1：長(zhǎng)沙理工大學(xué)食品與發(fā)酵研究所分離并保藏。

1.1.2培養(yǎng)基

酵母菌活化培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，參照文獻(xiàn)[17]242-244制備；

酵母菌生孢子培養(yǎng)基：McClary培養(yǎng)基，參照文獻(xiàn)[18]制備；

酵母菌完全培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基，參照文獻(xiàn)[17]242-244制備；

種子液培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨20 g，酵母膏 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為6，于121 ℃，濕熱滅菌20 min；

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g，磷酸二氫鉀27.2 g，磷酸氫二鉀 45.6 g，氯化鎂2 g，于121 ℃，濕熱滅菌20 min。

1.1.3儀器

顯微成像系統(tǒng)：Eclipse E200型，尼康儀器(上海)有限公司；

紫外分光光度計(jì)，UV1800型，日本島津公司；

高速離心機(jī)：TGL-16G臺(tái)式，常州諾基儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1菌懸液的制備菌株Y128 ℃、160 r/min培養(yǎng)12 h，無(wú)菌生理鹽水離心洗滌3次，制成108CFU/mL的菌懸液備用。

1.2.2紫外(UV)誘變致死率曲線的測(cè)定取10 mL菌懸液于無(wú)菌皿中，攪拌狀態(tài)下，進(jìn)行不同劑量的紫外照射，紫外照射條件：紫外燈30 W、垂直照射距離30 cm，分別照射10，20，30，40，50，60 s；計(jì)算致死率并確定最佳的誘變劑量。

1.2.3溫度敏感性突變株篩選及鑒定方法將誘變后的酵母懸液進(jìn)行梯度稀釋，涂平板，影印接種于兩組平板上(2n采用麥芽汁平板，n采用麥?zhǔn)掀桨?，分別于28，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑選28 ℃平板上生長(zhǎng)良好，37 ℃平板上微生長(zhǎng)或不生長(zhǎng)的菌株進(jìn)入復(fù)篩；對(duì)應(yīng)點(diǎn)接初篩挑選的菌株于兩組平板上，先點(diǎn)接的平板于37 ℃培養(yǎng)，后點(diǎn)接的28 ℃培養(yǎng)，再次篩選37 ℃微生長(zhǎng)或不長(zhǎng)的菌株為目標(biāo)菌[19]。

1.2.4酵母核酸、蛋白質(zhì)滲透率測(cè)定方法將培養(yǎng)12 h的菌懸液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量10 mL/100 mL，37 ℃培養(yǎng)，2 h后取兩份10 mL發(fā)酵液，一份紫外分光光度法測(cè)其在600 nm處的吸光值，另一份進(jìn)行80 ℃水浴5 min，然后1×104r/min離心20 min，取其上清液，分別測(cè)定其在260，280 nm處吸光值，OD260、OD280與OD600比值分別計(jì)為胞外核酸、蛋白質(zhì)的滲透率。

1.2.5FDP含量及提高率的測(cè)定FDP含量測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[20]。FDP提高率按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

R——FDP提高率，%；

C1——出發(fā)菌株胞外FDP含量，μg/mL；

C2——誘變篩選菌株胞外FDP含量，μg/mL。

2　結(jié)果與分析

2.1釀酒酵母單倍體(n)的制備

將釀酒酵母二倍體(2n)接種于麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上培養(yǎng)1周，篩選獲得其單倍體(n)，并通過(guò)顯微鏡下觀察，檢驗(yàn)酵母菌二倍體生孢子情況，其單倍體(n)子囊孢子見(jiàn)圖1。由圖1可知，在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，酵母菌二倍體(2n)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞易轉(zhuǎn)變生成子囊，這時(shí)細(xì)胞核進(jìn)行減數(shù)分裂，形成4個(gè)子囊孢子。

圖1　釀酒酵母子囊孢子

2.2紫外誘變條件確定

紫外是一種應(yīng)用廣泛、效果明顯的物理誘變劑，具有誘變頻率高、不易回復(fù)突變等優(yōu)點(diǎn)，是工業(yè)微生物育種中最常用和有效的誘變劑之一[21]。釀酒酵母的營(yíng)養(yǎng)體多以二倍體(2n)的形式存在，但其單倍體(n)的突變率相對(duì)較髙，且單倍體(n)突變株經(jīng)重新結(jié)合形成二倍體(2n)后，誘變所獲得的性狀能較穩(wěn)定的遺傳下去，因此，考慮以酵母二倍體(2n)、單倍體(n)同時(shí)作為誘變出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行紫外誘變，結(jié)果見(jiàn)圖2、3。由圖2可知，隨著紫外誘變時(shí)間的延長(zhǎng)，酵母二倍體(2n)致死率逐漸升高，通常情況下取致死率70%～80%為最佳，因此可以確定酵母二倍體(2n)的紫外照射時(shí)間為30 s。酵母單倍體(n)由于孢子壁的保護(hù)作用，其耐紫外線能力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于酵母細(xì)胞，同樣，根據(jù)其誘變致死率曲線(圖3)，確定紫外照射時(shí)間為4.5 min。

圖2　釀酒酵母二倍體(2n)致死率曲線

圖3　釀酒酵母單倍體(n)致死率曲線

2.3溫度敏感性突變株的篩選及生長(zhǎng)特征鑒定

2.3.1釀酒酵母溫度敏感性突變株影印培養(yǎng)法初篩以溫度為篩選條件，通過(guò)影印培養(yǎng)法對(duì)誘變菌株中的溫度敏感性突變株進(jìn)行初篩，結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4中左右兩個(gè)平板上菌落一一對(duì)應(yīng)，圓圈標(biāo)出為突變株，不同溫度培養(yǎng)時(shí)，其生長(zhǎng)狀況出現(xiàn)較大差異，即28 ℃生長(zhǎng)正常，37 ℃無(wú)法生長(zhǎng)或生長(zhǎng)微弱，根據(jù)37 ℃平板對(duì)照培養(yǎng)情況，可以篩選出無(wú)法生長(zhǎng)或生長(zhǎng)微弱的菌株為溫度敏感性突變株，經(jīng)初篩，二倍體(2n)及單倍體(n)共篩選出20株。

Ts突變株：溫度敏感性突變株

Ts突變株：溫度敏感性突變株

2.4溫度敏感性突變株自溶程度考察

表1　釀酒酵母二倍體(2n)突變菌株生長(zhǎng)譜?

?Y1為出發(fā)菌株；Tsn為二倍體菌株；-不生長(zhǎng)；+/-生長(zhǎng)微弱；+生長(zhǎng)良好。

表2　釀酒酵母單倍體(n)突變菌株生長(zhǎng)譜?

圖6　突變株蛋白質(zhì)、核酸滲透率

圖8　突變株胞外FDP提高率

圖7　突變株胞外FDP濃度

3　結(jié)論

高通透性細(xì)胞膜是增強(qiáng)釀酒酵母對(duì)胞內(nèi)物質(zhì)分泌能力的重要因素。通過(guò)簡(jiǎn)單的誘變處理，篩選出對(duì)溫度較為敏感的條件自溶性菌株——溫度敏感性突變株，可以較大程度提高釀酒酵母對(duì)外源蛋白的分泌能力。由于溫度控制簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，所篩選的目標(biāo)菌株將具有良好的工業(yè)應(yīng)用潛力。溫度敏感性突變株條件性自溶對(duì)于改變細(xì)胞膜壁的通透性有著重要的意義，可有效促進(jìn)胞內(nèi)產(chǎn)物的胞外滲透，較好地簡(jiǎn)化了胞內(nèi)產(chǎn)物的提取工藝。

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Breeding of temperature-sensitive mutant from Saccharomyces cerevisiae

1YUE Xi-jie11JIANGXue-wei11LUOXiao-ming11ZHOUHui11LIUYong-le12CHENDai-wen22ZHOUZhi-ming2

(1.CollegeofChemistry&Bioengineering,ChangshaUniversityofScience&Technology,Changsha,Hunan410004,China; 2.LiannanYaoautonomousCountyQixiangBIO-SCICO.,Ltd,Qingyuan,Guangdong513300,China)

清遠(yuǎn)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2013A024，2014A023)；湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2013FJ4036)

岳希潔，女，長(zhǎng)沙理工大學(xué)在讀碩士研究生。

蔣雪薇(1972—)，女，長(zhǎng)沙理工大學(xué)副教授，博士。

E-mail：jxw_72@sina.com

2016—06—15

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.003