陳　婷， 趙　蕊,2, 齊國(guó)君， 何自福， 呂利華*

1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642

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廣東朱槿曲葉病發(fā)生及傳播介體煙粉虱種群組成調(diào)查

陳婷1， 趙蕊1,2, 齊國(guó)君1， 何自福1， 呂利華1*

1廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640；2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642

【背景】 2006年我國(guó)廣東地區(qū)發(fā)現(xiàn)由木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMuV)侵染引起的朱槿曲葉病，但有關(guān)該病害在朱槿植物上的發(fā)病率、傳播介體——煙粉虱隱種的組成尚未見(jiàn)報(bào)道?！痉椒ā吭趶V東省廣州和清遠(yuǎn)地區(qū)對(duì)感染CLCuMuV的朱槿植株進(jìn)行抽樣調(diào)查；利用mtCOⅠ引物擴(kuò)增鑒定煙粉虱隱種種群組成?！窘Y(jié)果】調(diào)查表明，廣州和清遠(yuǎn)地區(qū)朱槿上CLCuMuV的發(fā)病率分別為53.98%～71.78%和38.42%～45.27%。煙粉虱種群均為MEAM1和AsiaⅡ7隱種的混合種群；廣州地區(qū)煙粉虱種群中AsiaⅡ7隱種的比例為6.25%～17.71%，清遠(yuǎn)地區(qū)AsiaⅡ7隱種的比例為76.25%～89.17%?！窘Y(jié)論與意義】隨著帶病植株種植范圍的擴(kuò)大以及可傳毒煙粉虱隱種的擴(kuò)散，CLCuMuV很有可能大范圍擴(kuò)散流行，應(yīng)做好防控監(jiān)測(cè)工作。

廣東??； 朱槿曲葉病； 煙粉虱

由煙粉虱BemisiatabaciGennadius傳播的棉花曲葉病是巴基斯坦和印度棉花生產(chǎn)的頭號(hào)病害(Briddon & Markham，2000； Mansooretal.，2003； Rishi & Chauhan，1994)，其主要病原為木爾坦棉花曲葉病毒(CottonleafcurlMultanvirus，CLCuMuV)。2006 年我國(guó)廣東首次發(fā)現(xiàn)了由CLCuMuV 侵染引起的朱槿曲葉病(毛明杰等，2008)；2010年廣西發(fā)現(xiàn)該病毒侵染棉花并引起棉花曲葉病(Caietal.，2010)；此后陸續(xù)在福建、江蘇等地區(qū)發(fā)現(xiàn)其侵染為害朱槿、紅麻、棉花等(何自福等，2012; 林林等，2011； 湯亞飛等，2015; 張暉等，2015； 章松柏等，2013)。

據(jù)報(bào)道，煙粉虱是一種復(fù)合種，由30個(gè)以上的隱種組成(劉銀泉和劉樹(shù)生，2012; De Barroetal.，2011； Liuetal.，2012)，且不同隱種傳播雙生病毒的種類(lèi)及效率存在明顯差異(Jiuetal.，2006； Lietal.，2010)。在巴基斯坦和印度棉花曲葉病的流行區(qū)域，煙粉虱隱種種群由MEAM1和AsiaⅡ1、AsiaⅠ、AsiaⅡ5、AsiaⅡ7組成(Ahmedetal.，2011； Ashfaqetal.，2014)，該病害給當(dāng)?shù)孛藁ㄉa(chǎn)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失(Briddon & Markham，2000； Mansooretal.，2003)。陳婷等(2016)研究表明，引起棉花曲葉病的CLCuMuV不是由廣泛存在的入侵隱種MEAM1(生物型B)而為，而是由土著隱種AsiaⅡ7、AsiaⅡ1傳播并引起紅麻及黃秋葵罹??；而林林等(2011)和Caietal.(2010)研究認(rèn)為，引起棉花曲葉病的CLCuMuV的傳播介體為MEAM1隱種(B生物型)。明確傳播CLCuMuV的煙粉虱隱種種群組成對(duì)于預(yù)防該病的迅速傳播至關(guān)重要。目前，華南地區(qū)廣泛種植的朱槿受到該病毒的嚴(yán)重侵染，這種病毒可通過(guò)介體在朱槿間傳播，甚至傳播到紅麻及黃秋葵植株上(陳婷等，2016)。但有關(guān)華南地區(qū)朱槿曲葉病的發(fā)生情況及其傳播介體種群組成尚不明確，因此本文對(duì)此進(jìn)行調(diào)查研究，以期為CLCuMuV的流行學(xué)研究和預(yù)防監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1調(diào)查地點(diǎn)及取樣方法

調(diào)查時(shí)間為2014年8—11月，調(diào)查地點(diǎn)位于廣東省廣州市的南沙區(qū)天后宮和萬(wàn)頃沙鎮(zhèn)、清遠(yuǎn)市佛岡縣湯塘鎮(zhèn)和龍山鎮(zhèn)。

1.1.1朱槿曲葉病發(fā)病率調(diào)查及葉片取樣廣州市南沙區(qū)公園綠化區(qū)的朱槿，調(diào)查面積為100 m2；清遠(yuǎn)市2個(gè)調(diào)查點(diǎn)，以道路綠化朱槿為對(duì)象，調(diào)查長(zhǎng)度約100 m。在每個(gè)調(diào)查點(diǎn)，選取3～5個(gè)取樣點(diǎn)，記錄朱槿的發(fā)病株及健康株。調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)：朱槿全株葉片黃化、向上卷曲，葉脈腫大明顯，且產(chǎn)生葉耳，開(kāi)花少或不開(kāi)花，視為發(fā)病株；全株葉片無(wú)上述癥狀即為健康株。在每個(gè)調(diào)查點(diǎn)，分別采集7株顯癥朱槿葉片和未顯癥葉片，放入塑料密封袋中，標(biāo)記采集地點(diǎn)及時(shí)間；帶回實(shí)驗(yàn)室，放入-80 ℃超低溫冰箱保存，備用。

1.1.2朱槿上煙粉虱成蟲(chóng)的采集在調(diào)查朱槿曲葉病的同時(shí)，用吸蟲(chóng)器隨機(jī)采集煙粉虱成蟲(chóng)，每個(gè)地區(qū)采集50頭成蟲(chóng)作為煙粉虱隱種鑒定樣本。將采集的標(biāo)本浸泡于裝有2 mL 95%乙醇的離心管中，帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-20 ℃冰箱中，備用。

1.2朱槿葉片CLCuMuV的檢測(cè)

從-80 ℃超低溫冰箱中取出樣本，采用植物細(xì)胞組織基因組試劑盒EF111-12提取朱槿植株葉片總DNA，具體操作方法參照試劑盒說(shuō)明。分別采用CLCuMuV特異引物AF(5′-CAGGAAGCAGGAAAATACGAGA-3′)/AR(5′-TGGCAGTCCAACACAAAATACG-3′)和β衛(wèi)星分子特異引物βF(5′-AAGTCGAATGGAACGTGAATGT-3′)/βR(5′-GGAGACCAAAAGAGGAGAGAGA-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(湯亞飛等，2015)。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參見(jiàn)陳婷等(2016)。

1.3煙粉虱隱種的鑒定

將保存的煙粉虱樣本取出，采用DP304-03試劑盒提取單頭煙粉虱DNA，具體操作方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。利用煙粉虱mtCOⅠ基因通用引物C1-J-2195(5-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3′)和TL2N-3014(5-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3′)(Simonetal.，1994)，對(duì)單頭煙粉虱DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參見(jiàn)陳婷等(2016)。

利用DNAstar軟件對(duì)獲得的煙粉虱mtCOⅠ基因序列進(jìn)行序列拼接，并利用BLAST程序搜索序列相似性。

2　結(jié)果與分析

2.1朱槿上CLCuMuV的發(fā)生情況

2.1.1朱槿上CLCuMuV的PCR檢測(cè)PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，顯癥病株葉片總DNA中均能擴(kuò)增出CLCuMuV的831 bp特異條帶及其β衛(wèi)星分子的837 bp的特異條帶(圖1)，不顯癥葉片樣本不能擴(kuò)增出預(yù)期的目的條帶。這說(shuō)明顯癥的朱槿葉片樣本含有CLCuMuV及其β衛(wèi)星分子，未顯癥的朱槿葉片樣本不含有CLCuMuV及其β衛(wèi)星分子。

圖1　朱槿植株上CLCuMuV的PCR檢測(cè)Fig.1　Detection of the presence of the CLCuMuV in China rose (Hibiscus rosa-sinensis) plants by PCR M:Marker; A:CLCuMuV; B:β衛(wèi)星分子; 1、3、5、7、9、11、13: 顯癥朱槿植株; 2、4、6、8、10、12、14: 未顯癥朱槿植株; 15:空白對(duì)照。 M: Marker; A: CLCuMuV; B: β-satellite; 1，3，5，7，9，11，13: Diseased China rose plants infected by CLCuMuV; 2，4，6，8，10，12，14: Healthy plants; 15: Blank control.

2.1.2朱槿曲葉病的發(fā)病率調(diào)查結(jié)果表明，廣州市南沙區(qū)與清遠(yuǎn)市佛岡縣均發(fā)現(xiàn)了感染CLCuMuV的朱槿植株；廣州地區(qū)朱槿上CLCuMuV的發(fā)病率為53.98%～71.78%，清遠(yuǎn)地區(qū)朱槿上CLCuMuV的發(fā)病率為38.42%～45.27%(表1)。

表1　廣州市南沙區(qū)和清遠(yuǎn)市佛岡縣的朱槿曲葉病發(fā)病率Table 1　The percentage of Hibiscus rosa-sinensis infected with CLCuMuV in the cities of Guangzhou and Qingyuan

2.2朱槿上煙粉虱隱種種群組成

煙粉虱mtCOⅠ基因片段序列比較結(jié)果表明，廣州市南沙區(qū)和清遠(yuǎn)市佛岡縣的煙粉虱均為MEAM1和AsiaⅡ7隱種的混合種群，但不同地區(qū)2種隱種的比例存在差異。南沙區(qū)天后宮和萬(wàn)頃沙鎮(zhèn)的MEAM1隱種的比例分別為(93.75±10.83)%和(82.29±15.41)%，AsiaⅡ7隱種比例分別為(6.25±10.83)%和(17.71±15.41)%；佛岡縣湯塘鎮(zhèn)和龍山鎮(zhèn)的MEAM1隱種的比例分別為(10.83±10.10)%和(23.75±21.03)%，AsiaⅡ7隱種比例分別為(89.17±10.10)%和(76.25±21.03)%(表2)。

表2　廣州市南沙區(qū)和清遠(yuǎn)市佛岡縣朱槿上煙粉虱隱種的比例Table 2　Proportion of cryptic whitefly species collected from Hibiscus rosa-sinensis plants in the cities of Guangzhou and Qingyuan

3　討論

本研究表明，廣州市南沙區(qū)與清遠(yuǎn)市佛岡縣的調(diào)查點(diǎn)均發(fā)現(xiàn)朱槿植株感染CLCuMuV，前者發(fā)病率高于后者;朱槿上煙粉虱隱種為入侵種MEAM1與土著種AsiaⅡ7的混合種群，清遠(yuǎn)市佛岡縣AsiaⅡ7隱種比例高于廣州市南沙區(qū)。由CLCuMuV引起的朱槿曲葉病通過(guò)插枝繁殖(未發(fā)表數(shù)據(jù))和AsiaⅡ7轉(zhuǎn)染(陳婷等，2016)得以傳播，推測(cè)這種差異可能與人為干擾程度相關(guān)。佛岡縣調(diào)查點(diǎn)位于農(nóng)田區(qū)，雖然在短期內(nèi)土著隱種AsiaⅡ7種群高，但因移植朱槿數(shù)量較少且移植時(shí)間較短，尚未能引起較多朱槿植株染??；在廣州南沙區(qū)的調(diào)查點(diǎn)，朱槿發(fā)病時(shí)間約10年之久，且朱槿種植面積較大，有的可能通過(guò)插枝繁殖感染病毒，雖然在調(diào)查時(shí)段內(nèi)AsiaⅡ7種群數(shù)量較低，但長(zhǎng)期循環(huán)侵染導(dǎo)致發(fā)病率較高。

我國(guó)CLCuMuV的來(lái)源途徑：(1)通過(guò)帶毒煙粉虱隨東南亞進(jìn)口的花卉或水果等農(nóng)產(chǎn)品傳入并定殖；(2)隨朱槿、黃秋葵等寄主植物直接帶毒入侵我國(guó)(何自福等，2010)。對(duì)廣東省某實(shí)驗(yàn)基地CLCuMuV發(fā)生地塊、野外的朱槿曲葉病發(fā)病植株，以及健康朱槿植株上的煙粉虱進(jìn)行檢測(cè)，均有攜帶CLCuMuV的煙粉虱個(gè)體(未發(fā)表數(shù)據(jù))。煙粉虱入侵隱種MEAM1和土著隱種具有不同的取食偏好性。據(jù)報(bào)道，MEAM1在棉花、甘藍(lán)、黃瓜和番茄等4種寄主植物上的適合度沒(méi)有差異，而AsiaⅡ1對(duì)棉花的適合度高于其他寄主植物(Ashfaqetal.，2014)；MEAM1隱種在蔬菜上的內(nèi)稟增長(zhǎng)率高于觀賞植物，AsiaⅡ7隱種則在觀賞植物上的內(nèi)稟增長(zhǎng)率高于蔬菜(Qiuetal.，2011)。由此推斷，AsiaⅡ7的寄主適生性與朱槿曲葉病發(fā)病存在相關(guān)性，今后仍需在更大范圍內(nèi)對(duì)更多寄主植物種類(lèi)進(jìn)行連續(xù)調(diào)查，并通過(guò)開(kāi)展室內(nèi)傳染試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

朱槿是一種在廣東、廣西、海南、福建、臺(tái)灣、云南等地廣泛種植的園林植物(劉小冬等，2008)，而華南地區(qū)朱槿普遍感染CLCuMuV，加上我國(guó)大部分地區(qū)種植的黃秋葵極易感染曲葉病(陳婷等，2016)，這些帶毒植株已成為該病毒長(zhǎng)期穩(wěn)定的毒源庫(kù)(何自福等，2012； Duetal.，2015)；同時(shí)，可傳播CLCuMuV的土著煙粉虱隱種在我國(guó)廣泛分布，隨著帶病植株種植范圍的擴(kuò)大以及可傳毒土著煙粉虱隱種的擴(kuò)散，CLCuMuV很有可能大范圍擴(kuò)散流行。因此，今后仍需對(duì)華南地區(qū)攜帶CLCuMuV的更多錦葵科寄主上的煙粉虱隱種進(jìn)行調(diào)查鑒定。

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(責(zé)任編輯:楊郁霞)

Incidence of leaf curl disease and the composition ofBemisiatabaci(Hemiptera: Aleyrodidae) population onHibiscusrosa-sinensisin Guangdong Province, China

Ting CHEN1, Rui ZHAO1,2, Guo-jun QI1, Zi-fu HE1, Li-hua Lü1*

1GuangdongProvincialKeyLaboratoryofHighTechnologyforPlantProtection,PlantProtectionResearchInstitute,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,Guangzhou,Guangdong510640,China;2CollegeofAgriculture,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong510642,China

【Background】 TheCottonleafcurlMultanvirus(CLCuMuV), transmitted by the whiteflyBemisiatabaciwas first reported in Guangdong Province in 2006. Due to the cryptic species structure of theB.tabacicomplex, the interacton between the CLCuMuV and the whitefly in southern China is not clear. 【Method】 We investigated the CLCuMuV infection rates and identified the cryptic species ofB.tabaciin Guangzhou and Qingyuan cities in Guangdong Province. 【Result】 The percentage of China rose plants (Hibiscusrosa-sinensis) infected with CLCuMuV was 53.98%～71.78% in Guangzhou and 38.42%～45.27% in Qingyuan. The whiteflies were a mixture of MEAM1 and AsiaⅡ7, with the latter being in the minority (6.25%～17.71%) in Guangzhou but forming the majority (76.25%～89.17%) in Qingyuan. 【Conclusion and significance】 With the sick plants range expansion and poison cryptic species ofB.tabacidiffusion, CLCuMuV is may spread in large scale, prevention and monitoring work should be developed.

Guangdong Province;Hibiscusrosa-sinensisleaf curl disease;Bemisiatabaci

2016-05-21接受日期(Accepted)： 2016-07-05

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2015BAD08B02)； 國(guó)家國(guó)際科技合作計(jì)劃(2011DFB30040)； 科技部科技伙伴計(jì)劃(KY201402015)

陳婷， 女， 助理研究員。 研究方向： 入侵生物學(xué)。 E-mail: ch.t120@126.com

Author for correspondence), E-mail: lhlu@gdppri.com

10. 3969/j.issn.2095-1787.2016.03.009