李媛睿， 俞 靜， 劉 瑛

·綜述·

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜在革蘭陰性桿菌對β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性檢測中的應用進展

李媛睿， 俞 靜， 劉 瑛

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜； 革蘭陰性桿菌； β內(nèi)酰胺類抗生素； 耐藥性

β內(nèi)酰胺類抗生素是一類臨床應用最為廣泛的抗菌藥物，它通過干擾細菌細胞壁肽聚糖的交聯(lián)結(jié)構(gòu)發(fā)揮殺菌作用。該類抗生素包括青霉素及其衍生物、頭孢菌素、單酰胺環(huán)類和碳青霉烯類等，其中尤以碳青霉烯類抗生素的抗菌活性最強。2013年CHINET細菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示：腸桿菌科細菌對頭孢菌素的耐藥率約為20%，對碳青霉烯類抗生素的耐藥率接近7%；不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌對頭孢菌素和碳青霉烯類抗生素耐藥率均接近50%［1］。耐藥菌株不斷出現(xiàn)給臨床用藥的選擇帶來很大困惑。針對上述細菌耐藥性的嚴峻形勢，需要應用新技術(shù)更加快速、準確地檢測細菌及其對抗菌藥物的耐藥性，從而及時對患者進行合理的抗生素治療，對醫(yī)院內(nèi)傳播的耐藥菌株采取有效的控制措施。

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是最新發(fā)展起來的一種快速檢測生物大分子的軟電離質(zhì)譜技術(shù)，可用于細菌和真菌鑒定，具有簡便、快速、準確和經(jīng)濟等優(yōu)點［2］。近年來MALDI-TOF MS技術(shù)在微生物領(lǐng)域內(nèi)的應用范圍不斷擴展，它不僅是細菌鑒定的有效工具，也為細菌耐藥性檢測研究提供了新方法。細菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性的原因包括：天然固有耐藥、后天耐藥基因突變和基因轉(zhuǎn)移。革蘭陰性桿菌對β內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生的耐藥機制主要有以下3種：產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶、外膜孔道蛋白結(jié)構(gòu)改變和外排泵系統(tǒng)的過度表達等。本文從上述三方面綜述了MALDI-TOF MS在革蘭陰性桿菌β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性檢測方面相關(guān)的研究進展，并展望該技術(shù)未來的應用前景。

1 應用MALDI-TOF MS檢測β內(nèi)酰胺酶

1.1 β內(nèi)酰胺酶活性的檢測

產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶是導致細菌對β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要原因，臨床上重要的β內(nèi)酰胺酶包括青霉素酶、超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）、頭孢菌素酶以及碳青霉烯酶。β內(nèi)酰胺酶具有解開β內(nèi)酰胺類抗生素的β內(nèi)酰胺環(huán)的活性，應用MALDI-TOF MS檢測抗生素及其降解產(chǎn)物變化，可以判斷細菌是否具有β內(nèi)酰胺酶活性。常見β內(nèi)酰胺類抗生素及其降解產(chǎn)物的分子式和分子量見表1。

表1 β內(nèi)酰胺類抗生素及其降解產(chǎn)物的分子式和分子量

應用MALDI-TOF MS檢測抗生素等小分子樣本的常用基質(zhì)有2，5-二羥基苯甲酸（DHB）和α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）［3］，分子量分別為154 u和190 u。由于基質(zhì)的質(zhì)譜峰可能會干擾待測抗生素的質(zhì)譜峰，因此需要選擇合適的基質(zhì)，使基質(zhì)峰和樣品峰之間不存在重疊。相關(guān)研究顯示：美羅培南［M+H］+（384 u）與HCCA二聚物［2M+H］+（380 u）的質(zhì)譜峰有重疊，應選擇DHB為檢測美羅培南的基質(zhì)［4］；檢測氨芐西林、哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢他啶、亞胺培南和厄他培南等抗生素，均可選擇HCCA為基質(zhì)［5-7］。應用MALDI-TOF MS檢測細菌的β內(nèi)酰胺酶活性，可用Tris-HCl緩沖液和0.45% NaCl溶液作為細菌蛋白質(zhì)的溶劑，其中加入SDS能有效降低上清液中細菌蛋白豐度，抑制基質(zhì)信號，從而提高檢測特異性［4，8］。目前市場上已有多種品牌及型號的MALDI-TOF MS儀和靶板：質(zhì)譜儀通常配制MALDI離子源和線性TOF檢測器，采用新型的反射式TOF檢測器，能提高檢測分辨率和質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集速度；AnchorChip質(zhì)譜靶板表面疏水作用基團的中央具有親水基團，溶劑蒸發(fā)時樣品液滴收縮增加了靶板點樣區(qū)的蛋白質(zhì)豐度，相對常規(guī)靶板其檢測靈敏度提高10～100倍［6］。

不同文獻報道的應用MALDI-TOF MS檢測β內(nèi)酰胺酶活性的方法基本相同：將過夜培養(yǎng)的純菌落配成菌懸液，加入一定濃度的β內(nèi)酰胺類抗生素溶液，混勻后置于37 ℃孵育1～4 h，離心，取上清液和相應基質(zhì)依次點至靶板，利用MALDITOF MS進行檢測，根據(jù)抗生素峰是否缺失或峰強度降低及降解產(chǎn)物質(zhì)譜峰是否出現(xiàn)，來判斷待測菌株是否具有相應的酶活性。表2中顯示，MALDI-TOF MS在1～4 h內(nèi)可檢測革蘭陰性桿菌β內(nèi)酰胺酶活性，除生物梅里埃公司的VITEK MS型質(zhì)譜儀外，應用布魯克公司的Ultraflex、Microflex和Autoflex型質(zhì)譜儀檢測β內(nèi)酰胺酶活性的靈敏度和特異度達96%～100%，與傳統(tǒng)方法相比具有操作簡單直接，快速準確等優(yōu)點，將來有可能成為臨床微生物實驗室的常規(guī)檢測方法［9］。應用MALDI-TOF MS檢測β內(nèi)酰胺酶活性存在一定局限性：由于采用的基質(zhì)和緩沖液不同，造成各實驗室所得抗生素及降解產(chǎn)物質(zhì)譜峰分子量存在差異，這就需要設置各自實驗室的陽性和陰性對照，作為檢測結(jié)果的判斷依據(jù)［10］；僅能夠檢測耐藥株是否水解β內(nèi)酰胺類抗生素，而不能判斷菌株對抗生素的耐藥程度［11］。

最近有研究報道，采用MALDI-TOF MS技術(shù)聯(lián)合SepsityperTMkit試劑盒或分離膠促凝管，不但可直接檢測陽性血培養(yǎng)中細菌，還可快速檢測陽性血培養(yǎng)中細菌的β內(nèi)酰胺酶活性，對臨床調(diào)整抗生素治療方案、控制血流感染有重要意義［12-13］。

1.2 β內(nèi)酰胺酶的檢測

β內(nèi)酰胺酶是一類由細菌產(chǎn)生的酶蛋白質(zhì)。將細菌蛋白質(zhì)提取物用MALDI-TOF MS檢測，可直接鑒定細菌是否產(chǎn)生β內(nèi)酰胺酶特異的質(zhì)譜峰，MALDI-TOF MS的檢測結(jié)果可通過肽質(zhì)量指紋譜（peptide mass fingerprinting，PMF） 分析得到驗證。PMF分析是目前蛋白質(zhì)組研究中鑒定蛋白質(zhì)較為常用的方法：首先提取細菌蛋白質(zhì)進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）或雙向凝膠電泳（two-dimensional electrophoresis， 2-DE）；再切取凝膠中β內(nèi)酰胺酶蛋白條帶，經(jīng)胰蛋白酶消化后產(chǎn)生肽段，采用串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF MS）或液相色譜質(zhì) 譜（Liquid chromatography -mass spectrometry，LC-MS）鑒定出肽段序列；最后將肽段數(shù)據(jù)導入Mascot軟件，搜索匹配蛋白質(zhì)種類。Mascot是目前使用最廣泛的蛋白質(zhì)鑒定檢索軟件， 可以實現(xiàn)從質(zhì)譜數(shù)據(jù)到蛋白質(zhì)的鑒定。

表2 應用MALDI-TOF MS檢測革蘭陰性桿菌β內(nèi)酰胺酶活性

CAMARA等［18］在含氨芐西林的LB肉湯中培養(yǎng)耐藥大腸埃希菌，通過甲酸和異丙醇裂解提取細菌蛋白質(zhì)，將上清液點樣至靶板，干燥后再點樣基質(zhì)芥子酸 （sinapic acid， SA），采用MALDI -TOF MS檢測發(fā)現(xiàn)在29 ku處存在特征質(zhì)譜峰，通過PMF分析驗證該峰為β內(nèi)酰胺酶。PAPAGIANNITSIS等［19］應用MALDI-TOF MS檢測產(chǎn)頭孢菌素酶弗氏枸櫞酸桿菌的提取物，發(fā)現(xiàn)在39 850 u處有特異性質(zhì)譜峰，經(jīng)PMF分析確證為CMY-2型頭孢菌素酶。LAU等［20］利用MALDI -TOF MS檢測產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌存在11 109 u特征質(zhì)譜峰，經(jīng)PMF分析鑒定為blaKPC型碳青霉烯酶，由于肺炎克雷伯菌pKpQIL質(zhì)粒上的blaKPC基因與Tn4401轉(zhuǎn)位子相連，可將blaKPC基因通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)移接合至大腸埃希菌DH10B，采用MALDI -TOF MS和DNA序列分析均能證明發(fā)生轉(zhuǎn)移結(jié)合的大腸埃希菌存在11 109 u特征性質(zhì)譜峰和Tn4401轉(zhuǎn)位子。

1.3 β內(nèi)酰胺酶基因的SNP測序

PUSCH等［21］建 立 了 以MALDI-TOF MS為基礎(chǔ)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）基因分型方法：首先通過PCR擴增出一段含有SNP的DNA（SNP位點前后各50 bp左右），用SNP酶去除掉PCR體系中剩余的脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）和引物；再加入單堿基延伸引物，其3'末端堿基緊挨SNP位點，采用4種ddNTP替代dNTP；然后探針在SNP位點處僅延伸一個堿基，連接上的ddNTP與SNP位點的等位基因?qū)蛔詈髴肕ALDI-TOF MS檢測延伸產(chǎn)物與未延伸引物間的分子量差異，確定該位點處堿基，能夠推測DNA堿基序列的變化。

有相關(guān)研究報道［22-23］，基于MALDI-TOF MS 的SNP測序技術(shù)能清楚區(qū)分細菌質(zhì)粒攜帶的β內(nèi)酰胺酶基因上位點突變的質(zhì)譜峰差異，從而準確檢測大腸埃希菌的SHV型和TEM型β內(nèi)酰胺酶基因。基于MALDI-TOF MS的SNP測序是一種快速檢測β內(nèi)酰胺酶基因的新方法，其檢測結(jié)果高度可靠、試劑成本低、適合于自動化操作且在一次實驗中可檢測多位點突變。

2 應用MALDI-TOF MS檢測膜孔蛋白

革蘭陰性細菌的外膜上存在多種外膜蛋白（outer membrane protein， Omp），其中膜孔蛋白（porin）對抗生素具有選擇通透性。若膜孔蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變或者缺失，外膜通透性減弱，運輸至細菌壁膜間隙的β內(nèi)酰胺類抗生素大量減少，使細菌對抗生素耐藥。

PMF是一種直接、有效的蛋白質(zhì)組鑒定技術(shù)，近年來質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)應用于細菌外膜蛋白質(zhì)組研究［24］。通常采用SDS-PAGE或2-DE電泳分離細菌外膜蛋白，切取凝膠中目的蛋白條帶，胰蛋白酶解蛋白質(zhì)并純化肽段，再進行質(zhì)譜儀檢測，最后在Mascot數(shù)據(jù)庫中檢索PMF代表的膜孔蛋白組分。應用質(zhì)譜儀檢測不同革蘭陰性桿菌的膜孔蛋白的結(jié)果如表3所示［25-27］。最新一項研究建立了應用MALDI-TOF MS快速檢測大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌膜孔蛋白的方法，結(jié)果表明肺炎克雷伯菌質(zhì)譜圖中38 ku和36 ku處峰缺失，與SDS-PAGE上42 ku的OmpK36 ku和40 ku的OmpA條帶缺失相對應；大腸埃希菌質(zhì)譜圖中38 ku、37 ku和35 ku處峰缺失，與SDS-PAGE上41 ku的OmpC、40 ku的OmpF和38 ku的OmpA條帶缺失相對應［28］。該方法簡化了操作流程，且分辨率較高，可用于細菌膜孔蛋白缺失的快速篩查。

表3 應用MALDI-TOF MS檢測革蘭陰性桿菌膜孔蛋白和外排泵相關(guān)蛋白質(zhì)

3 MALDI-TOF MS檢測外排泵系統(tǒng)

革蘭陰性桿菌的外排泵系統(tǒng)通過主動外排多種藥物，形成了低水平和非特異的耐藥性。革蘭陰性桿菌最主要的外排泵系統(tǒng)為耐藥結(jié)節(jié)分化超家族（resistance nodulation cell division family，RND），它是一組跨越細菌內(nèi)膜和外膜的蛋白質(zhì)，由內(nèi)膜轉(zhuǎn)運蛋白、膜融合蛋白和外膜通道蛋白構(gòu)成三聚體。應用質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合蛋白質(zhì)分離方法和生物信息學工具，不僅能檢測細菌外膜的膜孔蛋白，也能檢測細菌外排泵系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)組分。

XU等［25］對提取的大腸埃希菌總蛋白進行2-DE電泳，提純處理凝膠中蛋白質(zhì)的肽段后，應用MALDI-TOF MS檢測并檢索，結(jié)果顯示為外排泵系統(tǒng)中外膜通道蛋白TolC和YhiU，通過蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）驗證耐氨芐西林大腸埃希菌TolC和YhiU的表達量增加。在銅綠假單胞菌蛋白質(zhì)組的研究中［26，30］，應用MALDI-TOF MS能成功檢測到外排泵系統(tǒng)中膜融合蛋白MexA和外膜通道蛋白OprM，經(jīng)Western blotting證實MexA和OprM表達上調(diào)導致銅綠假單胞菌產(chǎn)生耐藥性。應用MALDI-TOF MS檢測不同革蘭陰性桿菌的外排泵相關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)果如表3所示［25-26，29-30］。

4 展望

MALDI-TOF MS具有自動化、高通量、操作簡便、樣本用量少和檢測準確度高等特點。它將微生物檢測時間由以小時計算推進到以分鐘計算，應用范圍從微生物的快速鑒定擴大到耐藥性檢測。隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展、操作流程的簡化、微生物PMF和耐藥相關(guān)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的豐富和擴展，我們相信臨床微生物實驗室未來也將具備檢測分析細菌蛋白質(zhì)組的能力?；谖⑸颬MF和蛋白質(zhì)組圖譜的MALDI-TOF MS技術(shù)是微生物領(lǐng)域的一場革命，這一技術(shù)未來可應用于細菌的分子流行病調(diào)查、細菌毒力因子和血藥濃度檢測，甚至可用來指導藥物分子靶點的篩選和新藥的設計，為患者提供個體化的治療方案，它將全面推進微生物快速診斷與耐藥性檢測的發(fā)展。

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Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry for detection of β-lactam resistance in gram-negative bacilli

LI Yuanrui， YU Jing， LIU Ying. （Department of Laboratory Medicine， Xinhua Hospital， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， Shanghai 200092， China）

R378.2

A

1009-7708（2016）02-0229-06

10.16718/j.1009-7708.2016.02.019

2015-06-18

2015-07-15

上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院檢驗科臨床微生物室，上海 200092。

李媛睿（1990—），女，碩士研究生，主要從事細菌耐藥機制研究。

劉瑛，E-mail： lywjw0129@163.com。