潘文，汪樂(lè)原

(1、湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 襄樊 441000；2、湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430065)

一個(gè)湖北麥冬疑似種的分類地位研究△

潘文1，汪樂(lè)原2*

(1、湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 襄樊 441000；2、湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430065)

目的：為一個(gè)湖北麥冬疑似種的命名及其藥用價(jià)值的研究提供基礎(chǔ)。方法：對(duì)湖北麥冬疑似種及從形態(tài)或分布上看較有可能是其親本或原變種的植物，還有不可能是其親本或原變種但與其區(qū)別最小的湖北麥冬，進(jìn)行ISSR，將ISSR的結(jié)果轉(zhuǎn)換成由0和1組成的數(shù)據(jù)矩陣，用軟件SPSS16.0計(jì)算處理這種數(shù)據(jù)矩陣，以得到任意兩個(gè)供試植物的相關(guān)系數(shù)，并構(gòu)建聚類圖。根據(jù)對(duì)相關(guān)系數(shù)和聚類圖的分析結(jié)果，作出研究結(jié)論。結(jié)果：從52個(gè)ISSR引物篩選出10條引物，這10條引物共擴(kuò)增出141條帶，其中140條是多態(tài)性的，能很好的區(qū)分各種供試植物。湖北麥冬疑似種與湖北麥冬間的相關(guān)系數(shù)，大于湖北麥冬疑似種與其他供試植物間的相關(guān)系數(shù)；湖北麥冬疑似種與山麥冬間相關(guān)系數(shù)的平均數(shù)，小于湖北麥冬疑似種與湖北麥冬間相關(guān)系數(shù)的平均數(shù)，大于湖北麥冬疑似種與剩余的其他種供試植物間的相關(guān)系數(shù)或相關(guān)系數(shù)的平均數(shù)。聚類圖也顯示，湖北麥冬疑似種先與湖北麥冬聚類，次與山麥冬聚類，然后才與其他的供試植物依次聚類。結(jié)論：湖北麥冬疑似種可能是山麥冬中的(同源四倍體)與短葶山麥冬(二倍體)雜交而產(chǎn)生的異源三倍體。這樣推測(cè)的依據(jù)是：1、此種植物與湖北麥冬間的相關(guān)系數(shù)最大，并且都具有開花后不結(jié)果的特征，而周群等人對(duì)湖北麥冬的核型研究表明，它是一種異源三倍體；三倍體又恰好早被遺傳學(xué)闡明是不能進(jìn)行有性生殖的。2、湖北麥冬疑似種和短葶山麥冬都沒(méi)有地下橫走莖，并且兩者之間的相關(guān)系數(shù)是第三大的。3、湖北麥冬疑似種與山麥冬間的相關(guān)系數(shù)是第二大的，并且兩者的花藥在形態(tài)上都是矩圓形范疇的。

湖北麥冬疑似種；分類；ISSR

2010年和2011年，筆者先后在武漢市的漢口常青公園發(fā)現(xiàn)31株、在漢陽(yáng)的龜山北坡發(fā)現(xiàn)27株、在武昌的湖北中醫(yī)藥大學(xué)紫陽(yáng)校區(qū)發(fā)現(xiàn)18株湖北麥冬LiriopespicataLour.var.proliferaY.T.Ma的疑似種。說(shuō)是湖北麥冬疑似種的理由為：此種植物的大多數(shù)性狀都與湖北麥冬的一樣，尤其是其花序也像湖北麥冬的花序那樣，開完花后不結(jié)果而生出葉簇。但其不像湖北麥冬那樣具地下走莖，且其花藥比湖北麥冬的花藥寬一點(diǎn)(其花藥呈矩圓形[1]，而湖北麥冬的花藥呈狹矩圓形[2])。

由遺傳學(xué)的理論知道，開花后不結(jié)果的植物不可能是正種(或稱原變種)，而很可能是某個(gè)正種的變種或某兩個(gè)不同正種的雜交種[3]。上述的湖北麥冬疑似種究竟是湖北麥冬還是后者所在屬即山麥冬屬(Liriope)的某個(gè)正種的變種？或者是此屬某兩個(gè)正種間的雜交種？筆者對(duì)這樣的問(wèn)題很感興趣，因?yàn)楣P者知道，山麥冬屬的已知植物都會(huì)生出塊根，其塊根大多有藥用功能[4-5]；開花不結(jié)果的植物所生出的地下部分一般產(chǎn)量較高，若含藥用成分，其含量也會(huì)較高。湖北麥冬疑似種肯定是山麥冬屬植物，由于它與湖北麥冬一樣也生有塊根和開花后不結(jié)果，因此它很可能與湖北麥冬一樣是此屬中塊根產(chǎn)量較高的藥用植物。如果經(jīng)研究證明，它也是湖北麥冬，那么由于它不像具地下走莖的湖北麥冬那樣被人類長(zhǎng)期精心栽培，因此很可能在抗逆性上比湖北麥冬強(qiáng)。如果經(jīng)研究證明它不是湖北麥冬，而是同屬的某個(gè)種的變種或某兩個(gè)種間的雜交種，那么就可以給其命名，之后就可以名正言順地研究其藥用品質(zhì)和價(jià)值。則有利于給其命名。為了找到上述問(wèn)題的答案，筆者用ISSR(簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性)技術(shù)進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

見表1中所列。材料的鑒定人是本文作者之中的汪樂(lè)原教授，材料采回后分別栽培于各個(gè)花盆里。

表1 材料名稱及產(chǎn)地

注：之所以稱表1中的7號(hào)材料為疑似川麥冬，是因?yàn)楣P者遇到它時(shí)，它既未開著花也未掛著果，以至無(wú)法鑒定；但筆者看到它與川麥冬一樣具細(xì)長(zhǎng)的地下走莖，且生于川麥冬的著名產(chǎn)區(qū)——四川省綿陽(yáng)市三臺(tái)縣。此材料不是本研究課題所需要的材料，是為其他目的而順便試驗(yàn)的材料。

1.2 方法

1.2.1 植物基因組DNA的提取 取上述材料的新鮮葉片，潔凈后在液氮中研成粉末，再用上海捷瑞生物工程有限公司出品的植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，按下述方法對(duì)之進(jìn)行提?。?/p>

(1)從葉片粉末中取適當(dāng)量，快速轉(zhuǎn)移置1.5 mL的離心管中。(2)加入400 μL的PCL Solution，震蕩混勻1分鐘，再加入15 μL的RnaseA，充分混勻。置于65 ℃水浴15～30 min，其間顛倒混勻2次，直至混合液變透明。(3)12 000 rpm離心5 min，輕輕吸取上清液到干凈的離心管中。

(4)加入150μL的PPSolution，上下顛倒3～5次，在冰上放置15 min.

(5)12 000 rpm 離心5 min.輕輕吸取上清液到新的干凈的離心管中。

(6)加入600 μL的PB Solution，混勻，室溫靜置3 min。

(7)取全部混合液到GenCleanColumn 中，12 000 rpm離心3 min，取下GenClean Column，倒掉收集管中廢液(注：如果混合液量較大，則分兩次過(guò)柱)。

(8)將GenCleanColumn 放回收集管中，然后加入500 μL的Wash Solution，12 000 rpm離心30 s。(9)重復(fù)第(8)步驟一次。(10)取下GenCleanColumn，棄去收集管中的廢液，將GenCleanColumn放回收集管中，12 000 rpm離心1 min。(11)將GenCleanColumn在室溫下開蓋放置5 min，或在50℃下放置2 min，以徹底去盡殘留的乙醇。(12)將GenCleanColumn放入干凈的1.5 mL離心管中，在GenCleanColumn的中央加入30～50 μL Elution Buffer，室溫或55 ℃下放置2 min，12 000 rpm離心1 min，完畢后離心管中出現(xiàn)的液體即為基因組DNA。

1.2.2 對(duì)提取物進(jìn)行ISSR 反應(yīng)體系的總體積為20 μL，其中含有10 x Buffer2.0 μL，Tag聚合酶(購(gòu)自天根生化科技有限公司)0.5 μL，25 mmol·L-1的M2+2.0 μL，引物0.96 μL，10 mmol·L-1的dNTPs1.2 μL，模板DNA2.0 μL，甲酰胺0.4 μL，ddH2O10.94 μL。在PTC-200(德國(guó)BIO-RAD)PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，具體程序?yàn)椋合仍?5 ℃下預(yù)變性3 min，然后把在94 ℃下變性30 s、在50 ℃下復(fù)性45 s和在72 ℃下延伸90s這三步循環(huán)進(jìn)行40次，最后在72 ℃下延伸5 min。結(jié)束了擴(kuò)增反應(yīng)，則取擴(kuò)增產(chǎn)物7μL與核酸染料3μL混勻，加入到預(yù)先制好的1%瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中，在5 V/cm的電壓下用1×TAE電泳緩沖液電泳100 min。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳及檢測(cè) 取擴(kuò)增產(chǎn)物7 μL，與3 μL核酸染料混勻，加入到預(yù)先制好的1%瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔中，在5 V/cm的電壓下用1×TAE電泳緩沖液電泳100 min。電泳結(jié)束后，在WD-9413A 凝膠成像分析儀(北京六一儀器廠)上觀察擴(kuò)增產(chǎn)物電泳帶并對(duì)之拍照。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 將肉眼可見的每個(gè)電泳帶都記為1，將這些1按所對(duì)應(yīng)的引物的不同分為不同的組，每個(gè)組中的1以相應(yīng)的樣品為對(duì)口，以帶間的遷移率之差為間距，排成一個(gè)縱列，組中各樣品的具有同樣遷移率的1排在同一條水平線上；若有的樣品在這種水平線上沒(méi)有1，則給其記個(gè)0在這種水平線上。通過(guò)這樣的方法建立二元數(shù)據(jù)矩陣，然后使用SPSS16.0軟件中的Jaccard方法對(duì)數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行聚類分析，以獲得各樣品間的相關(guān)系數(shù)表和聚類圖。

2 結(jié)果

2.1 有效引物及其擴(kuò)增情況

通過(guò)對(duì)52個(gè)ISSR引物(美國(guó)哥倫比亞大學(xué)公布，上海捷瑞生物工程有限公司分裝)進(jìn)行篩選，選得10個(gè)能使各樣品擴(kuò)增出多態(tài)性高并且清晰、穩(wěn)定之條帶的引物，其堿基序列見表2。

表2 10個(gè)有效引物的堿基序列

在這10個(gè)引物中，擴(kuò)增條帶最多的是引物UBC850，為17條，見圖1，擴(kuò)增條帶最少的是引物UBC856，為11條。

注：M是Marker，1至15是各樣品的編號(hào)，它們與表1中各材料的編號(hào)相對(duì)應(yīng)圖1 引物UBC850對(duì)各樣品的擴(kuò)增譜帶

10條引物共擴(kuò)增出141條帶，其中140條是多態(tài)性的，見表3。

表3 10個(gè)有效引物的擴(kuò)增情況

2.2 ISSR的分辨率表現(xiàn)

10個(gè)有效引物的擴(kuò)增帶型均有變化，能很好的區(qū)分各種供試植物。

2.3 處理數(shù)據(jù)后獲得的樣品間相關(guān)系數(shù)表和聚類圖見表4和圖2。

3 討論

表4 樣品間相關(guān)系數(shù)表

圖2 所有供試樣品的聚類圖

聚類圖顯示，產(chǎn)區(qū)不同而學(xué)名相同的植物之間優(yōu)先聚類，僅武昌或廬山產(chǎn)的短葶山麥冬(即4號(hào)或5號(hào)材料)與泉州產(chǎn)的短葶山麥冬(即6號(hào)材料)之間是例外；從相關(guān)系數(shù)表中也可以看出，產(chǎn)地不同而學(xué)名相同的植物，其間的相關(guān)系數(shù)大于其跟非同名植物間的相關(guān)系數(shù)(僅廬山或武昌產(chǎn)的短葶山麥冬與泉州產(chǎn)的短葶山麥冬之間是例外)，這些都部分地證明，當(dāng)初筆者對(duì)供試材料的鑒定結(jié)論是正確的。

從相關(guān)系數(shù)表中還可以看出，湖北麥冬疑似種(13和14號(hào)材料)與湖北麥冬(3號(hào)材料)間的相關(guān)系數(shù)為0.373和0.415，均大于湖北麥冬疑似種與其他供試植物間的相關(guān)系數(shù)；湖北麥冬疑似種與山麥冬間的相關(guān)系數(shù)為0.299、0.306、0.323和0.333，其平均數(shù)是0.315，此數(shù)小于湖北麥冬疑似種與湖北麥冬間相關(guān)系數(shù)的平均數(shù)，大于湖北麥冬疑似種與其他任何種供試植物間的相關(guān)系數(shù)或相關(guān)系數(shù)的平均數(shù)。聚類圖也顯示，湖北麥冬疑似種先與湖北麥冬聚類，次與山麥冬聚類，然后才與其他的供試植物依次聚類。這些情況表明，湖北麥冬疑似種與湖北麥冬的遺傳距離最近，與山麥冬的遺傳距離第二近。

湖北麥冬疑似種可能是山麥冬(同源四倍體)與短葶山麥冬(二倍體)雜交而產(chǎn)生的異源三倍體。這樣推測(cè)的依據(jù)是：(1)此種植物與湖北麥冬間的相關(guān)系數(shù)最大，并且都具有開花后不結(jié)果的特征，而周群等人對(duì)湖北麥冬的核型研究表明，湖北麥冬是一種異源三倍體[6]；三倍體又恰好早被遺傳學(xué)證明是不能進(jìn)行有性生殖的。(2)此種植物和短葶山麥冬都沒(méi)有地下橫走莖，并且兩者之間的相關(guān)系數(shù)是第三大的。(3)此種植物與山麥冬間的相關(guān)系數(shù)是第二大的，并且兩者的花藥都是矩圓形的?；蛟S有人會(huì)質(zhì)疑：此研究中試驗(yàn)的山麥冬屬植物未包括該屬在中國(guó)的全部種類，尚缺乏矮小山麥冬、長(zhǎng)梗山麥冬和甘肅山麥冬這三種，怎么可以根據(jù)對(duì)有限的種類進(jìn)行試驗(yàn)所獲得的結(jié)果，作出“湖北麥冬疑似種可能是山麥冬中的同源四倍體類型與短葶山麥冬(二倍體)雜交而產(chǎn)生的異源三倍體”這一判斷呢？筆者的回答是，那三種未被試驗(yàn)的山麥冬屬植物有著與無(wú)學(xué)名植物明顯不同的自然分布區(qū)(而本研究中的各供試植物有相同或基本相同的自然分布區(qū))，故那三種植物不會(huì)是無(wú)學(xué)名植物的原變種或親本種。既然如此，那么就可以作出“湖北麥冬疑似種可能是山麥冬(同源四倍體)與短葶山麥冬(二倍體)雜交而產(chǎn)生的異源三倍體”這一判斷。

當(dāng)然，這一判斷還不等于說(shuō)湖北麥冬疑似種就是山麥冬(同源四倍體)與短葶山麥冬(二倍體)雜交而產(chǎn)生的異源三倍體。只有當(dāng)以后用其他技術(shù)(如核型分析技術(shù)和蛋白質(zhì)電泳技術(shù))再對(duì)上述材料進(jìn)行試驗(yàn)后，所得的結(jié)果也支持“湖北麥冬疑似種可能是山麥冬(同源四倍體)與短葶山麥冬(二倍體)雜交而產(chǎn)生的異源三倍體”這一判斷時(shí)，才可以說(shuō)：湖北麥冬疑似種就是山麥冬(同源四倍體)與短葶山麥冬(二倍體)雜交而產(chǎn)生的異源三倍體。

[1] 汪樂(lè)原，潘文.湖北麥冬的分類問(wèn)題與一種無(wú)學(xué)名植物的識(shí)別[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，14(1)：80.

[2] 中科院中國(guó)植物志編委會(huì).中國(guó)植物志：15卷[M].北京，科學(xué)出版社，1978：123-126.

[3] 楊業(yè)華.普通遺傳學(xué)[M].北京，高等教育出版社，2004：149-158.

[4] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京，中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：25.

[5] 余伯陽(yáng).中藥麥冬類的粉末顯微特征研究[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1992，23(1)：5.

[6] 周群，鄒建丘，陳家春.山麥冬屬2種藥用植物的染色體核型分析[J]，湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007(27)：295-296.

StudyonTaxonomyofASuspectedLiriopespicatavar.prolifera

PAN Wen1，WANGLeyuan2*

(1.CollegeofPharmacyHubeiUniversityofChineseMedicine，Xiangfan441000，China；2.CollegeofPharmacyHubeiUniversityofChineseMedicine，Wuhan430065，China)

Objective：To provide a ground for nomination of a kind of suspectedLiriopespicatavar.proliferaand study of medicinal value of the plant.Methods：Genetic relationship of the tested materialsis analyzed with ISSR marker.The materials consist of the kind of suspectedL.spicatavar.prolifera，some plants that any of them is possible to be the foemer’sprotovariety or parent in view of morphology and distribution，andL.spicatavar.proliferawhich is not possible to be the foemer’sprotovariety or parent but seems to be most similar to the former.The results of ISSR is converted into 0/1 to obtain the correlation coefficients of the tested plants and construct the matrixes.The matrixes were processed with the SPSS 16.0 in order clustering dendrogram.Results：10 available primers were screened from 52 ISSR primersand 141 DNA bands were amplified，of which 140 were polymorphic.The correlation coefficient between the suspected Liriopespicata var.prolifera andL.spicatavar.proliferaislarger than the correlation coefficient between the suspectedL.spicatavar.proliferaand other tested plant.Average number of the correlation coefficient between the suspectedL.picatavar.proliferaandL.spicataless than average number of the correlation coefficient between the suspected Liriopespicata var.prolifera andL.spicatavar.prolifera，and except the three species，larger than average number of the correlation coefficient between the suspectedL.spicatavar.proliferaand the rest tested plants.Similarly，the clustering dendrogramshows that firstly the suspectedL.spicatavar.proliferaandL.spicatavar.proliferatogether，then andL.spicatatogether.Conclusion：This suspectedL.spicatavar.proliferamay be allotriploid produced in the hybrid betweenL.spicata(tetraploid type)andL.muscari(diploid).The basis for such speculation is：1.the correlation coefficient between the plant andL.spicatavar.proliferais the largest，and these two plants all have the characteristics of non outcome after flowering，and the study on karyotype ofL.spicatavar.proliferaby Zhou Qun et al. showed that it is a kind of allotriploid；exactly，triploid plants have long been proved by genetics that they are incapable of sexual reproduction.2.this suspectedL.spicatavar.proliferaandL.muscariare no underground creeping stems，and the correlation coefficient between these two plants is the third largest.3.the correlation coefficient between this suspectedL.spicatavar.proliferaandL.spicatais the second largest，and anthers of these two plants are oblong.

Liriopespicatavar.prolifera；taxonomy；ISSR

2015-07-02)

湖北省衛(wèi)生廳中西醫(yī)結(jié)合課題

*

汪樂(lè)原，教授，研究方向：中藥資源與品質(zhì)；Tel：(027)68890106，E-mail：2791779976@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.5.019