楊丹，王洪禮，馬丹寧，王延年*

(1.沈陽藥科大學(xué)，沈陽 110016；2.沈陽偉嘉牧業(yè)技術(shù)有限公司，沈陽 110143)

不同發(fā)酵條件對淡豆豉中總異黃酮含量及蛋白酶活力的影響△

楊丹1，王洪禮2，馬丹寧1，王延年2*

(1.沈陽藥科大學(xué)，沈陽110016；2.沈陽偉嘉牧業(yè)技術(shù)有限公司，沈陽110143)

目的：建立淡豆豉中總異黃酮的含量測定方法，研究不同發(fā)酵條件對淡豆豉中總異黃酮及蛋白酶活力的影響。方法：采用UV法，以染料木素為標準品，在最大吸收峰261nm處測定黑豆、自然發(fā)酵的淡豆豉、米曲霉發(fā)酵的淡豆豉、黑曲霉發(fā)酵的淡豆豉中總異黃酮含量；以福林法測定蛋白酶活力。結(jié)果：黑豆中的總異黃酮的含量為7.77mg·g-1，自然發(fā)酵淡豆豉總異黃酮為8.08mg·g-1，米曲霉發(fā)酵淡豆豉總異黃酮為8.87mg·g-1，黑曲霉發(fā)酵淡豆豉總異黃酮含量為10.99mg·g-1。平均加樣回收率100.09%，100.34%，99.76%，99.87%，相對標準偏差為為1.10%，1.28%，1.22%，1.24%。酶活力測定結(jié)果為：黑豆190.7U·g-1、自然發(fā)酵淡豆豉309.4U·g-1，米曲霉發(fā)酵淡豆豉474.9U·g-1，黑曲霉發(fā)酵淡豆豉500.0U·g-1。結(jié)論：UV法作為檢驗淡豆豉中異黃酮含量的一種手段，方法簡便、準確、重現(xiàn)性好。單一菌種發(fā)酵淡豆豉異黃酮含量和酶活力均高于黑豆和自然發(fā)酵淡豆豉。

淡豆豉；總異黃酮；黑曲霉；米曲霉

中藥淡豆豉是由黑豆的成熟種子和青蒿、桑葉等中藥經(jīng)發(fā)酵加工而成，具有解表除煩、宣發(fā)郁熱等功效[1]。黑豆中含有一些抗營養(yǎng)因子，對動物的腸道結(jié)構(gòu)具有很大的破壞作用[2]。黑曲霉菌種菌絲體易成型，培養(yǎng)條件粗放，產(chǎn)酶能力強、酶系豐富，生長溫度范圍較寬，有利于常年生產(chǎn)等優(yōu)點。米曲霉是一種需氧真菌，穩(wěn)定性高，能產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶和糖化酶等多種酶，能使豆類食品中的蛋白質(zhì)和淀粉得到了較好的分解。淡豆豉中含有黑豆的多種異黃酮成分，牛麗穎等[3]曾發(fā)現(xiàn)豆豉中染料木素、大豆苷元等異黃酮成分的含量均高于原料大豆。有研究表明，異黃酮不僅能夠提高動物繁殖力，消除體內(nèi)自由基、提高免疫力，而且還能顯著地抑制霉菌毒素對動物肝功能和生長性能的影響[4-5]。目前，有關(guān)淡豆豉自然發(fā)酵的報道較多，而利用單一菌種進行發(fā)酵的研究報道較少。通過微生物法發(fā)酵黑豆，不僅可以提高黑豆中蛋白的含量，將黑豆中的大豆異黃酮糖苷直接轉(zhuǎn)化為苷元[6]，而且還可以降解黑豆中存在的抗營養(yǎng)因子、多糖和蛋白質(zhì)等，使其變成利于動物消化吸收的低分子糖、小肽和氨基酸，從而提高發(fā)酵黑豆在食品中的利用價值[7]。本實驗嘗試采用米曲霉和黑曲霉發(fā)酵黑豆，利用其霉系強大的產(chǎn)酶能力降解黑豆中的多糖和蛋白質(zhì)，使其轉(zhuǎn)化為利于消化、吸收利用的低分子糖、小肽和氨基酸，并使得發(fā)酵淡豆豉中藥效成分異黃酮類含量提高，更有利于發(fā)揮藥效。

1 材料與儀器

1.1實驗材料與試劑

黑豆，購自沈陽，經(jīng)王延年副教授鑒定為豆科植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的成熟種子。桑葉，采自沈陽，經(jīng)王延年副教授鑒定為桑科植物桑MorusalbaL.的干燥葉。青蒿，采自沈陽，經(jīng)袁久志副教授鑒定為菊科植物黃花蒿ArtemisiaannuaL.的干燥地上部分。黑曲霉孢子粉，購自濟寧長泰生物科技有限公司。米曲霉孢子粉，購自濟寧長泰生物科技有限公司。染料木素標準品(glycitin，中國食品藥品檢定研究院(批號：111704-201302)，純度均≥98%。酪氨酸，購自中國食品藥品檢定研究院(批號：140609-201513)，純度≥98%。酪蛋白，購自上海源葉生物科技有限公司(批號：YY10701)，含量(N計)≥14%。福林試劑，購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2實驗儀器

QE-100克型高速中藥粉碎機(浙江省武義縣屹立工具有限公司)；JY202型電子天平(上海浦春計量儀器有限公司)；SG3200H型超聲波清洗機(上海冠特超聲儀器有限公司)；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)；HW250B恒溫恒濕箱(天津泰斯特儀器有限公司)；酶標儀(BIO-RAD)；303-0型臺式培養(yǎng)箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠有限公司)；紫外檢測器(UV-1700)等。

2 方法與結(jié)果

2.1不同發(fā)酵工藝的淡豆豉的制備

自然發(fā)酵：取桑葉、青蒿各70～100g，加水煎煮，濾過，煎煮液拌入凈大豆1000g中，待吸盡后，蒸透，取出，稍晾，再置容器內(nèi)，用剪過的桑葉、青蒿渣覆蓋，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)悶至發(fā)酵至黃衣上遍時，取出，略蒸，干燥，即得。

黑曲霉菌種發(fā)酵：取桑葉、青蒿各70～100g，加水煎煮，濾過，煎煮液拌入凈大豆1000g中，待吸盡后，蒸透，取出，稍晾，再置容器內(nèi)，接入黑曲霉菌種，用剪過的桑葉、青蒿渣覆蓋，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)悶至發(fā)酵至黃衣上遍時，取出，略蒸，干燥，即得。

米曲霉菌種發(fā)酵：取桑葉、青蒿各70～100g，加水煎煮，濾過，煎煮液拌入凈大豆1000g中，待吸盡后，蒸透，取出，稍晾，再置容器內(nèi)，接入米曲霉菌種，用剪過的桑葉、青蒿渣覆蓋，于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)悶至發(fā)酵至黃衣上遍時，取出，略蒸，干燥，即得。

2.2標準品溶液的配制

精密稱取染料木素標準品4.1mg，80%的甲醇溶液定容至10mL容量瓶，得到0.41mg·mL-1染料木素標準儲備液。

2.3供試品溶液的配制

取黑豆、自然發(fā)酵、黑曲霉、米曲霉發(fā)酵的淡豆豉粉末1g，精密稱定，加80%甲醇溶液20mL，超聲提取2次，每次30min，濾過，用80%甲醇溶液洗滌濾渣，置50mL量瓶中，加80%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻。

2.4標準品及供試品最大吸收峰的確定

將標準品及試樣溶液在紫外光譜儀上掃描200～300nm處的吸收情況，結(jié)果得到了標準品及試樣的最大吸收峰，且在最大吸收峰周圍干擾較少，因此，將此最大吸收峰作為標準品及試樣的檢測波長。

2.5標準曲線的制備

精密吸取標準溶液0.03、0.05、0.08、0.1、0.12、0.15、0.18mL，分別定容至10mL，得線性范圍為1.23μg·mL-1～7.38μg·mL-1的濃度梯度標準溶液。以80%甲醇水溶液為空白溶液，紫外分光光度計在最大吸收波長處檢測吸光度，檢測結(jié)果見表1。以吸光度A為縱坐標，濃度(X)為橫坐標，得校正曲線方程，見圖1?；貧w方程：A=0.1078X+0.0367，R2=0.9996，表明染料木素在1.23μg·mL-1～7.38μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

表1 染料木素校正曲線與回歸方程

圖1 染料木素校正曲線與回歸方程

2.6精密度試驗

精密吸取標準品溶液0.1mL，分別置于5只10mL容量瓶中，按照2.5校正曲線下操作，測定吸收度及RSD，結(jié)果吸收度的平均值為0.471，RSD為1.63%，表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗

取黑豆、自然發(fā)酵淡豆豉、黑曲霉發(fā)酵淡豆豉、米曲霉發(fā)酵淡豆豉供試品溶液各1mL，分別置于10mL容量瓶中，分別在0、2、4、8、16、20、24h在最大吸收波長處檢測吸光度，考察供試品溶液的吸光度值及RSD。結(jié)果吸光度的平均值分別為0.207，0.213，0.226，0.278，RSD分別為0.52%，0.57%，0.82%，0.83%表明供試樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8重復(fù)性試驗

取同一批樣品5份，按照2.3供試品溶液制備項下進行制備，再分別精密吸取樣品液1mL置于10mL容量瓶中，按2.5校正曲線制備項操作，于最大吸收波長處依次測定吸光度計算供試品中的總異黃酮含量，結(jié)果總黃酮平均含量分別為7.78mg·g-1，8.06mg·g-1，8.85mg·g-1，11.10mg·g-1，RSD分別為1.24%，1.19%，1.21%，0.98%。表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.9加樣回收率

精密稱取(相當于染料木素)的已知含量的4種樣品各5份，每份2g，分別精密吸取染料木素對照品適量，按照“2.3供試品溶液制備方法”制備，在最大吸收波長處測定吸光度，并計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率實驗

通過計算結(jié)果可以得知，黑豆的平均回收率為100.09%，RSD為1.10%。自然發(fā)酵淡豆豉平均回收率為100.34%，RSD為1.28%，米曲霉發(fā)酵淡豆豉平均回收率為99.76%，RSD為1.22%，黑曲霉發(fā)酵淡豆豉平均回收率為99.87%，RSD為1.24%。

2.10試樣中異黃酮的含量測定

分別精密吸取樣品液1mL置于3只10mL容量瓶中，按2.5校正曲線制備項操作，在最大吸收波長處測得4個供試品溶液的吸光度，按校正曲線方程計算含量，并計算試樣中異黃酮的百分含量，結(jié)果見表3。

表3 試樣中異黃酮的含量

測定結(jié)果表明，黑豆中的總異黃酮含量為7.77 mg·g-1，RSD值為1.2%。黑豆中的總異黃酮含量為7.77 mg·g-1，RSD值為1.2%。黑豆中的總異黃酮含量為7.77 mg·g-1，RSD值為1.2%。自然發(fā)酵淡豆豉中的總異黃酮含量為8.08 mg·g-1，RSD值為1.0%。米曲霉發(fā)酵淡豆豉中的總異黃酮含量為8.87 mg·g-1，RSD值為1.1%。黑曲霉發(fā)酵淡豆豉中的總異黃酮含量為10.99 mg·g-1，RSD值為1.4%。

2.11蛋白酶活力的測定[8-9]

2.11.1 酪氨酸含量標準曲線的制備

酪氨酸在105 ℃干燥至恒重，精確稱取0.1g，加入一定量的HCl使其溶解，加蒸餾水定容至1000mL，取10mL容量瓶5只，按照表中將酪氨酸溶液稀釋成不同濃度。另取六只試管，編號1，加入相應(yīng)的鹽酸蒸餾水溶液1mL為空白對照，編號2～6，依次加入不同濃度的酪氨酸溶液1mL。，再分別加0.4mol·L-1碳酸鈉5mL，福林試液1mL，蒸餾水2mL，立即搖勻，置于40 ℃水浴鍋中保溫20min，顯色完全(藍色)。酶標儀與660nm波長處測定吸光度，測定三次取平均值，將2～6號管所測吸光度減去1號管的吸光度得實測值Y，結(jié)果見表4。以Y為縱坐標，酪氨酸的濃度(X)為橫坐標，作標準曲線圖，結(jié)果見圖2，回歸方程為：A=0.021 9X+0.015 2，R2=0.999 4。

表4 酪氨酸的標準曲線

圖2 酪氨酸的標準曲線

2.11.2 酶液的制備 分別稱取未發(fā)酵的與發(fā)酵后的淡豆豉5 g，充分研細，40℃干燥30 min，加水100 mL蒸餾水，置40 ℃恒溫水浴鍋中保溫1 h，攪拌，取出，離心，取上清液，即酶液。

2.11.3 蛋白酶活力測定 將酶液以PH6.8磷酸鈉緩沖液稀釋10倍，取1 mL稀釋液至離心管，于40 ℃水浴預(yù)熱5 min，同時量取適量2%酪蛋白溶液預(yù)熱5 min，精確吸取預(yù)熱過的2%酪蛋白溶液1 mL加至離心管，立即計時，保溫10 min后立即加入0.4 mol·L-1三氯醋酸溶液2 mL，終止酶的反應(yīng)，繼續(xù)于水浴中保溫20 min，使殘存蛋白質(zhì)完全沉淀，離心濾過。取1 mL濾液加至試管，加0.4 mol·L-1碳酸鈉5 mL，福林試液1 mL，蒸餾水2 mL，立即搖勻，置40 ℃水浴中保溫發(fā)色20 min，于660 nm波長測光吸收度。另取1只離心管作空白對照，取1 mL稀釋酶液，先加入2 mL三氯醋酸使酶失活，再加入2%酪蛋白1 mL，其他步驟同前。樣品分別測定3次。測定結(jié)果見表5。

表5 樣品中蛋白酶活力測定

通過測定結(jié)果可得，黑豆的蛋白酶活力為190.7 U·g-1，自然發(fā)酵淡豆豉的蛋白酶活力為309.4 U·g-1，米曲霉發(fā)酵淡豆豉的蛋白酶活力為474.9 U·g-1，黑曲霉發(fā)酵淡豆豉的蛋白酶活力為500.0 U·g-1

3 討論

3.1總異黃酮檢測波長的確定

將標準品及試樣溶液在UV-1700紫外分光光度計上掃描200～300nm處的吸收情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)標準品及試樣均在261nm處有最大吸收，且最大吸收峰周圍均干擾較少。故選擇將261nm作為染料木素含量測定的檢測波長。

3.2不同發(fā)酵條件對淡豆豉中總異黃酮含量的影響

通過對黑豆、自然發(fā)酵淡豆豉、黑曲霉發(fā)酵淡豆豉、米曲霉發(fā)酵淡豆豉中總異黃酮含量比較發(fā)現(xiàn)，黑豆中的總異黃酮的含量最少只有7.77mg·g-1，自然發(fā)酵淡豆豉總異黃酮含量為8.08mg·g-1，米曲霉發(fā)酵淡豆豉總異黃酮含量為8.87mg·g-1，黑曲霉發(fā)酵淡豆豉總異黃酮含量最多為10.99mg·g-1.利用黑曲霉和米曲霉發(fā)酵淡豆豉總異黃酮的含量均較高于黑豆和自然發(fā)酵淡豆豉的含量。這可能是大豆在發(fā)酵過程中微生物消耗了黑豆中部分蛋白質(zhì)和淀粉，而黑豆次生代謝產(chǎn)物損失較少，從而發(fā)酵豆制品總異黃酮相對含量增加。經(jīng)過研究對比，確定用一種簡單易行的紫外分光光度法對其主要有效成分異黃酮類成分進行測定，建立了一種淡豆豉的質(zhì)量控制標準。本法簡便、快速、選擇性好、線性范圍寬、重復(fù)性好、能全面反映樣品中大豆異黃酮的總含量，適用于淡豆豉中總異黃酮的質(zhì)量檢測和測定，尤其是生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制。

3.3不同發(fā)酵條件對淡豆豉中酶活力的影響

淡豆豉為常用藥食同源物質(zhì)，其最新報道有降血糖、降血脂的作用，但有關(guān)淡豆豉不同菌種發(fā)酵中總異黃酮以及酶活力的質(zhì)量分析報道較少。筆者研究得出，黑豆中的蛋白酶活力為190.7U·g-1、自然發(fā)酵淡豆豉的酶活力為309.4U·g-1、米曲霉發(fā)酵淡豆豉的酶活力為474.9U·g-1、黑曲霉發(fā)酵淡豆豉的酶活力為500.0U·g-1。淡豆豉的酶活力測定，也可以作為其發(fā)酵過程控制指標之一。

研究表明，利用接單一菌種發(fā)酵法處理淡豆豉成本低，對黑豆的營養(yǎng)成分破壞較小，可以提高蛋白質(zhì)含量，同時還能夠降解黑豆中存在的一些抗營養(yǎng)因子，提高黑豆的營養(yǎng)價值。相比于米曲霉，黑曲霉發(fā)酵淡豆豉不產(chǎn)生真菌毒素，菌絲體易形成，有更加豐富的酶系，已成為淡豆豉生產(chǎn)新工藝研究的熱點。

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EffectofdifferentfermentationstrainsontotalisoflavonecontentandProteaseactivityinsemensojaepraeparatum

YANGDan1，WANGHongli2，MADanning1，WANGYannian2*

(1.Shenyangpharmaceuticaluniversity，Shenyang110016,China；2.ShenyangvicahusbandryandtechnologyCo；Ltd，Shenyang110143,China)

Objective：A UV spectrophotometry used for determination of semen sojae praeparatum isoflavones was established.The effects of different fermentation strains on the content of total isoflavones and protease activity in the fermentation products was studied.Methods：Genistein was selected as the reference substance.Contents of the isoflavones in black bean and semen sojae praeparatum by natural fermentation，Aspergillus oryzae fermentation，Aspergillus niger fermentation at the maximum absorption peak.Folin method was used for determination of protease activity.Results：The total content of isoflavones in black bean was7.77mg·g-1，natural fermentation products was8.08mg·g-1，Aspergillus oryzae fermentation products was8.87mg·g-1，Aspergillus Niger fermentation products was10.99mg·g-1，average recovery was100.09%，100.34%，99.76%，99.87%，and the RSD was1.10%，1.28%，1.22%，1.24%.The enzyme activity of black beans was190.7U·g-1，natural fermentation products was309.4U·g-1，Aspergillus oryzae fermentation was474.9U·g-1，Aspergillus Niger fermentation was500.0U·g-1.Conclusion：UV method as a means of inspection semen sojae praeparatum isoflavone content with easy—to—handle，good accuracy and reproducibility.The single strain fermentation of semen sojae praeparatum，in enzyme activity and isoflavone content respects，were higher than the natural fermentation products and black bean.

Semen sojae praeparatum；Total isoflavones；Aspergillus oryzae；Aspergillus niger

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.006

2016-03-22)

國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)專項“六神曲等7種中藥發(fā)酵技術(shù)及規(guī)范化應(yīng)用研究”(任務(wù)編號：201507004-03)

*

王延年，副教授，碩士生導(dǎo)師；研究方向：中藥炮制機理及中藥材質(zhì)量控制研究/中藥活性化學(xué)成分研究/中藥發(fā)酵機理及新型飲片研究；Tel：13998277936，E-mail：3a4n@sina.com