劉金鳳，黃鵬，柳亦松，劉秀斌，曾建國，3*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

博落回屬植物內(nèi)生真菌種類與分布差異△

劉金鳳1，2，黃鵬1，2，柳亦松2，3，劉秀斌1，2，曾建國1，2，3*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

目的：探索博落回屬植物內(nèi)生真菌的種類與多樣性，為發(fā)現(xiàn)影響博落回次生代謝產(chǎn)物的內(nèi)生真菌提供前期研究基礎(chǔ)。方法：采用組織培養(yǎng)法從博落回屬植物根部組織中分離純化內(nèi)生真菌，利用分子生物學(xué)和常規(guī)的形態(tài)學(xué)方法對分離出的內(nèi)生真菌進(jìn)行分類鑒定。結(jié)果：共分離純化67株內(nèi)生真菌，其中博落回中分離到40株，而小果博落回中得到27株內(nèi)生真菌。發(fā)現(xiàn)Coniothyrium為博落回根部特有的內(nèi)生真菌，Botryosphaeria、Chaetomium和Phyllosticta屬菌株為小果博落回特有菌株。結(jié)論：博落回屬植物內(nèi)生菌多樣性與博落回屬植物的地理分布差異、博落回屬植物之間的差異有關(guān)。

博落回屬；內(nèi)生真菌；多樣性；分子鑒定

植物內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)是指生活在植物組織內(nèi)，卻對其宿主沒有產(chǎn)生明顯病害癥狀的微生物[1]。目前，關(guān)于植物內(nèi)生真菌的研究主要集中在以下幾個(gè)方面：對內(nèi)生真菌抑菌和抗癌次生代謝產(chǎn)物的篩選與發(fā)掘[2-3]；內(nèi)生真菌對宿主次生代謝產(chǎn)物的調(diào)控作用機(jī)制[4-6]；內(nèi)生真菌提高植物宿主的競爭性[7-8]；植物宿主中不同部位的內(nèi)生真菌分布規(guī)律[9-10]；內(nèi)生真菌對植物生長的促進(jìn)作用[11]。

博落回Macleayacordata(Willd.) R.Br.與小果博落回Macleayamicrocarpa(Maxim.) Fedde.屬于罌粟科博落回屬植物。該種屬植物主要分布于東亞、北美洲和歐洲[12]。博落回屬植物作為一種傳統(tǒng)中草藥最早見于《本草拾遺》?，F(xiàn)代藥理研究表明博落回屬植物中4種主要生物堿(原阿片堿、別隱品堿、白屈菜紅堿、血根堿)具有顯著的生物活性，其中血根堿對治療多種炎癥有效，對畜禽類有較好的腸道菌群調(diào)節(jié)作用，目前已經(jīng)作為飼用抗菌藥的替代品在歐洲等地區(qū)廣泛銷售[13]。博落回與小果博落回的形態(tài)差別主要在果莢部分，博落回果莢呈倒卵形而小果博落回果莢呈近圓形。前期研究顯示博落回與小果博落回中的4種主要生物堿(原阿片堿、別隱品堿、白屈菜紅堿、血根堿)具有組織特異性[12，14]。其中血根堿和白屈菜紅堿主要分布在博落回的果莢和小果博落回的葉片中，而原阿片堿和別隱品堿主要分布在博落回葉片、根和小果博落回果莢中。兩者在地理分布上也呈現(xiàn)特異性，博落回在我國主要分布在湖南、安徽、江蘇、浙江、廣西、海南、廣東及四川等地。而小果博落回主要分布在山西東南部、江蘇北部、江西西南部、河南西部和北部、湖北西部、陜西南部至東南部、甘肅東南部、四川東北部等地[15]。由于博落回和小果博落回存在地理分布與代謝產(chǎn)物分布的差異，這些因素也許會(huì)對其內(nèi)生真菌的分布產(chǎn)生影響，或者這種分布差異本身就有內(nèi)生菌參與到其中。因此，對于博落回屬植物內(nèi)生真菌分布差異的研究具有一定的價(jià)值。本研究采集了全國3個(gè)不同產(chǎn)地的博落回的根部與3個(gè)不同產(chǎn)地的小果博落回的根部進(jìn)行內(nèi)生菌分離，對其種類和分布進(jìn)行研究，從而為博落回內(nèi)生真菌資源利用提供依據(jù)。

1 材料

健康博落回植株根部材料，采集地點(diǎn)分別為安徽省祁門縣、福建光澤縣、浙江開化縣。健康小果博落回植株根部材料，采集地點(diǎn)分別為湖北南漳縣、河南洛陽、陜西戶縣。采集根部時(shí)連帶土樣一起挖出，放入無菌紙袋。

氯霉素麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基(海博生物公司)。

2 方法

2.1樣本與處理

流水沖刷根部表面，用軟毛輕輕刷去根部泥土。再用超聲波清洗儀超聲10 min后取出，用超純水沖洗，晾干備用。

2.2內(nèi)生真菌的分離與純化

取預(yù)處理后博落回的根，自來水洗凈，裝入無菌三角瓶中進(jìn)行表面消毒，程序依次為：無菌水沖洗3次→75%乙醇浸泡1 min→無菌水沖洗3次→2%次氯酸鈉浸泡10 min→無菌水沖洗3次→75%乙醇浸泡30 s→無菌水沖洗3次→用滅菌濾紙干燥表面水分。將根部樣品用手術(shù)刀切割成2 cm×2 cm的小塊，接種到分離培養(yǎng)基上，每皿接6塊，重復(fù)3皿。26 ℃恒溫箱培養(yǎng)，定時(shí)觀察真菌生長情況。

每3天取出平板，及時(shí)轉(zhuǎn)接生長出的真菌，持續(xù)20 d。待長出菌落后挑取菌落頂端菌絲接入斜面培養(yǎng)基中，并轉(zhuǎn)管純化，將純化后不同的菌株編號，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。同時(shí)，將消毒樣品最后一步漂洗的無菌水置培養(yǎng)平板上同樣條件進(jìn)行培養(yǎng)作為空白對照。

2.3內(nèi)生菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 在載玻片上固定檢測樣本后，顯微鏡下觀察孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和菌絲形態(tài)等特征，根據(jù)形態(tài)特征鑒定內(nèi)生真菌。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 采用CTAB法提取所得內(nèi)生真菌的DNA，并作為模板，以通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司純化和測序。擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行Blast分析，選取與目標(biāo)菌株相似度較高的菌株序列，使用Clustal軟件進(jìn)行多序列比對；運(yùn)用MEGA5.0軟件對計(jì)算后的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。(N-J法，Bootstrap重復(fù)1000次，Kimura-2-parameter)[16]。

2.4統(tǒng)計(jì)分析方法

采用Simpson指數(shù)D=1-∑(Ni/N)2分析內(nèi)生真菌的菌群多樣性。

3 結(jié)果與分析

3.1博落回屬植物根部內(nèi)生真菌的分離與純化

6個(gè)不同產(chǎn)地的博落回屬植物根部中共分離出67株內(nèi)生真菌，其中博落回中分離出40株內(nèi)生真菌，占全部內(nèi)生真菌的59%；小果博落回中分離出27株內(nèi)生真菌，占全部內(nèi)生真菌的41%?？瞻讓φ战M培養(yǎng)皿中未生長微生物，表明菌種分離過程中的消毒和培養(yǎng)過程是合理可靠的，分離得到的真菌均來自于博落回組織內(nèi)部，而非環(huán)境中污染的真菌。由于有的培養(yǎng)基中生長不止一種菌株，所以對菌株進(jìn)行純化。用接種環(huán)挑取內(nèi)生真菌菌絲并接種到新的PDA培養(yǎng)基中，至純化出單菌落。

3.2博落回屬植物根部內(nèi)生真菌的分子鑒定

對不同產(chǎn)地的博落回與小果博落回內(nèi)生真菌進(jìn)行分子鑒定，安徽祁門產(chǎn)的博落回分離出18株內(nèi)生真菌，隸屬于5個(gè)屬。福建光澤產(chǎn)的博落回分離出10株內(nèi)生真菌，隸屬于3個(gè)屬。浙江開化產(chǎn)的博落回分離出12株內(nèi)生真菌，隸屬于2個(gè)屬。見表1和表2。

表1 不同產(chǎn)地博落回根部內(nèi)生真菌的分類

表2 不同產(chǎn)地博落回根部內(nèi)生真菌的分布

湖北南漳產(chǎn)的小果博落回分離出的12株內(nèi)生真菌隸屬于4個(gè)屬。河南洛陽產(chǎn)的小果博落回分離出的8株內(nèi)生真菌隸屬于3個(gè)屬。陜西戶縣產(chǎn)的小果博落回分離出的7株內(nèi)生真菌隸屬于6個(gè)屬。見表3和表4。

表3 不同產(chǎn)地小果博落回根部內(nèi)生真菌的分類

表4 不同產(chǎn)地小果博落回根部內(nèi)生真菌的分布

3.3博落回屬植物根部內(nèi)生真菌的分布與多樣性分析 博落回的內(nèi)生真菌中，從產(chǎn)地分布來看，以安徽祁門產(chǎn)地中分離到的內(nèi)生真菌最多，共18株，5個(gè)屬。福建光澤產(chǎn)地中分離到的內(nèi)生真菌最少，共10株，3個(gè)屬(見表2)。其中Fusarium、Coniothyrium和Peyronellaea屬菌株為安徽祁門產(chǎn)地特有菌株，而Penicillium屬菌株為各個(gè)產(chǎn)地分布最廣的菌株。Simpson多樣性指數(shù)(D)顯示，安徽祁門博落回(0.82)>福建光澤博落回(0.62)>浙江開化博落回(0.48)，結(jié)果見表2。

小果博落回的內(nèi)生真菌中，從產(chǎn)地分布來看，以湖北南漳產(chǎn)地中分離到的內(nèi)生真菌最多，共12株，4個(gè)屬；陜西戶縣產(chǎn)地中分離到的內(nèi)生真菌最少，共7株，6個(gè)屬；其中Botryosphaeria、Chaetomium和Phyllosticta屬菌株為陜西戶縣產(chǎn)地特有菌株，而Nigrospora屬菌株為各個(gè)產(chǎn)地分布最廣的菌株。Simpson多樣性指數(shù)(D)顯示，陜西戶縣小果博落回(0.82)>湖北南漳小果博落回(0.74)>河南洛陽小果博落回(0.66)，結(jié)果見表4。

3.4博落屬植物根部內(nèi)生真菌的多樣性差異分析

對比博落回與小果博落回根部內(nèi)生真菌的分類結(jié)果發(fā)現(xiàn)，博落回中安徽祁門產(chǎn)地特有的Chaetomium菌株在3個(gè)產(chǎn)地的小果博落回中都不存在。而在3個(gè)產(chǎn)地博落回中不存在的Botryosphaeria、Chaetomium和Phyllosticta屬菌株在小果博落回中均存在。從種屬分布的多樣性上看，小果博落回比博落回要豐富。

4 討論

由于博落回屬植物目前還無法大規(guī)模人工種植，所以目前的資源主要來自野生博落回屬植物。因此此次實(shí)驗(yàn)選擇的樣本均來自于野外，而且在選擇采樣樣本時(shí)刻意選擇地域差異很大的地區(qū)，這也是為了研究不同野生環(huán)境對博落回屬植物內(nèi)生真菌分布的影響。由于博落回屬植物是多年生的大型草本植物，且每年冬季只有地上部分會(huì)枯萎，所以根部組織中內(nèi)生真菌的多樣性是最豐富的，也是受環(huán)境影響最大的部位。因此，我們專門針對博落回屬植物的根部組織采樣并進(jìn)行內(nèi)生真菌多樣性分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同產(chǎn)地博落回屬植物之間以及博落回與小果博落回之間根部內(nèi)生真菌的分布多樣性上都存在著顯著差異，該結(jié)果說明環(huán)境因素和宿主因素對博落回屬植物內(nèi)生真菌的分布有較大的影響。

博落回中主要的生物堿有4種(血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、別隱品堿)，前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)博落回與小果博落回的生物堿分布呈現(xiàn)組織特異性[12，14]。兩者的果莢和葉片中的4種生物堿含量呈現(xiàn)有趣的交叉現(xiàn)象：博落回果莢組織的血根堿和白屈菜紅堿含量最高，而葉片中原阿片堿和別隱品堿含量最高。小果博落回中的情況則相反，果莢的原阿片堿和別隱品堿含量最高，而葉片中血根堿和白屈菜紅堿含量最高。前期研究結(jié)果推測根部是博落回屬植物中BIA類生物堿累積和合成的主要場所，葉片和果莢中的生物堿是經(jīng)由莖部組織輸送過來的。他們之間的差異主要是由于合成相關(guān)代謝產(chǎn)物的功能基因在不同部位表達(dá)差異導(dǎo)致的[12]。而不同產(chǎn)地的博落回之間4種生物堿差異也較大[17-20]，因此，外部環(huán)境和宿主體內(nèi)的內(nèi)生真菌也造成了次生代謝產(chǎn)物的差異[6]。有研究表明造成這種情況可能的原因有兩個(gè)，一個(gè)是內(nèi)生真菌經(jīng)過與宿主長期的相互作用會(huì)對其次生代謝產(chǎn)物合成的功能基因轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生影響；另一個(gè)原因就是部分內(nèi)生真菌對宿主次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生了耐受現(xiàn)象，從而在宿主體內(nèi)對抗其競爭對手[4]。除了內(nèi)生真菌會(huì)對宿主產(chǎn)生影響外，宿主本身也會(huì)對內(nèi)生真菌產(chǎn)生重要的影響。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)宿主會(huì)利用本身的次生代謝產(chǎn)物來影響其體內(nèi)內(nèi)生真菌的種群組成和多樣性[21]。

研究顯示，不同產(chǎn)地的博落回植株的遺傳多樣性較低[22]。目前博落回內(nèi)生真菌的研究主要集中在次生代謝產(chǎn)物內(nèi)生真菌的篩選和具有抗菌活性內(nèi)生真菌的篩選上[23-25]，而沒有涉及到不同產(chǎn)地和博落回屬植物之間內(nèi)生真菌的差異研究[26]。本研究對不同產(chǎn)地博落回屬植物根部的內(nèi)生真菌進(jìn)行了比較，顯示博落回與小果博落回內(nèi)生真菌的多樣性差異與宿主和內(nèi)生真菌之間的相互作用關(guān)系密不可分，這對于找尋可能存在的調(diào)控代謝產(chǎn)物的內(nèi)生真菌具有重要意義。

[1]StrobelSA，StrobelGA.Plantendophytesasaplatformfordiscovery-basedundergraduatescienceeducation[J].NatChemBiol，2007，3(7)：356-359.

[2]PuX，QuX，ChenF，etal.Camptothecin-producingendophyticfungusTrichodermaatrovirideLY357：isolation，identification，andfermentationconditionsoptimizationforcamptothecinproduction[J].ApplMicrobiolBiotechnol，2013，97(21)：9365-9375.

[3]SolimanSS，RaizadaMN.InteractionsbetweenCo-HabitatingfungiElicitSynthesisofTaxolfromanEndophyticFungusinHostTaxusPlants[J].FrontMicrobiol，2013，4：3.

[4]SolimanSS，TrobacherCP，TsaoR，etal.Afungalendophyteinducestranscriptionofgenesencodingaredundantfungicidepathwayinitshostplant[J].BMCPlantBiol，2013，13：93.

[5]OlaAR，ThomyD，LaiD，etal.InducingsecondarymetaboliteproductionbytheendophyticfungusFusariumtricinctumthroughcoculturewithBacillussubtilis[J].JNatProd，2013，76(11)：2094-2099.

[6]KusariS，ZuhlkeS，SpitellerM.EffectofartificialreconstitutionoftheinteractionbetweentheplantCamptothecaacuminataandthefungalendophyteFusariumsolanioncamptothecinbiosynthesis[J].JNatProd，2011，74(4)：764-775.

[7]KhanAL，HamayunM，KangSM，etal.Endophyticfungalassociationviagibberellinsandindoleaceticacidcanimproveplantgrowthunderabioticstress：anexampleofPaecilomycesformosusLHL10[J].BMCMicrobiol，2012，12：3.

[8]SaariS，F(xiàn)aethSH.HybridizationofNeotyphodiumendophytesenhancescompetitiveabilityofthehostgrass[J].NewPhytol，2012，195(1)：231-236.

[9]GlennA，BodriMS.FungalendophytediversityinSarracenia[J].PLoSOne，2012，7(3)：e32980.

[10]SandbergDC，BattistaLJ，ArnoldAE.Fungalendophytesofaquaticmacrophytes：diversehost-generalistscharacterizedbytissuepreferencesandgeographicstructure[J].MicrobEcol，2014，67(4)：735-747.

[11]YouYH，YoonH，KangSM，etal.FungaldiversityandplantgrowthpromotionofendophyticfungifromsixhalophytesinSuncheonBay[J].JMicrobiolBiotechnol，2012，22(11)：1549-1556.

[12]ZengJ，LiuY，LiuW，etal.Integrationoftranscriptome，proteomeandmetabolismdatarevealsthealkaloidsbiosynthesisinMacleayacordataandMacleayamicrocarpa[J].PLoSOne，2013，8(1)：e53409.

[13]WindischW，SchedleK，PlitznerC，etal.Useofphytogenicproductsasfeedadditivesforswineandpoultry[J].JAnimSci，2008，86(14)：E140-E148.

[14] 郭宇鴿，曾建國，談滿良，等.博落回葉與小果博落回葉中4種生物堿的含量比較[J].中南藥學(xué)，2011，9(11)：829-832.

[15] 蘆強(qiáng)，彭瓊，李炎林，等.不同激素對博落回愈傷組織血根堿代謝累積水平的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014(9)：20-24.

[16]FelsensteinJC.limitsonphylogenies：anapproachusingthebootstrap[J].Evolution，1985，39(4)：783-791.

[17] 陳應(yīng)莊.博落回屬植物中芐基異喹啉類生物堿代謝組學(xué)研究[D].長沙：湖南師范大學(xué)，2008.

[18] 劉秀斌.博落回屬植物中生物堿代謝累積研究[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[19] 郭宇鴿.小果博落回葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其不同產(chǎn)地指紋圖譜研究[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[20] 鄒惠亮，何家希，趙晶晶，等.不同產(chǎn)地博落回各部位血根堿與白屈菜紅堿含量分析[J].暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版)，2015，36(4)：290-293.

[21]SaundersM，KohnLM.Evidenceforalterationoffungalendophytecommunityassemblybyhostdefensecompounds[J].NewPhytol，2009，182(1)：229-238.

[22] 朱鵬程，柳亦松，黃鵬，等.博落回SSR引物的開發(fā)以及遺傳多樣性分析[J].生命科學(xué)研究，2013，17(2)：120-124.

[23] 汪學(xué)軍，閔長莉，殷智超，等.博落回內(nèi)生放線菌的分離及活性菌株的鑒定[J].中藥材，2014,37(11)：1947-1950.

[24] 閔長莉，汪學(xué)軍，趙夢凡，等.博落回內(nèi)生真菌的分離及產(chǎn)血根堿菌株的篩選[J].中國中藥雜志，2014，39(22)：4288-4292.

[25] 閔長莉，王允，汪學(xué)軍.博落回內(nèi)生真菌的分離及其抗菌活性的初步研究[J].皖西學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，28(2)：4-6.

[26] 賈曉，葉佑丕，盧東升.博落回內(nèi)生真菌種類與分布[J].信陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2011，24(4)：487-489.

EndophyticFungiSpeciesandDistributionDifferencesinMacleayaspp.

LIUJinfeng1，2，HUANGPeng1，2，LIUYisong2，3，LIUXiubin1，2，ZENGJianguo1，2，3*

(1.Horticulture&LandscapeCollegeofHunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；2.NationalandLocalUnionEngineeringResearchCenterfortheVeterinaryHerbalMedicineResourcesandInitiative，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China；3.VeterinaryFacultyofHunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China)

Objective：The study was explored the species and diversity of fungal endophytes inMacleayaspp.to provide an initial research base for fungal endophytes which have an impact onMacleayaspp.secondary metabolites.Methods：Fungal endophytes were isolated and purified by tissue cultivation from the root ofMacleayaspp.and were classified and identified by molecular biology and morphology.Results：67 fungal endophytes ofMacleayaspp.were obtained，40 strains isolated fromMacleayacordataand 27 strains isolated fromM.microcarpa.Coniothyriumwas the specific fungi from the root ofM.cordata.Botryosphaeria、ChaetomiumandPhyllostictawere specific strains inM.microcarpa.Conclusion：The diversity and distribution differences of fungal endophytes fromMacleayaspp.associated with the geographical distribution difference and the differences between species ofMacleayaspp..

Macleayaspp.；fungal endophyte；diversity；molecularidentification

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.016

2016-04-27)

國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地開放項(xiàng)目(15KFXM09)；國家自然科學(xué)基金(31200615)；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(CX2014B302)

*

曾建國，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向：飼用植物與中獸藥創(chuàng)制；Tel：(0731)84673824，E-mail：ginkgo@world-way.net