田瑜，黎云燕

(天津醫(yī)科大學(xué) 第二醫(yī)院 藥學(xué)部，天津 300211)

·基礎(chǔ)研究·

風(fēng)濕骨痛膠囊對(duì)炎性反應(yīng)的影響

田瑜1，黎云燕*

(天津醫(yī)科大學(xué) 第二醫(yī)院 藥學(xué)部，天津 300211)

目的：探究風(fēng)濕骨痛膠囊對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。方法：給藥前將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組，風(fēng)濕骨痛膠囊高、中、低劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組，將各組大鼠后肢右足跖皮下注射角叉菜膠，測(cè)量致炎大鼠足跖腫脹百分率。腹腔注射羧甲基纖維素鈉溶液，于顯微鏡下計(jì)洗出液白細(xì)胞總數(shù)。小鼠腹腔注射醋酸溶液，記錄第1次扭體反應(yīng)的時(shí)間(即潛伏期)及10 min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)的次數(shù)。將小鼠放置于(55±0.5)℃的熱板上，測(cè)定痛閾值。結(jié)果：與模型組比較，風(fēng)濕骨痛膠囊高、中、低劑量組隨著致炎時(shí)間的延長(zhǎng)腫脹率均持續(xù)降低(P<0.05，P<0.01)，白細(xì)胞游走數(shù)顯著減少(P<0.01)。小鼠鎮(zhèn)痛潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.05)，扭體次數(shù)明顯減少(P<0.01)，小鼠痛閾值明顯提高(P<0.01)。結(jié)論：風(fēng)濕骨痛膠囊對(duì)炎性反應(yīng)具有良好的抑制作用。

風(fēng)濕骨痛膠囊；抗炎；鎮(zhèn)痛；消腫

炎癥是機(jī)體為應(yīng)對(duì)各種致炎因素侵犯所引起的自身防御反應(yīng)，誘導(dǎo)血液中的白細(xì)胞和免疫因子向感染組織游走，聚集及吞噬，毛細(xì)血管通透性增加，引起炎癥組織周圍紅腫，疼痛和發(fā)熱[1]。風(fēng)濕骨痛膠囊具有溫經(jīng)散寒、消腫止痛、通筋活絡(luò)等功效，由制川烏、制草烏、紅花、甘草、木瓜、烏梅、麻黃7種中藥配伍組成。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)炎癥組織隨時(shí)間變化的發(fā)展趨勢(shì)及鎮(zhèn)痛藥理活性，探究風(fēng)濕骨痛膠囊對(duì)炎性反應(yīng)的干預(yù)作用，不僅有助于及早緩解炎癥反應(yīng)，也為臨床藥物多樣性的選擇提供重要參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物

Wistar雄性大鼠，體重180～220 g，二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)；雌性昆明種小鼠，體重18～22 g，二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)；均購(gòu)自天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(津)2014-0012。動(dòng)物室溫度：(22±3)℃，濕度：(67±5)%，通風(fēng)良好，自然光照。

1.2 藥品與試劑

風(fēng)濕骨痛膠囊(安徽精方藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20140425)；地塞米松片(山西亨瑞達(dá)制藥有限公司，批號(hào)：20131205)；阿司匹林片(上海信誼藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20131125)；角叉菜膠(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，批號(hào)：0001306592)；以10%羧甲基纖維素鈉配制成混懸液，實(shí)驗(yàn)劑量以顆粒表示。其他試劑有冰醋酸、0.9%氯化鈉溶液等。

1.3 儀器

BS110S電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；DM1000光學(xué)顯微鏡(北京萬(wàn)泰恒通國(guó)際科貿(mào)有限公司)；YLS-7B足跖容積測(cè)量?jī)x(上海欣曼科教設(shè)備有限公司)；BAT-2肛溫計(jì)(深圳市萬(wàn)博儀器儀表有限公司)，RB-200智能熱板儀(成都泰盟科技有限公司)。

2 方法

2.1 大鼠角叉菜膠足跖腫脹實(shí)驗(yàn)

取體重(200±20)g雄性Wistar大鼠50只，每組10只，將大鼠分為空白對(duì)照組，灌胃給予等體積0.9%氯化鈉溶液；地塞米松片組，灌胃給予0.019 g·kg-1；風(fēng)濕骨痛膠囊高、中、低劑量組(分別灌服1.0、0.5、0.25 g·kg-1)。大鼠在造模前按上述劑量給藥，每日1次，連續(xù)給藥1周，末次灌胃30 min后，將每只大鼠后肢右足跖皮下注射1%角叉菜膠0.05 mL，分別測(cè)量1、2、4、6、8 h致炎前后大鼠足跖周長(zhǎng)變化，計(jì)算得出腫脹率[2]。腫脹率(%)=(致炎后足跖周長(zhǎng)-致炎前足跖周長(zhǎng))/致炎前足跖周長(zhǎng)×100%。

2.2 大鼠腹腔白細(xì)胞游走實(shí)驗(yàn)

取體重(200±20)g雄性Wistar大鼠50只，每組10只，將大鼠分為空白對(duì)照組(灌胃給予等體積0.9%氯化鈉溶液)；地塞米松片組(灌胃給予0.019 g·kg-1)；風(fēng)濕骨痛膠囊高、中、低劑量組(分別灌服1.0、0.5、0.25 g·kg-1)。大鼠在造模前按上述劑量給藥，每日1次，連續(xù)灌胃2周后，腹腔注射1%羧甲基纖維素鈉溶液0.5 mL，3 h后處死大鼠，每鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液5 mL洗腹腔內(nèi)容物，輕揉腹部，抽取腹腔液滴于白細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，以加滿白細(xì)胞計(jì)數(shù)板為準(zhǔn)，靜置2～3 min，待白細(xì)胞下沉，在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央放置計(jì)數(shù)專用的蓋玻片，排除氣泡，置顯微鏡下計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)的白細(xì)胞總數(shù)。壓線的白細(xì)胞只計(jì)數(shù)在上線和左線者，對(duì)于細(xì)胞團(tuán)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)[3]。在低倍鏡下，白細(xì)胞呈圓形、漿透亮、核呈紫黑色、稍有折光，借此特點(diǎn)可與雜質(zhì)相區(qū)別。白細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mL)=(4大格細(xì)胞總數(shù)/4)×104×10。

2.3 風(fēng)濕骨痛膠囊對(duì)醋酸所致小鼠腹痛的影響

取體重18～22 g健康小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，分為空白對(duì)照組(給予等體積0.9%氯化鈉溶液)；阿司匹林組(灌胃給予0.2 g·kg-1)；風(fēng)濕骨痛膠囊高、中、低劑量組(分別灌胃給予1.4、0.70、0.35 g·kg-1)。每天灌胃1次，連續(xù)灌胃7 d。于末次給藥30 min后，每只鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL/只，記錄各組小鼠出現(xiàn)第1次扭體反應(yīng)的時(shí)間(即潛伏期)及10 min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)的次數(shù)(腹部收縮內(nèi)凹、伸展后肢、臀部抬高、蠕行)[2]。鎮(zhèn)痛百分率(%)=(空白對(duì)照組小鼠扭體次數(shù)-給藥組小鼠扭體次數(shù))/空白對(duì)照組小鼠扭體次數(shù)×100%。

2.4 風(fēng)濕骨痛膠囊對(duì)熱板法所致小鼠的鎮(zhèn)痛作用

取體重18～22g雌性小鼠放置于(55±0.5)℃的熱板上，測(cè)定2次(間隔30 min)，取均值作為給藥前痛閾值(小鼠自投入熱板儀至出現(xiàn)舔后足的時(shí)間)。2次中有1 次痛閾值5～30 s內(nèi)不出現(xiàn)疼痛反應(yīng)(舔后足或逃避)者棄之不用。記錄符合要求的小鼠痛閾值；取符合要求的小鼠50只隨機(jī)分為5組，空白對(duì)照組給予等體積0.9%氯化鈉溶液；阿司匹林組灌胃給予0.2 g·kg-1；風(fēng)濕骨痛膠囊高劑量組灌胃給予1.4 g·kg-1；風(fēng)濕骨痛膠囊中劑量組灌胃給予0.70 g·kg-1；風(fēng)濕骨痛膠囊低劑量組灌胃給予0.35 g·kg-1。每天灌胃1次，連續(xù)灌胃7 d，末次給藥分別測(cè)藥后0.5、l、1.5 h的痛閾值，若60 s內(nèi)不出現(xiàn)疼痛反應(yīng)者，按60 s計(jì)算，不再繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，以免燙傷小鼠足掌，影響下次觀察[4]。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

3 結(jié)果

3.1 風(fēng)濕骨痛膠囊對(duì)大鼠足趾腫脹率的影響

通過(guò)腫脹率公式計(jì)算大鼠足跖致炎后腫脹百分率。由表1所示，與空白對(duì)照組1 h比較，空白對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)大鼠足跖腫脹率隨時(shí)間延長(zhǎng)呈持續(xù)性加重。與空白對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)比較，各給藥組大鼠足跖腫脹率隨時(shí)間延長(zhǎng)顯著降低(P<0.05，P<0.01)，尤以6 h和8 h消腫明顯，且高劑量組療效最好。與地塞米松組比較，風(fēng)濕骨痛膠囊高、中、低劑量組1 h差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，2、4 h差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，大鼠后足跖腫脹率遠(yuǎn)高于地塞米松組，與地塞米松組6、8 h比較，風(fēng)濕骨痛膠囊中、低劑量組仍持續(xù)顯著性升高(P<0.05)，但高劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 風(fēng)濕骨痛膠囊對(duì)大鼠角叉菜膠足腫脹的影響

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與1 h比較，#P<0.05，##P<0.01；與地塞米松組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；下同。

3.2 風(fēng)濕骨痛膠囊對(duì)大鼠腹腔白細(xì)胞游走的影響

如表2所示，與空白對(duì)照組比較，風(fēng)濕骨痛膠囊各給藥組腹腔白細(xì)胞計(jì)數(shù)均有不同程度降低，尤以風(fēng)濕骨痛膠囊中、高劑量組降低顯著(P<0.01)。與地塞米松組比較，風(fēng)濕骨痛膠囊中、低劑量組白細(xì)胞數(shù)顯著性升高(P<0.01，P<0.05)，風(fēng)濕骨痛膠囊高劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.3 風(fēng)濕骨痛膠囊對(duì)醋酸致痛小鼠的鎮(zhèn)痛作用

如表3所示，與空白對(duì)照組比較，風(fēng)濕骨痛膠囊高、中、低劑量組及阿司匹林組疼痛潛伏期均顯著性延長(zhǎng)，扭體次數(shù)隨給藥劑量增加呈劑量依賴性減少(P<0.05，P<0.01)，鎮(zhèn)痛百分率依次升高。與阿司匹林組比較，風(fēng)濕骨痛膠囊中、低劑量組潛伏期差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，風(fēng)濕骨痛膠囊高劑量組潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)，扭體次數(shù)均顯著增多(P<0.05，P<0.01)。

3.4 風(fēng)濕骨痛膠囊對(duì)熱板法所致小鼠的鎮(zhèn)痛作用

如表4所示，與空白對(duì)照組比較，風(fēng)濕骨痛膠囊高、中、低劑量組的痛閾值顯著性升高，且具有劑量依賴性(P<0.01)，0.5 h即出現(xiàn)鎮(zhèn)痛作用，在1 h產(chǎn)生最大鎮(zhèn)痛效果。與阿司匹林組比較，風(fēng)濕骨痛膠囊高、中、低劑量組0.5、1、1.5 h痛閾值呈劑量依賴性升高，其中高、中劑量組1 h和高劑量組1.5 h痛閾值顯著性升高(P<0.01，P<0.05)，高、中劑量組0.5 h痛閾值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 風(fēng)濕骨痛膠囊對(duì)大鼠腹腔白細(xì)胞游走的影響

表3 風(fēng)濕骨痛膠囊對(duì)醋酸致痛小鼠的鎮(zhèn)痛作用

注：與阿司匹林組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；下同。

表4 風(fēng)濕骨痛膠囊對(duì)熱板法所致小鼠的鎮(zhèn)痛作用

4 討論

炎性介質(zhì)是炎性反應(yīng)的最主要因素，炎性介質(zhì)主要分為細(xì)胞源性炎性介質(zhì)和體液源性炎性介質(zhì)[5]。這些介質(zhì)共同作用，促進(jìn)炎癥發(fā)展。炎癥的發(fā)展大致分為3個(gè)期：即以時(shí)間短暫、局部血管擴(kuò)張和毛細(xì)血管通透性增加為特征的急性期，以白細(xì)胞和吞噬細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的亞急性期以及以組織變性和纖維化為特征的慢性增殖期[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示采用角叉菜膠致炎1、2、4、6、8 h后，發(fā)炎程度呈波動(dòng)式變化，1～4 h大鼠足跖腫脹逐漸增大，4～8 h腫脹逐漸減弱，大鼠足跖在4 h腫脹率達(dá)最大，此結(jié)果與陳蘭英等[7]得出在5 h腫脹率達(dá)最大的結(jié)果較為接近。另有實(shí)驗(yàn)證實(shí)角叉菜膠致炎后大鼠足跖表現(xiàn)為水腫、疼痛過(guò)敏、形成紅斑，并導(dǎo)致一些促炎因子如緩激肽、組胺、補(bǔ)體、活性氧以及一些氮類物質(zhì)的釋放，嗜中性粒細(xì)胞很容易遷移到炎癥部位，并能產(chǎn)生促炎細(xì)胞活性氧和其他的炎癥反應(yīng)，大約在5 h左右足腫脹程度達(dá)最大[8]。但另也有不同報(bào)道，潘志遠(yuǎn)等[9]采用同樣方法造模后1～3 h小鼠足跖腫脹率顯著升高，為急性炎癥發(fā)展期，其中以3 h足跖腫脹率達(dá)最大，4～6 h后緩慢降低，屬緩慢消退期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異可能與選擇不同品種的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)角叉菜膠的敏感性、耐受性以及機(jī)體自身防御機(jī)制不同有關(guān)。與模型組比較，風(fēng)濕骨痛膠囊高、中、低劑量組在6 h和8 h均能顯著降低大鼠足跖腫脹率，且在不同時(shí)間點(diǎn)有不同的作用強(qiáng)度。與地塞米松組比較，風(fēng)濕骨痛膠囊中、低劑量組對(duì)大鼠足趾腫脹療效弱于地塞米松組，但風(fēng)濕骨痛膠囊高劑量組在4、6 h與地塞米松組無(wú)顯著差異，隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)腫脹率顯著降低。由細(xì)胞釋放或體液中產(chǎn)生的參與、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)得到的炎癥介質(zhì)，通過(guò)各種途徑作用于血管，使血管擴(kuò)張、通透性增加，引起滲出，吸引白細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，導(dǎo)致組織損傷，引起局部炎癥反應(yīng)和全身反應(yīng)[4]。羧甲基纖維素鈉建立的炎癥模型其發(fā)病機(jī)制為在血管活性胺或前列腺素等介質(zhì)參與下激活補(bǔ)體，吸引白細(xì)胞，白細(xì)胞脫顆粒，釋放血管通透因子，并使血小板聚集，導(dǎo)致血管炎，引起局部組織水腫[10]。本實(shí)驗(yàn)將大鼠腹腔注射1%羧甲基纖維素鈉溶液，造模3 h后，風(fēng)濕骨痛膠囊高、中、低劑量組對(duì)白細(xì)胞游走的抑制作用強(qiáng)度呈劑量依賴性，且高劑量組與地塞米松組對(duì)白細(xì)胞游走的抑制作用相近，提示其抑制組織腫脹和白細(xì)胞游走作用為該藥抗炎作用的主要機(jī)理。

風(fēng)濕骨痛膠囊高、中、低劑量組均能延長(zhǎng)小鼠的疼痛耐受期并減少醋酸所致小鼠的扭體次數(shù)，其鎮(zhèn)痛百分率與阿司匹林組接近。將小鼠置于熱板上，給藥后0.5 h即出現(xiàn)顯著的鎮(zhèn)痛作用，此時(shí)與阿司匹林組鎮(zhèn)痛作用無(wú)顯著差異，隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，鎮(zhèn)痛閾值明顯高于阿司匹林組，在1 h達(dá)到最強(qiáng)的鎮(zhèn)痛療效，風(fēng)濕骨痛膠囊高劑量組鎮(zhèn)痛作用顯著。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出風(fēng)濕骨痛膠囊對(duì)炎癥的急性期及亞急性期均有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，通過(guò)預(yù)防性給藥可以更好地緩解炎性反應(yīng)，抑制白細(xì)胞黏附聚集，減輕腫脹，緩解疼痛。通過(guò)與臨床常用鎮(zhèn)痛抗炎藥物的橫向比較，證實(shí)風(fēng)濕骨痛膠囊對(duì)炎性反應(yīng)的確切療效，這對(duì)于臨床患者長(zhǎng)期服用非甾體鎮(zhèn)痛抗炎藥或激素類抗炎藥所產(chǎn)生的不能耐受的不良反應(yīng)是一種很好的替代藥物。通過(guò)對(duì)風(fēng)濕骨痛膠囊抗炎鎮(zhèn)痛作用隨時(shí)間動(dòng)態(tài)變化的研究，可以初步反映中藥復(fù)方藥效的整體作用特點(diǎn)，但對(duì)于風(fēng)濕骨痛膠囊何種有效成分發(fā)揮抗炎作用以及通過(guò)何種途徑發(fā)揮療效均需要對(duì)其進(jìn)行深入研究。

[1] Subhashini N，Purnima S，Devi J A，et al.Anti-inflammatory activity of Erythrina stricta Roxb in albino rats[J].Int J PharmTech Res，2011，3(2)：1014-1018.

[2] 李光民，儲(chǔ)金秀，韓淑英.三七乳香合劑鎮(zhèn)痛抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].河北醫(yī)藥，2015，37(10)：1458-1460.

[3] 何迅，龐秀清，葉蘭，等.蓮菊感冒膠囊抗炎解熱發(fā)汗解表作用[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31(10)：810-813.

[4] 楊延林.三黃皮炎膏鎮(zhèn)痛抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].河南中醫(yī)，2013，33(7)：1049-1050.

[5] 趙德明.獸醫(yī)病理學(xué)[M].2版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2005：133-157.

[6] 徐叔云，卞如廉，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：906.

[7] 陳蘭英，王昌芹，劉榮華，等.芍藥甘草湯對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)指標(biāo)時(shí)序性變化研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(4)：115-119.

[8] Zheng Xu，Jiangrui Zhou，Jianmei Cai，et al.Anti-inflammation effects of hydrogen saline in LPS activated macrophages and carrageenan induced paw oedema[J].J Inflammation，2012，9：2.

[9] 潘志遠(yuǎn)，汪海.膽堿和阿司匹林協(xié)同抗炎作用及其藥理學(xué)機(jī)制的研究[D].北京：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2014.

[10] 雷紅偉，陳曉菁，黃念芳，等.雷公藤雙層片對(duì)大鼠羧甲基纖維素囊滲出液白細(xì)胞游走的影響[J].江漢大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004，32(2)：67-68.

EffectsofRheumatismBonePainCapsulaonInflammatoryReaction

TIANYu，LIYunyan*

(TheSecondAffiliatedHospitalofTianjinUniversityofMedical，Departmentofpharmacy，Tianjin300211，China)

Objective：To study the Rheumatism Bone Pain Capsula(RBPC)effects on inflammatory reactions.Methods：The rats were divided into the blank group，the high dose group，the middle dose group and the low dose group of RBPC，as well as the positive control group before administration.The rats were injected carrageenan solution to the hind limb right digiti pedis subcutaneous tissue，to measure phlogogenous voix pedis of rats respectively and to get swelling rates of voix pedis of rats.The rats were injected sodium carboxymethy cellulose solution at abdominal cavity，white cell was counted.The mouse were injected acetic acid solution to abdominal cavity，and recorded time of the first writhing response as well as writhing response frequency in ten minutes.The mouse was put on a(55±0.5)℃ hot plate and the thermal pain threshold was determined.Results：Compared with the model group，the high dosage，the middle dosage and the low dosage of RBPC groups of swelling rates of foot-ankle perimeter of rats to keep degrade through phlogogenous times extension.white cell transmigration counts of the high dosage and the middle dosage of RBPC groups were degrade remarkably(P<0.01).The mouse of the thermal pain threshold step up remarkably.Conclusion：RBPC has good inhibition effects on inflammatory reactions.

Rheumatism bone plain capsula；anti-inflammatory；paregoric；detumescence

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.008

2015-08-17)

*

黎云燕，副主任藥師，研究方向：臨床藥理；E-mail：lyyan3366@163.com