李宜航，宋美芳，呂婭娜，李學(xué)蘭，李光*，陳曦

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100；2.西雙版納州傣藥南藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 景洪 666100；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

·基礎(chǔ)研究·

丁座草藥材指紋圖譜的建立及質(zhì)量評(píng)價(jià)△

李宜航1，2，宋美芳1，2，呂婭娜1，2，李學(xué)蘭1，2，李光1，2*，陳曦1，3*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所 云南分所，云南 景洪 666100；2.西雙版納州傣藥南藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 景洪 666100；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的：研究并建立丁座草藥材的指紋圖譜，為有效控制其質(zhì)量提供可靠方法。方法：采用反相超高效液相色譜法，Purospher C18色譜柱，乙腈-0.05%磷酸溶液梯度洗脫，流速：0.8 mL·min-1，檢測(cè)波長：278 nm，并且采用“中藥指紋圖譜計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)軟件”進(jìn)行了指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：不同產(chǎn)地丁座草指紋圖譜相似度較好，在指紋圖譜中確定了10個(gè)共有峰，各色譜峰的分離較好，符合指紋圖譜檢測(cè)要求。結(jié)論：該指紋圖譜檢測(cè)方法重現(xiàn)性好，可用于丁座草藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

丁座草；指紋圖譜；超高效液相色譜法

丁座草BoschniakiahimalaicaHook.f.et Thoms為列當(dāng)科草蓯蓉屬植物，常寄生于杜鵑花屬植物根上；以球形塊莖入藥，具有理氣止痛、止咳祛痰、消脹健胃的功效[1]，為千草腦脈通口服液的主要組方藥物，臨床多用于治療缺血性卒中及后遺癥，療效確切[2]。目前對(duì)丁座草的質(zhì)量控制，以松脂苷作為考察指標(biāo)，然而對(duì)單一成分的檢測(cè)不足以說明中藥的質(zhì)量，并且專屬性較差[3-4]。

丁座草的化學(xué)成分研究表明，其中主要含有三萜類和木脂素類化合物，除松脂苷外，松脂醇、落葉松脂醇、馬先蒿木脂甲素等均具備抗病毒、抗疲勞等生物活性[5-7]。中藥的藥效是內(nèi)含物質(zhì)群的整體作用結(jié)果，因此，建立丁座草藥材多成分質(zhì)量控制方法對(duì)于藥材質(zhì)量控制和臨床藥效穩(wěn)定具有重要的意義。

指紋圖譜分析可以實(shí)現(xiàn)多元檢測(cè)、多水平評(píng)價(jià)，是國際上公認(rèn)的控制中藥、天然藥品種質(zhì)量的有效方法[8]。本文使用超高效液相色譜法，研究并建立了丁座草藥材的指紋圖譜，為其質(zhì)量控制提供了有效的方法。

1 儀器和材料

1.1 儀器

Waters 600超高效液相色譜儀(Waters公司)；JN-5200DT超聲清洗器(寧波市新江南儀器有限公司)；98-1-B電子調(diào)溫電熱套(天津市泰斯特儀器有校內(nèi)公司)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-D循環(huán)水真空泵(河南省豫華儀器有限公司)；A135-S分析天平(梅特勒托利多公司)。

1.2 材料

乙腈、甲醇(瑞典OCEANPAK公司，批號(hào)：40203-15309、30281-27409)；(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷(松脂苷)(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：MUST-14051302)；磷酸(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào)：130507)。

樣品：丁座草藥材購于云南、四川、湖北等地，經(jīng)藥用植物研究所云南分所李學(xué)蘭研究員鑒定為丁座草BoschniakiahimalaicaHook.f.et Thoms的塊莖。樣品信息見表1。

表1 丁座草藥材樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱：Purospher STAR RP-18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸水(V/V)；運(yùn)行時(shí)間：50 min，洗脫梯度：15∶85(0～10 min)，25∶75(10～30 min)，40∶60(30～40 min)，80∶20(40～50 min)；流速：0.8 mL·min-1；檢測(cè)波長：278 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；理論塔板數(shù)以松脂苷計(jì)不低于4000，且與其他色譜峰分離度大于1.0。

2.2 供試品溶液制備

取干燥的丁座草藥材，粉碎后過3號(hào)篩。細(xì)粉于硅膠干燥器內(nèi)干燥24 h，精密稱定0.2 g置50 mL具塞錐形瓶中，加50%甲醇20 mL，稱重，超聲20 min，稱重，補(bǔ)足缺失重量，0.22 μm微孔濾膜過濾，精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度混勻。

2.3 對(duì)照品溶液制備

精密稱取松脂苷適量，置10 mL棕色容量瓶中，加入甲醇至刻度，制成0.08 mg·mL-1對(duì)照品溶液。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取松脂苷對(duì)照品適量，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇并稀釋至刻度，在2.1項(xiàng)的色譜條件下，分別進(jìn)樣1、2、4、6、8、10 μL，每個(gè)樣品連續(xù)進(jìn)樣5次，以濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到松脂苷對(duì)照品的回歸方程Y=23 575X-62 317.5，r=0.999 7，顯示松脂苷在0.578 8～5.788 3 μg呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取松脂苷對(duì)照品(4號(hào)樣品)溶液，分別于0、2、6、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定色譜圖，對(duì)各峰的相對(duì)保留時(shí)間、峰面積進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果表明主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積RSD均小于1.23%，基本一致，符合指紋圖譜的要求。

2.6 精密度試驗(yàn)

取松脂苷對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定色譜圖，比較主要峰面積和保留時(shí)間，結(jié)果6次測(cè)定色譜圖保留時(shí)間和主要峰峰面積穩(wěn)定，RSD均小于0.81%，精密度良好，符合指紋圖譜要求。

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同批丁座草藥材(4號(hào)樣品)，按照上述處理方法制備供試品溶液6份，進(jìn)樣測(cè)定色譜圖，對(duì)主要峰保留時(shí)間及峰面積進(jìn)行比較，結(jié)果各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、峰面積的RSD均小于1.02%，基本一致。

2.8 特征峰與內(nèi)參照峰的確定

取松脂苷對(duì)照品按2.1色譜方法進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)其中的已知成分，并確定其保留時(shí)間為27.804 min，見圖1。

圖1 (+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷超高效液相色譜圖

2.9 丁座草超高效指紋圖譜的測(cè)定

取10批不同的丁座草藥材，分別按照上述方法測(cè)定，記錄并整合色譜圖，見圖2。上述測(cè)試結(jié)果經(jīng)“中藥指紋圖譜計(jì)算機(jī)輔助相似度評(píng)價(jià)軟件”處理，確定10個(gè)共有指紋特征峰，共有指紋峰的峰面積占總峰面積的90%以上，符合指紋圖譜的要求，獲得丁座草超高液相指紋圖譜，見圖3。根據(jù)保留時(shí)間，指認(rèn)8號(hào)峰為松脂苷，以對(duì)照品峰面積為參照，計(jì)算共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積比值，結(jié)果見表2和表3。

圖2 10批丁座草藥材指紋圖譜

圖3 丁座草藥材的超高效液相對(duì)照指紋圖譜

表2 丁座草指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間/min

表3 丁座草指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積

2.10 指紋圖譜相似度比較與丁座草品質(zhì)評(píng)價(jià)

通過中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件，以生成對(duì)照指紋圖譜為模板，對(duì)10批丁座草樣品圖譜進(jìn)行相似度比較，結(jié)果見表4。10批樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.917～0.983，以相似度作為優(yōu)質(zhì)藥材的判斷標(biāo)準(zhǔn)，以云南華坪丁座草相似度最高(0.983)，松脂苷含量最高為云南洱源產(chǎn)丁座草。

表4 10批丁座草指紋圖譜相似度及松脂苷含量

3 討論

分別采用乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.5%磷酸溶液系統(tǒng)進(jìn)行了等度和不同線性梯度洗脫。結(jié)果表明，以乙腈-0.05%磷酸線性洗脫分離效果較好，基線漂移小，色譜峰分離度好、保留時(shí)間穩(wěn)定。

對(duì)于不同波長下的色譜圖進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)松脂苷參照溶液和丁座草藥材提取液在278 nm處均有最大吸收，同時(shí)當(dāng)λ=278 nm時(shí)，色譜峰較多且峰形較好，因此選擇278 nm作為測(cè)定波長。

本實(shí)驗(yàn)指紋圖譜反映了丁座草中主要成分的含量及多種化合物相對(duì)比例，可用于丁座草藥材的定性鑒別和質(zhì)量監(jiān)控。

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EstablismentofControlFingerprintandQualityAssessmentofBoschniakiahimalaicaHook.f.etThoms

LIYihang1，2，SONGMeifang1，2，LYUYana1，2，LIXuelan1，2，LIGuang1，2*，CHENXi1，3*

(1.YunnanBranchInstituteofMedicinalPlant，ChineseAcademyofMedicalSciences，Jinghong666100，China；2.KeylaboratoryofDaiandSouthernmedicineofXishuangbannaDaiautonomousprefecture，Jinghong666100，China；3.InstituteofMedicinalPlant，ChineseAcademyofMedicalSciences，Beijing100193，China)

Objective：To establish the analysis method of fingerprint forBoschniakiahimalaicaHook.f.et Thoms by UPLC and provide a reliable method for quality control ofB.himalaica.Methods：The fingerprint ofB.himalaicawas built by using Purospher C18as column and acetonirile-0.05% phosphoric acid aqueous in gradient as mobile phase.The flow rate was 0.8 mL·min-1，and the detecting wavelength was set at 278 nm.The fingerprints ofB.himalaicafrom different habitats were compared by Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of CMM.Results：Samples fromdifferent habitats were of high similarities and 10 common peaks existed in thefingerprint.Each peak in the fingerprint was separated very well，satisfied to the requests of fingerprint.Conclusion：This RP-UPLC method is repeatable in analysis ofB.himalaicaand can be used in quality assessment ofB.himalaica.

BoschniakiahimalaicaHook.f.et Thoms；fingerprint；UPLC

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.4.010

2015-05-22)

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)(YZYN-14-01);云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2013HB099)

*

李光，助理研究員，研究方向：民族藥藥理及開發(fā)，Tel:(0691)2136981，E-mail: lhbg311@hotmail.com; 陳曦，博士，研究員，研究方向：中藥新藥開發(fā)，E-mail：91chenxi12@163.com