黃　暢　崔瑩雪　劉鈞天　劉耀萌　韓　麗　于夢蕓　趙百孝

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029; 2 北京中醫(yī)醫(yī)院，北京，100010)

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艾灸及艾煙對載脂蛋白E基因敲除小鼠血清MDA、SOD水平的影響

黃暢1崔瑩雪2劉鈞天1劉耀萌1韓麗1于夢蕓1趙百孝1

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029; 2 北京中醫(yī)醫(yī)院，北京，100010)

目的：觀察艾灸及艾煙對載脂蛋白E基因敲除(Apolipoprotein E-deficient，ApoE-/-)小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的影響。方法：38只8周齡ApoE-/-小鼠隨機分為5組：模型組(n=6)、假艾灸組(n=6)、香煙組(n=8)、艾煙組(n=9)、艾灸組(n=9)，13只同齡C57BL/6小鼠作為正常對照，正常組與模型組小鼠暴露于玻璃缸中，艾灸與假艾灸組均對小鼠關(guān)元穴進行艾灸，假艾灸組艾條不點燃，艾煙組小鼠暴露于10～15 mg/m3的艾煙環(huán)境，香煙組小鼠暴露于10～15 mg/m3的香煙環(huán)境，各組小鼠每天干預(yù)20 min，連續(xù)干預(yù)12周，每周干預(yù)6 d，于12周末檢測小鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)的表達水平。結(jié)果：艾灸組及艾煙組血清MDA含量較模型組顯著降低(P<0.05)，且艾灸組顯著低于假艾灸組(P<0.05)，艾煙組顯著低于香煙組(P<0.05)。艾灸組及艾煙組血清SOD含量較模型組顯著升高(P<0.05)，艾灸組顯著高于假艾灸組(P<0.05)，艾煙組顯著高于香煙組(P<0.05)。結(jié)論：艾灸和艾煙是通過調(diào)節(jié)機體MDA、SOD水平，發(fā)揮抗氧化作用，保護血管內(nèi)皮改善AS。

艾灸；艾煙；動脈粥樣硬化；氧化應(yīng)激

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是嚴(yán)重危害人類健康的常見疾病，百余年來其危險因素和發(fā)病機制一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要研究課題。其中氧化應(yīng)激被認為是AS發(fā)病的核心機制，直接參與AS發(fā)生、發(fā)展及惡化的全過程[1]。

艾灸作為中醫(yī)學(xué)最古老的療法之一，其治療AS和保護動脈血管的作用已被大量的實驗研究和臨床觀察所證實。然而，現(xiàn)階段對于艾灸抗AS的作用機制研究多集中于其調(diào)脂和抗炎的效應(yīng)，少有從“氧化應(yīng)激”學(xué)說出發(fā)。因此，我們擬用ApoE-/-小鼠AS模型，以SOD和MDA作為客觀指標(biāo)，從抗氧化的角度探討艾灸及艾煙保護血管內(nèi)皮的作用機制，進一步明確艾灸抗AS效應(yīng)中的關(guān)鍵因素，為臨床推廣艾灸療法治療AS提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1　材料與儀器

1.1實驗動物清潔級8周齡雄性ApoE-/-38只，C57BL/6小鼠13只，體重(22.46±1.12)g，購自北京大學(xué)動物醫(yī)學(xué)中心[許可證：SCXK(京)2011-0012]。

1.2藥品SOD試劑盒、MDA試劑盒均由中國科學(xué)院心理研究所提供。

1.3儀器小鼠固定器(規(guī)格：長130 cm×寬60 cm×高50 cm)；自制帶孔玻璃缸(1 m×1 m×1 m,頂層玻璃正中設(shè)一直徑5 mm圓孔)；光散射式數(shù)字粉塵測試儀(購自北京賓達綠創(chuàng)科技有限公司)；低溫離心機(德國ZK380型)；超低溫冰箱(日本三洋公司生產(chǎn))。

1.4其他材料自制細艾條(直徑0.5 cm×長20 cm，河南南陽漢醫(yī)艾絨有限公司提供)；香煙(中南海牌，焦油含量10 mg/支)。

2　實驗方法

2.1分組及模型制備小鼠購進后，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，干預(yù)12周，每周干預(yù)6 d。按隨機數(shù)字表法將ApoE-/-小鼠隨機分為模型組、假艾灸組、香煙組、艾煙組、艾灸組，并將13只C57BL/6小鼠作為正常組進行對照。ApoE-/-小鼠采用高脂飼料(購自北京維通利華實驗動物有限公司，含15%豬油、2%膽固醇、0.05%膽酸)喂養(yǎng)，C57BL/6小鼠采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進水；飼養(yǎng)環(huán)境溫度22 ℃±2 ℃，相對濕度50%～60%，保持12 h光照(8:00—20:00)和黑暗(20:00—次日8:00)交替循環(huán)。

2.2干預(yù)方法1)空白干預(yù)：將正常組與模型組小鼠分別暴露于玻璃缸中20 min，期間不施加其他干預(yù)。

2)艾灸干預(yù)：將艾灸組小鼠分別裝進小鼠固定器中，腹部向下，小鼠關(guān)元穴置于艾條上方，點燃自制細艾條，艾灸干預(yù)20 min。

3)假艾灸干預(yù)：將假艾灸組小鼠分別裝進小鼠固定器中，腹部向下，小鼠關(guān)元穴正對艾條上方，不點燃艾條，干預(yù)20 min。

4)艾煙干預(yù)：將調(diào)試好的粉塵測試儀置于自制玻璃缸中間，讓艾煙組小鼠自由暴露在玻璃缸中，點燃艾條，將點燃的一端從玻璃缸上方的圓孔插入，令艾煙充滿玻璃缸。用粉塵測試儀檢測缸中艾煙濃度，達到預(yù)定濃度范圍后(此過程艾條燃燒約15 s)，取出艾條，迅速封閉圓孔。此后每隔3 min記錄一次濃度數(shù)值，使艾煙濃度保持在10 mg/m3左右。若數(shù)值高于15 mg/m3，即將上方玻璃蓋稍微移動，令艾煙散去部分后迅速將蓋子移回；若數(shù)值低于15 mg/m3，可再將點燃的艾條由圓孔插入，繼續(xù)補充艾煙。艾煙組小鼠干預(yù)20 min后，取出小鼠。在對艾煙組小鼠進行干預(yù)時，要嚴(yán)格隔離其他組別小鼠，避免其他干預(yù)組小鼠嗅到艾煙。

5)香煙干預(yù):除將艾煙換成香煙，其他干預(yù)方式及注意事項與艾煙組相同。

2.3取材末次干預(yù)后，禁食不禁水12 h。小鼠麻醉后，采用眼球摘除法，從眼眶靜脈叢采集血液標(biāo)本約1.5～2 mL，置于離心管中，靜置1 h后，離心15 min(4 ℃，1 500 r/min)。離心后將血清保存于-80 ℃冰箱中。

2.4指標(biāo)檢測采用黃嘌呤氧化酶法測定血清SOD活性，采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量。測定時嚴(yán)格按照試劑盒的說明進行操作。

表1　各組小鼠血清MDA和SOD活性比較

注：△P<0.05，與模型組比較；*P<0.05，與假艾灸組比較；#P<0.05，與香煙組比較。

3　結(jié)果

各組小鼠血清MDA和SOD活性比較。見表1。表1中數(shù)據(jù)表明：各組小鼠血清MDA含量以模型組最高，正常組最低。模型組較正常組顯著增加(P<0.05)，艾灸組及艾煙組較模型組顯著降低(P<0.05)，且艾灸組顯著低于假艾灸組(P<0.05)，艾煙組顯著低于香煙組(P<0.05)。各組小鼠血清SOD含量以模型組最低，艾灸組最高。模型組較正常組顯著降低(P<0.05)，艾灸組及艾煙組較模型組顯著升高(P<0.05)，艾灸組顯著高于假艾灸組(P<0.05)，艾煙組顯著高于香煙組(P<0.05)。從圖2中可以比較直觀地看出各組大鼠血清中MDA及SOD水平的變化。

圖1　各組小鼠血清MDA水平比較

圖2　各組小鼠血清SOD水平比較

4　討論

ApoE(Apolipoprotein E，ApoE)是血漿脂蛋白的重要組成部分，主要參與脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運、利用和排泄，缺乏ApoE將導(dǎo)致血液循環(huán)中膽固醇清除障礙進而形成AS。研究表明，ApoE-/-小鼠自發(fā)形成的AS病變無論是在病理學(xué)還是組織學(xué)形態(tài)上都與人類極為相似[2]。因此，ApoE-/-小鼠已成為近年AS發(fā)病機制研究中最重要的動物模型之一。

氧化應(yīng)激是心血管疾病發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，與AS的發(fā)病關(guān)系極為密切，其不僅能氧化修飾低密度脂蛋白，形成大量泡沫細胞，還可促進炎性反應(yīng)和細胞增殖，介導(dǎo)內(nèi)皮功能損傷，從而多方面參與AS的形成和發(fā)展[3]。由于活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)在細胞內(nèi)蓄積所產(chǎn)生的細胞毒性是氧化應(yīng)激引起血管內(nèi)皮功能障礙的主要原因。且大量實驗證明抗氧化劑可延緩AS的疾病過程[4]。故本研究選取了活性氧清除系統(tǒng)研究中使用較普遍的抗氧化酶SOD和氧化代謝產(chǎn)物MDA為觀測指標(biāo)，以闡明艾灸及艾煙抗動脈粥樣硬化的氧化應(yīng)激機制。

MDA是活性氧或自由基攻擊生物膜所形成的脂質(zhì)過氧化代謝終產(chǎn)物[5]，其含量可反映機體脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反應(yīng)出細胞的損傷情況。研究表明，冠心病患者機體脂質(zhì)過氧化程度升高與MDA大量形成密切相關(guān)[6]。MDA含量增多時，還可進一步損傷冠狀血管內(nèi)皮細胞，加重冠狀動脈硬化的程度。機體為抵抗這一過程，消除脂質(zhì)過氧化物，保護內(nèi)皮細胞，形成了一系列抗氧化防御系統(tǒng)。SOD就是該系統(tǒng)中非常重要的金屬酶，它能清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，保護血管內(nèi)皮免受過氧化損傷。大量基礎(chǔ)研究已證實SOD的活性增加可抑制細胞介導(dǎo)的低密度脂蛋白過氧化，減少Ox-LDL的形成，從而阻止巨噬細胞對脂類的過度攝取和泡沫細胞在內(nèi)皮下的積累[7～8]。Masuo Ohashi等還發(fā)現(xiàn)SOD可抑制ApoE-/-小鼠體內(nèi)過氧化物的生成，防止內(nèi)皮功能紊亂[9]。

中醫(yī)學(xué)認為AS主要由于痰濁瘀血導(dǎo)致脈絡(luò)痹阻不通所引起，而艾灸具有溫通血脈，調(diào)和氣血的作用。近年研究也已表明艾灸可通過調(diào)脂、抗炎、抗血栓形成等功效降低血脂，改善動脈粥樣硬化。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，ApoE-/-小鼠經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)后會出現(xiàn)明顯的氧化應(yīng)激狀態(tài)，血清MDA含量升高，SOD含量降低，進而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，脂質(zhì)浸潤，形成AS斑塊。然而，經(jīng)艾灸干預(yù)后，小鼠MDA含量明顯降低，SOD活性增強，說明艾灸可通過增強機體抗氧化的能力，抑制脂質(zhì)過氧化效應(yīng)，從而防止AS的發(fā)生和發(fā)展。

吸煙是公認的AS的危險因素之一，其可導(dǎo)致機體氧化應(yīng)激水平升高，從而破壞血管內(nèi)皮的功能[10]。艾煙雖與香煙煙霧以相同的途徑進入機體，且具有相似的物理性狀，但兩者本質(zhì)上是截然不同的物質(zhì)，對機體產(chǎn)生的效應(yīng)也完全不同。香煙煙霧中含有大量自由基，可導(dǎo)致機體氧化應(yīng)激水平升高，血脂紊亂，血管內(nèi)皮功能障礙，引發(fā)多種心血管疾病[11]。本實驗中艾煙組與香煙組小鼠暴露于濃度相同的煙霧環(huán)境中，艾煙組小鼠MDA含量明顯低于香煙組和模型組，SOD含量明顯高于香煙組和模型組?？梢娕c香煙煙霧的效應(yīng)相比，艾煙可增強機體抗氧化、清除氧自由基的能力，從而保護細胞生物膜，有效地緩解AS。本課題組前期在對艾灸干預(yù)AS的實驗研究中還發(fā)現(xiàn)艾灸及艾煙對ApoE-/-小鼠血清TNF-α、hs-CRP、vWF含量也有影響，說明改善動脈粥樣硬化過程中，艾灸及艾煙發(fā)揮作用的途徑除了本實驗所證實的降低氧化應(yīng)激反應(yīng)外，減少炎性反應(yīng)也是其途徑之一[12]?？梢姡募鞍瑹熆赡苁峭ㄟ^多途徑、多靶點來產(chǎn)生抗AS的效應(yīng)。

綜上所述，除了艾灸的熱以外，艾煙也是艾灸發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵因素。艾灸與艾煙可能是通過降低機體氧化應(yīng)激水平，減少脂質(zhì)過氧化物生成，保護血管內(nèi)皮的途徑，發(fā)揮抗AS作用的機制之一。

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(2016-06-28收稿責(zé)任編輯：洪志強)

Effects of Moxibustion and Moxa Smoke on Serum MDA and SOD Levels in Apolipoprotein E-deficient Mice

Huang Chang1,Cui Yingxue2, Liu Juntian1, Liu Yaomeng1, Han Li1, Yu Mengyun1,Zhao Baixiao1

(1BeijingUniversityofChineseMedicine,Bejing100029,China; 2BeijingTraditionalChineseMedicalHospital,Bejing100010,China)

Objective:To observe the intervention effects of moxibustion and moxa smoke on oxidative stress indexes in ApoE-/-mice. Methods: Thirty-eight ApoE-/-mice (8 weeks old) were randomly divided into model group (n=6), sham-moxibustion group (n=8), cigarette smoke group (n=8), moxa smoke group(n=9), and moxibustion group (n=9). Thirteen same age C57BL/6 mice were used as blank controls. Mice in the blank control and model control groups were put into a glass box without any treatment. Mice of the sham and real moxibustion groups received moxibustion on Guanyuan (RN4) while the two smoke groups were exposed to smoke, whose concentration is 10 mg/m3. All the manipulations were performed 20 min/day, 6 days each week, 12 weeks totally. Levels of malondialdehyde (MDA) and activity of superoxide dismutase (SOD) were determined by colorimetric method. Results: Comparing wit the model group, mice in the moxibustion group and moxa smoke group had significant lower level of MDA (P<0.05), and significant higher level of SOD (P<0.05). There was a remarkable decrease of MDA level (P<0.05) and an increase of SOD activity (P<0.05) in the moxibustion group compared to the sham-moxibustion group. MDA level was decreased (P<0.05) and SOD level was significantly increased (P<0.05) in moxa smoke group compared to those of the cigarette smoke group. Conclusions: Both moxibustion and moxa smoke can regulate the levels of serum MDA and SOD, which might be one of the mechanisms of their anti-oxidation effects for relieving the damage of vascular intima and atherosclerosis.

Moxibustion; Moxa smoke; Atherosclerosis; Oxidative stress

國家自然科學(xué)基金項目(編號：81373730)；國家自然科學(xué)基金項目(編號：81574068)；國家青年自然基金項目(編號：81403449)；國家國際科技合作專項項目(編號：2011DFA31370)

黃暢，博士研究生，研究方向：艾灸的作用機理研究，電話：(010)64286737，E-mail:214330358@qq.com

趙百孝(1963.03—)，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院院長，研究方向：艾灸作用與原理，Tel：(010)64286737，E-mail:baixiao100@vip.sina.com

R245.81

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10.3969/j.issn.1673-7202.2016.08.004