趙書源， 何　丹， 孫　偉

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科, 烏魯木齊　830011)

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白細(xì)胞介素17受體A在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

趙書源， 何丹， 孫偉

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科, 烏魯木齊830011)

目的研究白細(xì)胞介素17受體A(Interleukin-17 receptor type A, IL-17RA)在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系。方法收集2010年1月1日-2013年12月31日在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科接受標(biāo)準(zhǔn)肺癌根治術(shù)且隨訪資料完整的131例肺鱗癌和腺癌患者的術(shù)后標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)法檢測癌組織、癌旁組織中IL-17RA的表達(dá)情況。Kaplan-Meier法比較癌組織IL-17RA高表達(dá)和低表達(dá)對患者3年無病生存期(Disease-free survival, DFS)的影響。結(jié)果IL-17RA在癌組織的表達(dá)高于癌旁組織(P<0.001)；IL-17RA的表達(dá)與病理類型、腫瘤直徑和術(shù)后病理分期(pTNM stages，pTNM)有關(guān)(P<0.05)；生存分析顯示，癌組織IL-17RA低表達(dá)患者的DFS均優(yōu)于IL-17RA高表達(dá)者(P=0.032)；COX回歸分析結(jié)果顯示，IL-17RA陽性表達(dá)是肺鱗癌、腺癌患者DFS的重要影響因素(P=0.041，HR=1.683)。結(jié)論IL-17RA表達(dá)是非小細(xì)胞肺癌患者獨立預(yù)后因素，高表達(dá)提示預(yù)后差。

非小細(xì)胞肺癌； Th17細(xì)胞； 白介素-17； 白介素-17受體A

最新研究發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素17(Interleukin-17, IL-17)作為機(jī)體重要的炎癥因子，通過與靶細(xì)胞膜表面受體白細(xì)胞介素17受體(Interleukin-17 receptor，IL-17R)結(jié)合，可激活下游通路，實現(xiàn)生物學(xué)效應(yīng)[1]。而白細(xì)胞介素17受體A(Interleukin-17 receptor type A, IL-17RA)可能是實現(xiàn)IL-17各種生物學(xué)效應(yīng)的啟動因子，需要深入進(jìn)行研究。本研究通過對非小細(xì)胞肺癌(Non-Small-Cell Lung Cancer, NSCLC)IL-17RA表達(dá)情況與臨床因素、患者無病生存期(Disease-free survival, DFS)關(guān)系的研究，探討IL-17RA在NSCLC進(jìn)展過程中的免疫抑制作用及其與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1一般資料及納入標(biāo)準(zhǔn)收集并篩選新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2010年1月1日-2013年12月31日接受標(biāo)準(zhǔn)肺癌根治術(shù)(肺葉或肺段切除+縱膈淋巴結(jié)清掃術(shù))的非小細(xì)胞肺癌鱗癌、腺癌患者343例的術(shù)后標(biāo)本。入選標(biāo)準(zhǔn)：未失訪病例；未接受過術(shù)前放化療；Ⅰ期患者術(shù)后隨訪至腫瘤復(fù)發(fā)后才接受全身化療；Ⅱ、Ⅲ期患者術(shù)后接受過至少2個周期含鉑方案兩藥聯(lián)合化療或放療；有癌組織和癌旁組織距離腫塊邊緣3 cm以內(nèi)的肺組織病理標(biāo)本的患者。符合上述標(biāo)準(zhǔn)的患者共131例，平均年齡62歲，男性82例，女性49例。Ⅰ期患者46例，Ⅱ期34例，Ⅲ期51例(UICC2009版)；組織學(xué)分型按1981年WHO標(biāo)準(zhǔn)：鱗癌53例，腺癌78例。

1.2隨訪情況131例NSCLC患者術(shù)后采取電話及門診隨訪形式，無失訪。隨訪自手術(shù)之日起，至2015年6月1日。終點事件為腫瘤復(fù)發(fā)。評價指標(biāo)為患者1、2、3 a無病生存期。

1.3免疫組織化學(xué)方法IL-17RA單克隆抗體購自Abcam(香港)公司(貨號ab178568)，取組織蠟塊切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化、加鼠抗人IL-17RA單抗(稀釋至1 μg/mL)，加生物素化二抗，DAB顯色、復(fù)染、脫水、透明和中性樹膠封片后編號。結(jié)果判定采用單盲法，切片由病理科一位高級職稱醫(yī)師隨機(jī)對結(jié)果進(jìn)行評判。評分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[2]，即每張切片隨機(jī)觀察5個高倍(×400)視野并計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞。采用細(xì)胞顯色強(qiáng)度評分與陽性腫瘤細(xì)胞百分比的乘積求得半定量H-score評分，作為蛋白表達(dá)相對強(qiáng)度。具體評分方法為：按顯色程度分4級：陰性(不著色)、弱陽性(淡黃色)、陽性(棕黃色)、強(qiáng)陽性(棕褐色)，分別計0、1、2、3分；陽性腫瘤細(xì)胞百分比：無：0分；1%～9%：0.1分；10%～50%：0.5分；>50%：1.0分。IL-17RA表達(dá)情況判定以癌組織H-score中位評分為界，>癌組織H-score中位數(shù)者認(rèn)定為IL-17RA表達(dá)陽性，反之為表達(dá)陰性。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，臨床資料采用χ2檢驗和非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法，多因素分析采用Cox回歸模型,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1IL-17RA在NSCLC組織中的表達(dá)IL-17RA的染色定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞膜。IL-17RA在鱗癌和腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)(H-score=3)，見圖1。131例NSCLC患者IL-17RA的H-score評分：0～0.5分：癌組織26例，癌旁組織68例；1～1.5分：癌組織33例，癌旁組織59例；2～3分：癌組織72例，癌旁組織4例。癌組織中位評分為2分，高于癌旁組織中位評分(0.5分)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖2。因此本研究將癌組織中H-score評分≥2.0認(rèn)定為IL-17RA表達(dá)陽性(即腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度>2同時染色百分比>50%),反之為陰性。

a、 b: IL-17RA在鱗癌組織中的高表達(dá)和低表達(dá)(×100)c、 d: IL-17RA在腺癌組織中高表達(dá)和低表達(dá)(×100)

圖1IL-17RA在癌組織中表達(dá)的免疫組化染色結(jié)果

2.2 癌組織中的IL-17RA的表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性鱗癌組織中IL-17RA的陽性表達(dá)率(66.0%，35/53例)高于腺癌組織(46.2%，36/78例)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著腫瘤直徑的增大以及病理分期的增高，IL-17RA的表達(dá)呈上升趨勢(P<0.05)。腫瘤組織中IL-17RA的表達(dá)與年齡、性別、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、吸煙史和放化療史等無關(guān)(P>0.05),見表1。

a: IL-17RA在癌組織和癌旁組織時H-score評分柱狀圖

b: IL-17RA表達(dá)H-score評分在癌組織和癌旁組織的箱式圖

(注：與癌旁組織比較,*P<0.05)

圖2癌組織與癌旁組織IL-17RA表達(dá)H-score評分情況

表1腫瘤組織中IL-17RA表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的臨床病理特征的關(guān)系

臨床資料總數(shù)/%IL-17RA表達(dá)陽性/%陰性/%χ2值P值年齡/歲 <5018(13.7)14(77.8)4(22.2) 50～7088(68.2)43(48.9)45(51.1)5.0730.079 >7025(17.9)14(56.0)11(44.0)性別 男性82(62.6)44(53.7)38(46.3)0.0260.873 女性49(37.4)27(55.1)22(44.9)病理類型 鱗癌53(40.5)35(66.0)18(34.0)5.0260.025 腺癌78(59.5)36(46.2)42(53.8)組織學(xué)分級 G155(42.0)26(47.3)29(52.7) G253(40.5)33(62.3)20(37.7)2.4900.288 G323(17.6)12(52.2)11(47.8)pTNM分期 Ⅰ期46(35.1)16(34.8)30(65.2) Ⅱ期34(26.0)22(64.7)12(35.3)10.7660.005 Ⅲ期51(38.9)33(64.7)18(35.3)腫瘤直徑/cm ≤589(67.9)37(41.6)52(58.4)17.825<0.001 >542(32.1)34(81.0)8(19.0)N分期 N069(52.7)36(52.2)33(47.8)0.2410.624 N1+N262(47.3)35(56.5)27(43.5)吸煙史 無69(52.7)39(56.9)30(48.4)0.3170.573 有62(47.3)35(51.5)27(48.5)術(shù)后化療 否58(44.3)29(50.0)29(50.0)0.7390.390 是73(55.7)42(57.5)31(42.5)

注： 吸煙史10年， 平均>10支/d為有吸煙史。

2.3癌組織中IL-17RA的表達(dá)對患者預(yù)后的影響IL-17RA高表達(dá)的患者1、2、3年DFS率分別為65.1%、46.3%和24.3%，中位DFS時間為23.2(13.719～32.681)個月；IL-17RA低表達(dá)的患者1、2、3 a DFS率為77.0%、62.7%和44.1%，中位DFS時間為34.03(24.628～43.432)個月，見表2。Kaplan-Meier生存分析顯示IL-17RA低表達(dá)患者的DFS要優(yōu)于IL-17RA高表達(dá)患者，見圖3。

COX回歸多因素生存分析結(jié)果顯示，腫瘤分化程度、病理分期、IL-17RA表達(dá)均是患者DFS獨立影響因素。組織學(xué)類型及年齡不是影響預(yù)后的危險因素,見表 3。

3　討論

IL-17R家族成員均為Ⅰ型單次跨膜蛋白。迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)了IL-17的6個亞型(IL-17 A-F)和5個受體亞型(IL-17R A-E)[3]。IL-17A、IL-17E及IL-17F是重要的促炎癥因子。IL-17RA與IL-17RC復(fù)合體介導(dǎo)細(xì)胞對IL-17A與IL-17F的反應(yīng)，但細(xì)胞對IL-17A的反應(yīng)強(qiáng)度較IL-17F高10倍[1]。IL-17RA在組織中廣泛表達(dá)，特別是在造血組織中表達(dá)水平較高。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)IL-17在腫瘤組織中的表達(dá)明顯增強(qiáng)[4]，IL-17通過抑制腫瘤細(xì)胞凋亡和促進(jìn)腫瘤新血管生成，加劇了腫瘤的病理進(jìn)展[5]。本研究分析IL-17RA在NSCLC中表達(dá)情況與臨床資料及預(yù)后的關(guān)系，旨在為研究IL-17/IL-17RA相關(guān)下游通路和肺癌之間的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。

表2　IL-17RA表達(dá)對131例肺癌患者預(yù)后的影響

表3　Cox比例風(fēng)險模型預(yù)后分析結(jié)果

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測IL-17RA表達(dá)情況，結(jié)果顯示IL-17RA廣泛表達(dá)在不同組織學(xué)類型的肺癌組織中，IL-17RA在癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織，這與Numasaki等[6]用同樣方法在NSCLC細(xì)胞膜表面檢測到IL-17RA表達(dá)陽性的研究結(jié)果一致；此外，Huang等[7]采用RT-PCR法檢測IL-17RA mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中表達(dá)較癌旁組織顯著上升，而本研究采用免疫組化染色方法通過H-score評分法對IL-17RA表達(dá)進(jìn)行量化判定，癌組織的H-score評分中位數(shù)高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，同樣顯示出IL-17RA在鱗癌和肺癌腫瘤組織中表達(dá)情況明顯高于癌旁組織。

本研究顯示IL-17RA的陽性表達(dá)率與腫瘤直徑和術(shù)后病理分期(pTNM)有關(guān)(P<0.001，P=0.005)，隨著腫瘤直徑以及pTNM分期的增加，IL-17RA的表達(dá)呈上升趨勢。表明IL-17RA信號傳導(dǎo)過程中參與了NSCLC的進(jìn)展。多項研究證實前列腺癌、乳腺癌和胃癌能中能檢測到IL-17A的表達(dá)，但I(xiàn)L-17A在腫瘤免疫的功能一直是有爭議的問題[8]。在細(xì)胞水平對IL-17A和IL-17RA的體外實驗研究中，通過不同濃度IL-17對2種肺腺癌細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)孵育，檢測培養(yǎng)上清液中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的水平，發(fā)現(xiàn)在暴露于IL-17A在2種細(xì)胞系中VEGF的表達(dá)的與其呈現(xiàn)劑量依賴性。由此可知IL-17A可通過刺激肺腺癌細(xì)胞對VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤新生血管形成[9]。

本研究生存分析顯示，IL-17RA高表達(dá)患者的DFS均優(yōu)于IL-17RA高表達(dá)患者(P<0.05)，提示NSCLC患者中腫瘤組織內(nèi)IL-17RA表達(dá)陽性是預(yù)后不良的因素。COX回歸多因素分析結(jié)果顯示，腫瘤分化程度、病理分期、IL-17RA表達(dá)均是NSCLC患者DFS重要的影響因素，檢測IL-17RA可能會成為預(yù)測肺癌預(yù)后的重要免疫學(xué)指標(biāo)。IL-17R作為IL-17靶細(xì)胞膜表面受體，在腫瘤中的作用機(jī)制長期以來都未完全清楚。最近的一項研究報道，IL-17RE可以形成異二聚體復(fù)合物與IL-17RA形成異二聚體復(fù)合物的形式，共同參與誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，并與肝癌細(xì)胞侵襲性密切相關(guān)[10]。Liao等[11]對300例肝癌術(shù)后標(biāo)本中IL-17和IL-17(A-E)表達(dá)水平與預(yù)后關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)IL-17和IL-7RE的高表達(dá)，與肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)患者較差的預(yù)后和復(fù)發(fā)增加有顯著相關(guān)性，認(rèn)為細(xì)胞因子IL-17與IL-17RE在腫瘤中單獨或協(xié)同作用，可以預(yù)測肝癌早期復(fù)發(fā)和晚期復(fù)發(fā)。另外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌中IL-17和foxp3在癌組織中的表達(dá)均是影響預(yù)后的主要因素。當(dāng)臨床分期和IL-17及foxp3表達(dá)相結(jié)合，可以更有效地評估預(yù)測手術(shù)患者術(shù)后生存[12]。

總之，本研究結(jié)果顯示IL-17RA在NSCLC癌組織中高表達(dá)，同時表達(dá)率隨著pTNM分期和腫瘤直徑增加呈上升趨勢，IL-17/IL-17RA在信號傳導(dǎo)過程中參與了NSCLC的進(jìn)展。生存分析顯示癌組

織IL-17RA表達(dá)情況可對NSCLC患者DFS產(chǎn)生影響，提示檢測IL-17RA可能會成為預(yù)測肺癌預(yù)后的重要免疫學(xué)指標(biāo)。今后需進(jìn)一步研究IL-17RA在NSCLC中刺激調(diào)節(jié)機(jī)制，全面地了解IL-17RA在炎癥及腫瘤等疾病中的作用機(jī)制，為探索以IL-17RA為靶點的腫瘤治療方法提供基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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(本文編輯楊晨晨)

High expression of IL-17RA with poor prognosis of Non-Small-Cell Lung Cancer

ZHAO Shuyuan, HE Dan, SUN wei

(DepartmentofThoracicSurgery,AffiliatedTumorHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

ObjectiveTo study the relationship between the expression of IL-17RA and prognosis in Non-Small-Cell Lung Cancer. Methods131 patients who had surgical resection and had with neither radiotherapy nor chemotherapy before operation were collected. Envision Immunohisto-chemistry analysis was used to detect the expression of IL-17RA in lung carcinoma tissues and surrounding tissues. The effect of IL-17RA expression on the 3a disease-free survival of patients (Disease-free survival, DFS) were analyzed with Kaplan-Meier method. ResultsThe positive expressions of IL-17RA in lung carcinoma tissues were significantly higher than those in the peritumor tissues (P<0.001). In the univariate analysis, the expression rate of IL-17RA was statistically different with the pathological type tumor size staging and P TNM staging (P<0.05). The Disease-free survival rate of patients was different between positive and negative IL-17RA expression (P=0.032) in lung carcinoma tissues. Cox multivariate analysis showed that the expression level of IL-17 were independent prognostic factors (P=0.041，HR=1.683). ConclusionThis study showed that IL-17RA expression of tumor tissue associated with poor prognosis.

non-small-cell lung cancer; Th17 cell; IL-17;IL-17RA

國家自然科學(xué)基金(81460354)

趙書源(1988-)，男，在讀碩士，研究方向：胸部腫瘤的綜合治療。

孫偉，男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：胸部腫瘤的綜合治療,E-mail:sunw69@163.com。

R734.2

A

1009-5551(2016)09-1151-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.09.018

2016-05-11]