白培賢，王麗鴛，韋康，阮麗，成浩，張芬，張成才

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國(guó)家茶樹(shù)改良中心/農(nóng)業(yè)部茶樹(shù)生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081

茶樹(shù)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆與表達(dá)分析

白培賢1，2，王麗鴛1*，韋康1，阮麗1，成浩1，張芬1，2，張成才1，2

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/國(guó)家茶樹(shù)改良中心/農(nóng)業(yè)部茶樹(shù)生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine Aminotransferase，AlaAT）是與碳氮代謝相關(guān)的一種重要酶類。采用反轉(zhuǎn)錄PCR的方法克隆了茶樹(shù)CsAlaAT1的cDNA序列，該序列全長(zhǎng)1 747 bp，包含一個(gè)完整的ORF（1 626 bp），編碼 541個(gè)氨基酸，推導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子量為 59.4 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為 5.82。同源比對(duì)結(jié)果表明，CsAlaAT1含有丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶亞家族保守的輔酶磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn)，其氨基酸序列與擬南芥 AtAlaAT1蛋白的相似性為84%。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示該蛋白由α-螺旋（40.67%）、無(wú)規(guī)則卷曲（29.57%）、β-折疊（13.68%）和延伸鏈（16.08%）組成，定位于線粒體，不含信號(hào)肽與跨膜結(jié)構(gòu)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CsAlaAT1在茶樹(shù)各組織中均有表達(dá)，在根中的表達(dá)量最高；CsAlaAT1基因表達(dá)對(duì)氮素的響應(yīng)研究表明，成熟葉中CsAlaAT1受氮素誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，高濃度（1 mmol·L-1NH4NO3）氮素的誘導(dǎo)效應(yīng)比低濃度（0.1 mmol·L-1NH4NO3）氮素誘導(dǎo)效應(yīng)更強(qiáng)烈；在根中，處理24 h后，高氮誘導(dǎo)CsAlaAT1上調(diào)表達(dá)，低氮誘導(dǎo)CsAlaAT1下調(diào)表達(dá)。

茶樹(shù)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；克??；表達(dá)；氮素誘導(dǎo)

氮素是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中需求量最大的礦質(zhì)元素，氮素供應(yīng)不足會(huì)嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量。為了保證產(chǎn)量，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中往往施用大量氮肥。但是大多數(shù)農(nóng)作物對(duì)氮肥的利用率只有三分之一，其余因流失而造成環(huán)境污染［1］。因此借助基因工程手段培育氮高效利用品種，成為降低氮肥施用量、減少環(huán)境污染的有效途徑之一［2］。

茶樹(shù)作為葉用作物，其氮素利用率只有18.4%～44.7%［3］，選育氮素利用效率高的品種一直是茶樹(shù)育種工作者的目標(biāo)之一。茶樹(shù)的氮素吸收利用率主要取決于其吸收、同化以及運(yùn)輸分配到收獲器官中的能力。目前茶樹(shù)中氮素吸收同化相關(guān)基因NR［4］（Nitrate reductase）、NRT［5-6］（Nitrate transporters）、GS［7］（Glutamine synthetase）、GOGAT（Glutamine-α-oxoglutarate aminotransferase ）、GDH［8］（Glutamate dehydrogenase）以及相關(guān)的 DOF轉(zhuǎn)錄因子［9］已經(jīng)被克隆。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，氮素同化的下游途徑基因也可以調(diào)控植物對(duì)氮素的吸收利用［10］。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase，AlaAT）催化丙氨酸和α-酮戊二酸形成丙酮酸和谷氨酸［11］，是植物體內(nèi)與碳氮代謝相關(guān)的一種重要酶類［12］。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶家族包含 4個(gè)成員，其中AlaAT1 和AlaAT2編碼AlaAT蛋白；GGAT1和GGAT2具有谷氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Glutamateglyoxylate aminotransferase，GGAT）活性［13-14］。在擬南芥的葉、根和花器官［13］，水稻的果實(shí)［15］、內(nèi)胚乳［16］中，均可檢測(cè)到AlaAT酶的活性。有研究顯示，AlaAT參與了光合作用的C4途徑［17-18］和 L-丙氨酸的轉(zhuǎn)氨降解途徑。植物AlaAT酶活性受到光照刺激的調(diào)控。例如，黃化的黍稷幼苗受到光刺激后，葉片中的AlaAT-2基因上調(diào)表達(dá)［18］。AlaAT酶活性還受到低氧脅迫的調(diào)控，參與解除低氧脅迫后丙氨酸的降解過(guò)程［2］。有研究將大麥［10-19］的HvAlaAT基因轉(zhuǎn)入水稻和歐洲油菜中，轉(zhuǎn)基因植株不僅產(chǎn)量得到顯著提高，其生物量也顯著增加，這暗示著AlaAT基因在以采葉為主的茶樹(shù)中，可能具有同樣的增產(chǎn)和改善氮素利用效率的作用，而茶樹(shù)上尚無(wú)關(guān)于AlaAT基因的報(bào)道。本研究根據(jù)茶樹(shù)根轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的AlaAT的 cDNA 全長(zhǎng)序列，克隆了茶樹(shù)CsAlaAT1基因，并分析該基因的組織表達(dá)特性及氮素對(duì)該基因表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究該基因在氮素吸收利用及低氧脅迫中的作用提供研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1茶樹(shù)CsAlaAT1基因的克隆

1.1.1總RNA提取和第一鏈cDNA的合成

采用天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（離心柱型），提取龍井43葉片中的總RNA，并用 1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)完整性，采用Takara PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.1.2目的基因的全長(zhǎng)驗(yàn)證

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中獲得的CsAlaAT1的核酸序列，用DNAStar軟件包中的EditSeq軟件查找該基因的開(kāi)放閱讀框（ORF），并根據(jù)ORF兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)引物，正向引物：GTGCAAAATGTGGAAATTCGTAGC；反向引物：CAAGGGGCAAGGTTGGATTTG。用該引物做PCR對(duì)CsAlaAT1基因的ORF進(jìn)行擴(kuò)增，以 0.5 μL第一鏈 cDNA為模板，加入10×LA Taq bufferⅡ（Mg2+，plus）5 μL，dNTPMix（2.5 mmol·L-1each）8 μL，正反向引物各 1.5 μL，LA Taq（50 U·μL-1）0.5 μL，加滅菌的ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證目標(biāo)條帶，用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物鏈接pMD18-T載體后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR挑選陽(yáng)性克隆送往上海華津生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用 MEGA 6.0軟件比對(duì)后發(fā)現(xiàn)克隆的cDNA序列具有CsAlaAT1基因完整的ORF。

1.2生物信息學(xué)分析

采用BioEdit軟件對(duì)本研究獲得的CsAlaAT1基因的cDNA序列進(jìn)行ORF查詢后輸出氨基酸序列。在ExPASy網(wǎng)站（http：//www.expasy.org/resources）用ProtParam軟件推導(dǎo)蛋白質(zhì)的分子量和理論等電點(diǎn)，SignalP預(yù)測(cè)信號(hào)肽，TMHMM預(yù)測(cè)跨膜螺旋，PredictProtein進(jìn)行蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位。在NCBI網(wǎng)站上swiss-prot數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索CsAlaAT1的同源蛋白，用MEGA 6.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，并在ClustalW軟件上進(jìn)行多序列比對(duì)，在 GeneDoc中編輯輸出。SWISS-MODEL模擬 CsAlaAT1蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，并用Swiss-PdbViewer編輯輸出。

1.3氮素響應(yīng)試驗(yàn)

參試材料為龍井43、中茶108和中茶302 等3個(gè)品種的2年生扦插苗，水培于溫室中。水培溶液的配方參照Ruan等［20］稍作調(diào)整，包括大量元素N（0.2 mmol·L-1或2 mmol·L-1），P（0.07 mmol·L-1），K（0.67 mmol·L-1），Ca（0.53 mmol·L-1），Mg（0.67 mmol·L-1）和微量元素Zn（0.67 μmol·L-1），Cu（0.13 μmol·L-1），Mn（1.0 μmol·L-1），B（7.0 μmol·L-1），Mo（0.33 μmol·L-1），F(xiàn)e（4.2 μmol·L-1），Al（70 μmol·L-1）及EDTA鹽（4.2 μmol·L-1）。

長(zhǎng)勢(shì)良好的茶苗氮饑餓預(yù)培養(yǎng)兩周后，分別在低氮（0.1 mmol·L-1NH4NO3）和高氮（1 mmol·L-1NH4NO3）濃度的營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行處理，每隔2 d換一次營(yíng)養(yǎng)液。于氮素處理后0、24、72、120、168 h時(shí)取樣，第一次取樣時(shí)間為上午10：00，每次取3株茶苗的一芽二葉，成熟葉和嫩根組織，用蒸餾水清洗后轉(zhuǎn)入液氮，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4茶樹(shù)CsAlaAT1基因的表達(dá)分析

利用在線軟件Primer-blast設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，正向引物：TCCCGGTCTATG GGGTATGG，反向引物：CTCCAACCTT GGGAGGGTTC，反應(yīng)體系參照胡娟等［9］。反應(yīng)程序：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。反應(yīng)在 ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，4次技術(shù)性重復(fù)，以GAPDH為內(nèi)參基因，用法計(jì)算結(jié)果。

2　結(jié)果與分析

2.1CsAlaAT1基因的克隆與序列分析

反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增得到CsAlaAT1的cDNA（圖1）。經(jīng)測(cè)序，獲得的cDNA全長(zhǎng)1 747 bp，編碼序列區(qū)長(zhǎng)度為1 626 bp，編碼541個(gè)氨基酸殘基。預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為 59.4 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為5.82，總平均親水性：-0.174，為親水性蛋白，不穩(wěn)定指數(shù)：47.40，表示該蛋白在植物體內(nèi)可能不穩(wěn)定。

圖1　CsAlaAT1基因RT-PCR電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of CsAlaAT1 cloning by RT-PCR

注：a：磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn)；b：同源二聚體接觸面；c：催化位點(diǎn)。AtAlaAT2：擬南芥AlaAT2（sp_Q9LDV4.1）；AtAlaAT1：擬南芥AlaAT1（sp_F4I7I0.1）；CsAlaAT1：茶樹(shù)AlaAT1；HvAlaAT2：大麥AlaAT2（sp_P52894.1）；PmAlaAT2：黍稷AlaAT2（sp_P34106.1）。Note：a：pyridoxal 5′-phosphate binding site.b：homodimer interface.c：catalytic residue.AtAlaAT2：Arabidopsis thaliana AlaAT2（sp_Q9LDV4.1）.AtAlaAT1：Arabidopsis thaliana AlaAT1（sp_F4I7I0.1）.CsAlaAT1：Camellia sinensis AlaAT1.HvAlaAT2：Hordeum vulgare AlaAT2（sp_P52894.1）.PmAlaAT2：Panicum miliaceum AlaAT2（sp_P34106.1）.圖2 CsAlaAT1與其他植物AlaAT蛋白序列同源比對(duì)Fig.2 Alignment of the protein sequences of CsAlaAT1 and AlaATs from other species

2.2同源比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的構(gòu)建

在NCBI網(wǎng)站上，將推測(cè)的CsAlaAT1氨基酸序列于swiss-prot數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTP同源序列搜索并進(jìn)行多序列比對(duì)（圖 2），結(jié)果顯示，CsAlaAT1與擬南芥（Arabidopsis thaliana）AlaAT1、AlaAT2，大麥（Hordeum vulgare）和黍稷（Panicum miliaceum）AlaAT2的相似性分別為 78%，84%，72%，79%，CsAlaAT1具有丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶亞家族保守的輔酶磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn)，屬于丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶亞家族。將茶樹(shù)CsAlaAT1的氨基酸序列與擬南芥、水稻（Oryza sativa）、亞麻薺（Camelina sativa）、大豆（Glycine max）、黃瓜（Cucumis sativus）、玉米（Zea mays）、大麥7個(gè)物種的14條AlaAT蛋白序列在MEGA 6.0中進(jìn)行比對(duì)分析，并用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（圖3）。結(jié)果表明，不同物種的AlaAT1 與AlaAT2蛋白并沒(méi)有聚在一起，表明AlaAT基因的演化情況比較復(fù)雜；茶樹(shù)AlaAT1與黃瓜 AlaAT2、大豆 AlaAT1聚在一起，推測(cè)CsAlaAT1與之具有相似的生物學(xué)功能。

2.3CsAlaAT1的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示CsAlaAT1蛋白主要由α-螺旋（40.67%）和無(wú)規(guī)則卷曲（29.57%）組成，β折疊（13.68%）和延伸鏈（16.08%）僅占一小部分，不含信號(hào)肽（圖4左），無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)（圖 4右），定位于線粒體（圖 5）。在SWISS-MODEL中進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖6），結(jié)果表明，CsAlaAT1蛋白為同源二聚體，其推測(cè)的催化位點(diǎn)為第358位的賴氨酸殘基。

2.4CsAlaAT1基因的表達(dá)分析

2.4.1組織表達(dá)特性

將龍井43、中茶108和中茶302 3個(gè)品種的 2年生無(wú)性系茶苗在正常氮素濃度的營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)7天后，對(duì)其一芽二葉、成熟葉和嫩根中CsAlaAT1基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖7）顯示，CsAlaAT1基因在3個(gè)組織中均有表達(dá)，且在根中的表達(dá)量高于一芽二葉和成熟葉。CsAlaAT1基因表達(dá)的組織特異性在品種間存在差異。龍井 43和中茶 108的CsAlaAT1基因在一芽二葉、成熟葉和嫩根中的表達(dá)量依次遞增，中茶302的CsAlaAT1基因表達(dá)量在嫩根、一芽二葉和成熟葉中依次遞減。

圖3　不同物種AlaAT蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of AlaAT proteins from various species

2.4.2CsAlaAT1基因時(shí)空表達(dá)對(duì)不同氮素水平的響應(yīng)

氮饑餓2周后，高氮處理后茶苗的一芽二葉、成熟葉和根中CsAlaAT1基因的表達(dá)量均高于低氮處理（圖8）。表明CsAlaAT1基因表達(dá)對(duì)高氮素水平的響應(yīng)更強(qiáng)烈。

高氮培養(yǎng)24 h內(nèi)，CsAlaAT1基因在各組織的表達(dá)量均上調(diào)，一芽二葉、成熟葉中的表達(dá)量分別增加到原始表達(dá)量的1.7和2.2倍，24 h后呈下降趨勢(shì)；一芽二葉中的表達(dá)量在120 h降至最低，之后又迅速增加；根中的表達(dá)量在 72 h達(dá)到最大，之后緩慢下降。在低氮水平下，一芽二葉中CsAlaAT1基因的表達(dá)量呈現(xiàn)略微上調(diào)趨勢(shì)；成熟葉中的表達(dá)量在72 h內(nèi)上調(diào)，120 h之后逐漸下降；根中的表達(dá)量在24 h內(nèi)增長(zhǎng)，之后呈下降趨勢(shì)，120 h達(dá)到最低，隨后又呈增加趨勢(shì)?？傮w而言，高氮條件下，CsAlaAT1基因上調(diào)表達(dá)；在低氮處理24 h之后，CsAlaAT1基因在一芽二葉和成熟葉中上調(diào)表達(dá)，在根系中下調(diào)表達(dá)。

圖4　SignalP和TMHMM軟件預(yù)測(cè)CsAlaAT1蛋白信號(hào)肽和跨膜螺旋Fig.4 Prediction of signal peptide and transmembrane helix in CsAlaAT1 by SignalP and TMHMM respectively

圖5　PredictProtein預(yù)測(cè)CsAlaAT1的亞細(xì)胞位置Fig.5 Subcellular location prediction of CsAlaAT1 by PredictProtein

圖6　通過(guò)在線軟件SWISS-MODEL預(yù)測(cè)的CsAlaAT1蛋白三維結(jié)構(gòu)Fig.6 Three-dimensional structure prediction of protein CsAlaAT1 by online software SWISS-MODEL

圖7　CsAlaAT1基因在不同組織的表達(dá)水平Fig.7 Relative expression levels of CsAlaAT1 in different tissues of tea plants

圖8　在低氮和高氮處理下茶樹(shù)CsAlaAT1基因不同時(shí)間的表達(dá)水平Fig.8 Time course of relative expression levels of CsAlaAT1 under low and high nitrogen levels

3　討論

3.1茶樹(shù)CsAlaAT1基因的克隆及其序列分析

茶樹(shù)葉片中克隆出的CsAlaAT1基因編碼541個(gè)氨基酸，與擬南芥、大麥和黍稷的AlaAT相似性達(dá)70%以上，屬于丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶亞家族。預(yù)測(cè)CsAlaAT1不含信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，定位于線粒體。這與擬南芥AtAlaAT2同樣位于線粒體的預(yù)測(cè)結(jié)果相一致［14，21］。AtAlaAT位于線粒體可能與其代謝功能直接相關(guān)［22］，線粒體 AlaAT似乎可以通過(guò)增加丙酮酸含量而激活線粒體中的交替氧化酶，從而調(diào)節(jié)植物的呼吸氧耗［23］。

3.2CsAlaAT1組織表達(dá)特性及其對(duì)氮素響應(yīng)的時(shí)空表達(dá)差異

Rocha等［12］研究表明 AlaAT-A類基因在根系和結(jié)節(jié)中表達(dá)量最高，因此推測(cè)，AlaAT基因功能的發(fā)揮可能更多地依賴于根系。Miyashita等［11］發(fā)現(xiàn)擬南芥 AlaAT基因主要在葉片和根系的維管組織中表達(dá)，推測(cè) AlaAT酶可能在丙酮酸或者丙氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，有利于維持整株植物的碳氮平衡［23］。本研究組織表達(dá)特性檢測(cè)表明，CsAlaAT1基因在各組織中均有表達(dá)，在根中表達(dá)量最高，這與其他植物中的研究結(jié)果一致。

CsAlaAT1在不同品種間的表達(dá)特性也存在差異。中茶302的一芽二葉中，該基因的表達(dá)量高于成熟葉，為其他兩個(gè)品種一芽二葉中的2倍以上。有研究顯示，在相同栽培條件下，中茶 302茶苗的生長(zhǎng)勢(shì)以及鮮葉產(chǎn)量均高于中茶108和龍井43［24］，因此推測(cè)該基因表達(dá)量的品種間差異與生長(zhǎng)勢(shì)差異相關(guān)。AlaAT是與氮代謝相關(guān)的一種酶，中茶302一芽二葉中CsAlaAT1的高表達(dá)，可能有利于茶苗對(duì)氮素的利用，進(jìn)而促進(jìn)其生物量的增加。

AlaAT基因的表達(dá)受氮素調(diào)控。Kendziorek等［22］研究表明，小麥在缺氮培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，芽和根中的AlaAT酶活性降低了一半以上，而在正常培養(yǎng)基上培養(yǎng)的小麥中，AlaAT酶活性保持不變。氮素脅迫解除后恢復(fù)供氮短期內(nèi)，黍稷［17］葉片中AlaAT2基因的表達(dá)量增加了3倍，玉米［25］根系中的AlaAT基因的表達(dá)量增加了14倍。本研究對(duì)茶苗在氮饑餓2周后，分別用低氮和高氮進(jìn)行處理，恢復(fù)供氮24 h內(nèi)，CsAlaAT1基因均上調(diào)表達(dá)，表明茶樹(shù)CsAlaAT1基因?qū)Φ卣T導(dǎo)有響應(yīng)。高氮處理下，CsAlaAT1基因的表達(dá)量更高，表明CsAlaAT1基因的時(shí)空表達(dá)對(duì)高氮水平的響應(yīng)更強(qiáng)烈；其一芽二葉和成熟葉中表達(dá)量均增加了2倍左右，根系中增加了約1.2倍，較之黍稷葉片（3倍）和玉米根系（14倍），CsAlaAT1基因的表達(dá)增量較低。本研究推測(cè)茶樹(shù)作為木本植物，調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜，多途徑參與對(duì)氮素的響應(yīng)是造成該差異的原因。在根中，高氮處理24 h后，CsAlaAT1上調(diào)表達(dá)，而低氮處理24 h后，CsAlaAT1表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，其他作物中并沒(méi)有關(guān)于不同濃度氮素對(duì)CsAlaAT1基因表達(dá)調(diào)控的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，CsAlaAT1在不同氮素濃度下表達(dá)模式不同，推測(cè)CsAlaAT1基因受氮素有效性的調(diào)節(jié)，但是該基因與茶樹(shù)氮素吸收和同化的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

［1］Raun WR，Solie JB，Johnson GV，et al.Improving nitrogen use efficiency in cereal grain production with optical sensing and variable rate application ［J］.Agron J，2002，94（4）：815-820.

［2］de Sousa CAF，Sodek L.Alanine metabolism and alanine aminotransferase activity in soybean（Glycine max）during hypoxia of the root system and subsequent return to normoxia ［J］.Environ Exp Bot，2003，50（1）：1-8.

［3］吳洵，茹國(guó)敏.茶樹(shù)對(duì)氮肥的吸收和利用［J］.茶葉科學(xué)，1986，6（2）：15-24.

［4］周月琴，龐磊，李葉云，等.茶樹(shù)硝酸還原酶基因克隆及表達(dá)分析［J］.西北植物學(xué)報(bào)，2013，33（7）：1292-1297.

［5］馮素花.茶樹(shù)硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 NRT1.2、NRT1.5、NRT2.5基因的克隆與表達(dá)［D］.杭州：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，2014.

［6］汪進(jìn)，添先鳳，江昌俊.茶樹(shù)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆與表達(dá)分析［J］.植物生理學(xué)報(bào)，2014，50（7）：983-988.

［7］徐乾.茶樹(shù)中與氨基酸合成相關(guān)的三個(gè)基因的克隆與分析［D］.合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

［8］林鄭和，鐘秋生，陳常頌.茶樹(shù)葉片 GDH、GS、GOGAT基因的克隆及熒光定量 PCR分析［J］.茶葉科學(xué)，2012，32（6）：523-529.

［9］胡娟，王麗鴛，韋康.茶樹(shù) CsCDF1基因克隆及表達(dá)分析［J］.茶葉科學(xué)，2015，35（5）：501-511.

［10］Good AG，Johnson SJ，De Pauw M.Engineering nitrogen use efficiency with alanine aminotransferase ［J］.Can J Bot，2007，85（3）：252-262.

［11］Miyashita Y，Dolferus R，Ismond KP，et al.Alanine aminotransferase catalyses the breakdown of alanine after hypoxia in Arabidopsis thaliana ［J］.Plant J，2007，49（6）：1108-1121.

［12］Rocha M，Sodek L，Licausi F.Alalysis of alanine aminotransferase in various organs of soybean（Glycine max）and in dependence of different nitrogen fertilisers during hypoxic stress ［J］.Amino Acids，2010，39（4）：1043-1053.

［13］Igarashi D，Miwa T，Seki M，et al.Identification of photorespiratory glutamate：glyoxylate aminotransferase（GGAT）gene in Arabidopsis ［J］.Plant J，2003，33（6）：975-987.

［14］Liepman AH，Olsen LJ.Alanine aminotransferase homologs catalyze the glutamate：glyoxylate aminotransferase reaction in peroxisomes of Arabidopsis ［J］.Plant Physiol，2003，131（1）：215-227.

［15］Rech J，Crouzet J.Partial purification and initial studies of the tomato L-alanine：2-oxoglutarate aminotransferase ［J］.Biochim Biophys Acta，1974，350（2）：392-399.

［16］Kikuchi H，Hirose S，Toki S，et al.Molecular characterization of a gene for alanine aminotransferase from rice（Oryza sativa）［J］.Plant Mol Biol，1999，39（1）：149-159.

［17］Son D，Kobe A，Sugiyama T.Nitrogen-dependent regulation of the gene for alanine aminotransferase which is involved in the C4 pathway of panicum miliaceum ［J］.Plant Cell Physiol，1992，33（8）：507-509.

［18］Son D，Sugiyama T.Molecular cloning of an alanine aminotransferase from NAD-malic enzyme type C4plant Panicum miliaceum ［J］.Plant Mol Biol，1992，20（4）：705-713.

［19］Shrawat AK，Carroll RT，DePauw M.Genetic engineering of improved nitroge use efficiency in rice by the tissue-specific expression of alanine aminotransferase ［J］.Plant Biotechnology Jorunal，2008，6（7）：722-732.

［20］Ruan J，Gerendas J，Hardter R，et al.Effect of nitrogen form and root-zone pH on growth and nitrogen uptake of tea（Camellia sinensis）plants ［J］.Ann Bot，2007，99（2）：301-310.

［21］Ricoult C，Echeverria LO，Cliquet JB，et al.Characterization of alanine aminotransferase（AlaAT）multigene family and hypoxic response in young seedlings of the model legume Medicago truncatula ［J］.J Exp Bot，2006，57（2）：3079-3089.

［22］Kendziorek M，Paszkowski A，Zagdanska B.Differential regulation of alanine aminotransferase homologues by abiotic stresses in wheat（Triticum aestivum L.）seedlings ［J］.Plant Cell Rep，2012，31（6）：1105-1117.

［23］Gupta KJ，Zabalza A，van Dongen JT.Regulation of respiration when the oxygen availability changes ［J］.Physiol Plant，2009，137（4）：383-391.

［24］闞君杰，丁仕波.山東日照市茶樹(shù)無(wú)性系良種引種試驗(yàn)初報(bào)［J］.茶業(yè)通報(bào)，2015，37（2）：66-70.

［25］Muench DG，Good AG.Hypoxically inducible barley alanine aminotransferase：cDNA cloning and expression analysis ［J］.Plant Mol Biol，1994，24（3）：417-427.

Cloning and Expression Analysis of Alanine Aminotransferase Gene in Camellia sinensis

BAI Peixian1，2，WANG Liyuan1*，WEI Kang1，RUAN Li1，CHENG Hao1，ZHANG Fen1，2，ZHANG Chengcai1，2

1.Tea Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，National Center for Tea Improvement，Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization，Ministry of Agriculture，Hangzhou 310008，China；
2.Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China

Alanine Aminotransferase（AlaAT）is a critical enzyme involved in carbohydrate and nitrogen metabolisms.In this study，a cDNA（1 747 bp）with a complete ORF（1 626 bp）of AlaAT1 was isolated from tea plant（Camellia sinensis）.The cDNA encodes a protein with 541 amino acids，which has a molecular mass of 59.4 kD and a theoretical isoelectric point（pI）of 5.82.The deduced sequence of protein CsAlaAT1 shared 84% similarity with AlaAT1 in Arabidopsis thaliana，which contains a highly-conserved pyridoxal 5′-phosphate binding site.Secondary structure prediction showed that the CsAlaAT1 was comprised of alpha helix（40.67%），random coil（29.57%），beta turn（13.68%）and extended strand（16.08%），localized in mitochondrion and had no signal peptide or transmembrane structure.The expression levels of CsAlaAT1 in various tissues and its responses to different N concentration were investigated by real-time fluorescent quantitative RT-PCR.The results of RT-PCR showed that CsAlaAT1 expressed in all tissues of tea plant and the highest transcript level was observed in roots.The transcript abundanceof CsAlaAT1 was up-regulated by N in both shoots and mature leaves，especially under high N condition.Interestingly，the expression of CsAlaAT1 in roots was highly induced high N condition，but showed an opposite trend under low N treatment for 24 h.

tea plant（Camellia sinensis），Alanine aminotransferase，cloning，expression，nitrogen induction

S571.1；Q52

A

1000-369X（2016）04-405-09

2016-03-24

2016-04-21

國(guó)家自然科學(xué)基金（31570695）、國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（nycytx-23）、浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重點(diǎn)專項(xiàng)（2012C2905-4）。

白培賢，女，碩士研究生，主要從事茶樹(shù)種質(zhì)資源與育種研究。*通訊作者：wangly@tricaas.com