張靜，蔡淑嫻，黃建安，3，4，李娟，3，4，鐘妮，陽衡，劉仲華，3，4*

1.湖南農(nóng)業(yè)大學茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.北京大學醫(yī)學部，北京 100191；

3.國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；4.植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128

茶黃素對BSA/MDA羰-氨交聯(lián)反應體系中的蛋白質(zhì)羰基化及其聚集化抑制作用研究

張靜1，蔡淑嫻2，黃建安1，3，4，李娟1，3，4，鐘妮1，陽衡1，劉仲華1，3，4*

1.湖南農(nóng)業(yè)大學茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.北京大學醫(yī)學部，北京 100191；

3.國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；4.植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128

本實驗構建了羰-氨交聯(lián)反應形成老年色素的體外反應模型，通過ThT熒光、掃描電子顯微鏡、透射電鏡、SDS-PAGE及 NBT染色等檢測手段，結果表明，茶黃素不僅可以抑制此模型中由于蛋白質(zhì)羰基化產(chǎn)生的老年色素，還可以抑制此模型中因蛋白質(zhì)聚集化產(chǎn)生的β-sheet結構。上述結果揭示了衰老機制中的蛋白質(zhì)羰基化與導致神經(jīng)退行性疾病的蛋白質(zhì)聚集化之間存在一定的相關性。

茶黃素；羰-氨交聯(lián)；老年色素；蛋白質(zhì)聚集化

茶黃素是紅茶中決定色香味及品質(zhì)的主要功能成分，是由兒茶素和沒食子酸等酚類物質(zhì)經(jīng)發(fā)酵、氧化后形成的一類能溶于乙酸乙酯，具有苯并卓酚酮的化合物總稱。紅茶茶黃素中一般以茶黃素（Theaflavin，TF）、茶黃素-3-沒食子酸酯（Theaflavin-3-gallate，TF-3-G），茶黃素-3'-沒食子酸酯（Theaflavin-3'-gallate，TF-3'-G）和茶黃素雙沒食子酸酯（Theaflavin-3，3'-gallate，TF-DG）4種為主體成分，分子結構如圖1。茶黃素化合物的許多生物活性主要來源于它們含有的較多酚羥基結構的抗氧化活性。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，茶黃素具有調(diào)節(jié)血脂［1］、抗氧化、抗腫瘤［2］及調(diào)節(jié)機體免疫、抗菌［3］、神經(jīng)保護［4］等多方面的藥理作用。

蛋白質(zhì)老年色素熒光物質(zhì)是脂質(zhì)過氧化和非酶糖基化過程中產(chǎn)生的一系列具有毒性的不飽和活性羰基化合物與蛋白質(zhì)氨基酸（主要是賴氨酸、精氨酸、半胱氨酸）的氨基基團反應，從而產(chǎn)生的羰-氨交聯(lián)反應產(chǎn)物［5-6］，隨著年齡增長這種生物體衰老標志物——老年色素也隨之積累。越來越多的研究表明，蛋白質(zhì)羰基化與神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病、帕金森癥及亨廷頓舞蹈癥等疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關［7］，此類疾病伴隨著蛋白質(zhì)錯誤折疊，同時產(chǎn)生富含 β折疊結構的不溶性淀粉樣沉積。有研究表明，阿爾茨海默病患者腦內(nèi)蛋白羰基含量大大提高，羰氨交聯(lián)產(chǎn)生的老年色素的量與癡呆嚴重程度存在相關性［8］。大多數(shù)研究表明［4，9-11］，以EGCG為主的綠茶多酚類化合物以及紅茶提取物能直接結合到松散無折疊的淀粉樣蛋白上，并能促進其形成無毒性單體結構而不是形成具有毒性的β折疊結構，同時這些功能成分也具有清除羰基化合物的作用［12-14］，兒茶素尤其是酯型兒茶素能顯著抑制MDA誘導的蛋白質(zhì)類老年色素物質(zhì)生成，同時其抑制作用與其結構的親核性有關［15］，但目前對堪稱茶中“軟黃金”的茶黃素單體的相關研究較為少見。因此，基于以上所述研究結論，本實驗通過構建羰-氨交聯(lián)反應形成老年色素的體外模型，分析紅茶功能活性成分中的4種主要茶黃素單體對此模型中羰-氨交聯(lián)反應過程中羰基化蛋白及毒性 β折疊結構生成的抑制作用。

注：a：茶黃素；b：茶黃素-3-沒食子酸酯；c：茶黃素-3'-沒食子酸酯；d：茶黃素雙沒食子酸酯。Note：a：TF，b：TF-3-G，c：TF-3'-G，d：TF-DG.圖1 4種茶黃素分子結構示意圖Fig.1 Structure of theaflavins

1　材料與方法

1.1材料與試劑

茶黃素單體（TF、TF-3-G、TF-3'-G、TF-DG含量>98%，北京工商大學提供），1，1，3，3-四甲基氧基丙烷（1，1，3，3-tetranethoxypropane，TMP）購自和光純藥工業(yè)株式會社，牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）及硫磺素-T（Thioflavin T，ThT）均購自Sigma公司，丙烯酰胺、N，N-甲叉丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉（SDS）、過硫酸銨、四甲基乙二胺（TEMED）、氯化硝基四氮唑藍（Nitroblue tetrazolium chloride，NBT）、甘氨酸、Tris-Base、考馬斯亮藍 R250、甘油、溴酚藍購自生工生物工程（上海）有限公司，即用型蛋白質(zhì)分子量標準marker購自Takara公司，彩色預染蛋白質(zhì)分子量標準Marker、Tris-HCl購自碧云天生物技術有限公司，甲醇、冰乙酸、氫氧化鉀等試劑為分析純級。

1.2主要儀器

SKY-200B搖床、水浴鍋、Christ ALPHA 1-2 LD冷凍干燥機、GS-800掃描儀、PowerPac 2000電泳儀（Bio-Rad）、Thermo Scientific Varioskan Flash光譜掃描多功能酶標儀、JSM-1230掃描電子顯微鏡、Zeiss 900透射電鏡。

1.3實驗方法

1.3.1BSA/MDA反應體系造模條件優(yōu)化

根據(jù)參考文獻［15］制備10 mmol·L-1MDA 及0.1 mol·L-1PBS磷酸緩沖液，將1 mg·mL-1BSA與不同濃度（0、1、2、3、4、5、8 mmol·L-1）的MDA置于PBS中反應，將體系在37℃、180 r·min-1搖床中孵育 3 d，取 0、1、2、3 d不同時間點樣品進行檢測，全過程無菌操作。

1.3.2藥物處理BSA/MDA反應體系

實驗設置空白對照組（control）、模型組（model）、藥物對照組（用于排除藥物干預組茶黃素本身對體系產(chǎn)生的影響）、藥物干預組，各組BSA最終質(zhì)量濃度1 mg·mL-1，模型組和藥物干預組MDA終濃度4 mmol·L-1，藥物對照組及干預組分別加入 TF、TF-3-G、TF-3'-G、TF-DG 4種茶黃素，各干預組濃度設置分別為60、120、180、240、300 μmol·L-1，用 0.1 mol·L-1PBS配制各組反應體系總體積為500 μL，體系置于搖床（37℃，180 r·min-1）中孵育48 h。

1.3.3ThT熒光檢測蛋白寡聚體形成與老年色素熒光值檢測

ThT是一種苯并咪唑鹽，ThT可以與富含β-sheet結構的分子相結合發(fā)出熒光，發(fā)射光譜呈現(xiàn)紅移的特點，ThT發(fā)出的熒光強度與被測分子β-sheet結構的含量呈正相關，因此在蛋白質(zhì)錯誤折疊的研究領域 ThT熒光探針是一種較為理想的檢測淀粉樣蛋白聚集體的方法。

取反應樣品溶液用ThT檢測反應體系中β折疊結構，每孔40 μL樣品與160 μL濃度為40 μmol·L-1ThT（ThT溶液用50 mmol·L-1甘氨酸，NaOH調(diào)pH至8.0的緩沖液配制）混合后用 96孔板于激發(fā)波長為 440 nm（band pass 5 nm），發(fā)射波長為485 nm的全自動酶標儀檢測熒光值。取一定量樣品用 PBS稀釋10倍，于酶標儀檢測老年色素熒光值，激發(fā)波長為395 nm，發(fā)射波長為460 nm。

1.3.4掃描電鏡

如 1.3.2制備樣品，經(jīng)冷凍干燥后將固體樣品做掃描電鏡檢測，觀察各組蛋白質(zhì)形態(tài)。

1.3.5透射電鏡

如1.3.2制備樣品，取control組、model組及TF處理組各10 μL，用雙蒸水稀釋的樣品滴于鍍膜銅網(wǎng)上，10 min后用濾紙沿邊緣吸干，滴加2%雙氧鈾負染色10 min后再次用濾紙吸干，透射電鏡下觀察蛋白質(zhì)形態(tài)并拍照（電壓100 kV）。

1.3.6SDS-PAGE電泳實驗

根據(jù) 1.3.2選擇藥物濃度為 240 μmol·L-1的反應體系制備樣品進行 SDS-PAGE電泳實驗。聚丙烯酰胺凝膠（厚度0.75 mm）為10%分離膠，5%濃縮膠。電泳緩沖液為甘氨酸緩沖液。將 5×變性上樣緩沖液與樣品溶液按體積比為1︰4混合，于沸水中煮10 min，取5 μL上樣，全程先施加80 V電壓至溴酚藍顯色劑跑過濃縮膠，再調(diào)整電壓至120 V，待溴酚藍指示劑接近凝膠邊緣停止電泳，取出凝膠置于水中漂洗數(shù)分鐘后固定45 min（固定液：10 mL冰乙酸、40 mL甲醇、50 mL水），水洗2次，每次10 min，考馬斯亮藍染色4 h，水洗至背景顏色褪去，用掃描儀成像拍照。

1.3.7電轉及NBT染色實驗

電轉實驗：將 SDS-PAGE電泳后凝膠切去周邊未點樣部分，剪取與之相同大小的硝酸纖維素膜，并于甲醇中浸泡1 min，將電轉裝置于電轉液中浸泡10 min，按照負極板-泡沫-三層濾紙-凝膠-硝酸纖維素膜-三層濾紙-泡沫-正極板的順序放置，疊放時去除氣泡，合緊電極板后倒?jié)M電轉液，電壓定為30 V，轉移2.5 h后取出。

NBT染色：配制濃度為2 mol·L-1的甘氨酸-KOH緩沖液（pH10），在避光條件下，稱取 NBT溶于 2 mol·L-1甘氨酸緩沖液（KOH 調(diào)pH至10）中制成0.24 mmol·L-1染色液，將已轉好的硝酸纖維素膜置于染色液中3 h后用雙蒸水清洗數(shù)分鐘，將膜轉移至潔凈玻璃片進行拍照。

2　結果與分析

2.1BSA/MDA反應體系模型建立

由圖2可知，BSA與不同濃度MDA產(chǎn)生羰-氨交聯(lián)反應體系，生成老年色素及 β-sheet結構的量隨著MDA濃度增大及時間的延長均有所升高，兩者增長趨勢相近，表明羰-氨交聯(lián)反應中老年色素的產(chǎn)生與蛋白質(zhì)聚集化存在一定相關性。綜合老年色素熒光值及 ThT熒光值兩個指標，可選擇較佳造模反應體系條件，即選擇4 mmol·L-1MDA與1 mg·mL-1BSA反應體系，37℃、180 r·min-1搖床孵育2 d。

2.2茶黃素對BSA/MDA體系蛋白質(zhì)羰基化的保護作用

熒光值檢測結果（圖3）表明，model組BSA與MDA孵育之后產(chǎn)生的熒光值與control組相比存在極顯著差異（P<0.01）；而加入不同濃度茶黃素干預能有效抑制熒光值的增加，各加藥組與 model組相比，差異極顯著（P<0.01），且藥物濃度越高，熒光值越小，存在一定的劑量依賴關系。整體而言，茶黃素 4種單體對體系產(chǎn)生的老年色素的抑制效果，大致為 TF-DG>TF-3-G>TF-3'-G>TF。由此可見，MDA能絞殺蛋白質(zhì)，生成老年色素熒光物質(zhì)，但茶黃素能較好地保護蛋白，抑制 MDA與活性蛋白發(fā)生羰-氨交聯(lián)反應并產(chǎn)生老年色素。

圖2　BSA與不同濃度MDA混合不同時間后老年色素熒光值（a）及ThT熒光值（b）結果Fig.2 Fluorescence value of age pigment and ThT of the reaction with different concentrations of MDA at different time

2.3茶黃素對BSA/MDA體系蛋白質(zhì)聚集化的保護作用

從ThT熒光檢測結果（圖4）可以看出，model組MDA與BSA反應產(chǎn)生β-sheet結構與control組相比，以及各不同濃度藥物干預組與model組相比，均存在極顯著差異（P<0.01）。表明此體系中MDA與BSA產(chǎn)生羰-氨交聯(lián)反應的同時發(fā)生蛋白質(zhì)聚集化，并產(chǎn)生大量β-sheet結構，此外，茶黃素能在一定程度上抑制MDA與BSA反應體系產(chǎn)生β-sheet結構，并存在一定劑量依賴關系。通過比較得出，茶黃素對 MDA/BSA體系蛋白質(zhì)聚集化抑制效果極為顯著，尤以TF-DG效果最佳。

注：##表示空白對照組與模型組之間在P<0.01水平差異顯著，**表示藥物干預組與模型組之間在P<0.01水平差異顯著。下同。Note：## indicates significantly different at P<0.01 between control and model group.** indicates significantly different at P<0.01 between drug-mediated group and model group.The same below.圖3 不同濃度茶黃素對BSA/MDA羰-氨交聯(lián)反應老年色素熒光物質(zhì)生成的抑制作用Fig.3 Inhibition of different concentration of theaflavins on generation of age pigment in the reaction of BSA/MDA

圖4　不同濃度茶黃素對BSA/MDA羰-氨交聯(lián)反應中β-sheet生成的抑制作用Fig.4 Inhibition of different concentration of theaflavins on generation of β-sheet in the reaction of BSA/MDA

2.4掃描電鏡及透射電鏡成像

通過掃描電鏡和透射電鏡（圖5）對處理樣品進行觀察分析，未經(jīng)處理的control組（圖5-A、5-G）蛋白質(zhì)呈較規(guī)則的圓形顆粒狀，model組（圖5-B、5-H）蛋白質(zhì)呈現(xiàn)纖維狀，經(jīng)茶黃素處理后（圖5-C、5-D、5-E、5-F、5-J），蛋白質(zhì)形態(tài)變得較為松散，且不同程度出現(xiàn)緊密的顆粒球狀蛋白，表明在BSA/MDA羰-氨交聯(lián)反應體系產(chǎn)生老年斑過程中，茶黃素單體成分使蛋白質(zhì)構象發(fā)生改變，在一定程度上抑制了蛋白質(zhì)纖維化及淀粉狀蛋白的生成。

注：A-F：掃描電鏡成像圖，G-J：透射電鏡成像圖。A、G：control；B、H：model；C、J：BSA/MDA+TF；D：BSA/MDA+TF-3-G；E：BSA/MDA+TF-3'-G；F：BSA/MDA+TF-DG。Note：A-F：image map of SEM，G-J：image map of TEM.A，G：control.B，H：model.C，J：BSA/MDA+TF.D：BSA/MDA+TF-3-G.E：BSA/MDA+TF-3'-G.F：BSA/MDA+TF-DG.圖5 茶黃素處理BSA/MDA羰-氨交聯(lián)體系的掃描電鏡和透射電鏡成像圖Fig.5 Scanning electron microscopeand transmission electric microscope graphs of samplesin SEM and TEM treated with theaflavins

2.5茶黃素影響B(tài)SA/MDA體系蛋白質(zhì)聚集化SDS-PAGE及NBT染色結果

由SDS-PAGE電泳圖（圖6）可知，Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ組48 h所對應的條帶濃縮膠出現(xiàn)了大分子聚集體（圖 6黑色箭頭所指），這些聚集體是高分子量蛋白質(zhì)，藥物干預組經(jīng)茶黃素處理 48 h后主條帶向大分子與小分子彌散開且高分子量條帶更加明顯。從電轉染色情況來看，茶黃素組主條帶向高分子量部分彌散并堆積，且這些部分均可在纖維素膜上NBT染色，而control組及model組濃縮膠部分并未出現(xiàn)高分子量蛋白或發(fā)生彌散，且NBT并未染色，說明茶黃素可直接結合于未折疊或預折疊的蛋白質(zhì)上，從而使結構發(fā)生變化并擁有醌式結構，這種作用使蛋白質(zhì)在聚集化中變?yōu)闊o定形大分子量纖維態(tài)沉積，而不是富含 β-sheet結構的毒性中間體（圖 6白色箭頭所指）。

注：Ⅰ：Marker；Ⅱ：Control；Ⅲ：Model；Ⅳ：BSA/MDA+TF；Ⅴ：BSA/MDA+TF-3-G；Ⅵ：BSA/MDA+TF-3'-G；Ⅶ：BSA/MDA+TF-DG。Note：Ⅰ：Marker，Ⅱ：Control，Ⅲ：Model，Ⅳ：BSA/MDA+TF，Ⅴ：BSA/MDA+TF-3-G，Ⅵ：BSA/MDA+TF-3'-G，Ⅶ：BSA/MDA+TF-DG.圖6 BSA/MDA反應體系經(jīng)茶黃素處理后的SDS-PAGE電泳圖譜（A）和NBT染色圖譜（B）Fig.6 SDS-PAGE（A）and NBT staining（B）analysis of samples in SEM and TEM treated with theaflavins

3　討論

本實驗成功構建BSA/MDA羰-氨交聯(lián)反應體系體外模型，篩選出最佳MDA反應濃度為 4 mmol·L-1，與 BSA于 37℃、180 r·min-1搖床環(huán)境下孵育 2 d。實驗結果顯示，反應體系的ThT及老年色素產(chǎn)物熒光值隨MDA濃度及孵育時間的增加而升高，表明羰-氨交聯(lián)反應過程中 β-sheet結構與老年色素的生成量在一定程度上呈正相關。

茶黃素 4種主要單體對羰-氨交聯(lián)反應體系進行干預實驗，通過設置藥物對照組排除茶黃素自氧化以及顏色背景等自身產(chǎn)生的影響，在此前提下所得實驗結果表明，茶葉中這些功能成分對體系羰基化產(chǎn)物即老年色素熒光物質(zhì)的產(chǎn)生均具有一定抑制作用，同時，也能降低 β-sheet結構生成。從實驗結果可得出茶黃素抑制效果較為明顯，且茶黃素4種單體中以TF-DG效果最佳。有研究表明，沒食子?；且种启?氨交聯(lián)反應的核心功能基，在氧化還原活性基團的協(xié)同作用下能更有效地清除MDA等毒性羰基化合物，從而延緩甚至逆轉羰-氨交聯(lián)反應的進行與惡化［15］，同時，C6-C6結構可能是抑制淀粉樣蛋白聚集化的有效新型多酚類的活性官能團［16］，茶黃素不僅具有與兒茶素分子相類似的酚羥基結構，并且其分子結構中的苯并卓酚酮結構共軛體系空間更大，具有更多的酚羥基團，TF-DG是茶黃素類中酚羥基團最多的化合物［17］。由此推測，茶黃素可能因具有這些優(yōu)勢結構而對老年色素熒光物質(zhì)及 β-sheet結構具有顯著抑制作用，且TF-DG效果最佳，具體哪一個或哪幾個功能基團產(chǎn)生作用需待進一步實驗加以驗證。

通過SDS-PAGE電泳和NBT染色結果進一步說明了茶黃素能直接結合蛋白生成醌類物質(zhì)，減少蛋白質(zhì)纖維化過程中產(chǎn)生的富含β-sheet結構的毒性寡聚體，促進生成毒性較弱的大分子量蛋白，從 SDS-PAGE電泳圖可知茶黃素加藥組在孵育 48 h后條帶彌散程度以及NBT染色程度均較明顯，由此說明茶黃素抑制效果十分顯著，且與 ThT熒光檢測結果相符。經(jīng)掃描電子顯微鏡以及透射電鏡對各組進行成像觀察，進一步說明藥物可直接改變蛋白質(zhì)構象從而抑制蛋白質(zhì)纖維化及老年斑的形成。

老年性癡呆發(fā)生發(fā)展的早期分子病因與人體衰老過程的共性生化過程一脈相承，占據(jù)衰老生化機理首要位置的“羰基應激”［18］也是與增齡相關的淀粉樣蛋白形成、神經(jīng)纖維纏結、共核蛋白富集、神經(jīng)元自噬導致脂褐素堆積的重要生化基礎，但至今對兩者相關性分子機制研究較為少見。在醫(yī)藥領域，許多防治阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病藥物中的功效成分或功能團因子大多都是具有阻抑羰基化合物毒性的生化基團，本實驗表明了茶黃素不僅能抑制羰基應激產(chǎn)生的老年色素，從而具有潛在的減緩衰老作用，同時也能抑制蛋白質(zhì)聚集化從而可能具有預防老年癡呆等神經(jīng)退行性疾病功效，因此暗示了加強對生物體抗羰基應激可以成為一種頗有功效的抗神經(jīng)退行性等老年疾病的早期防治措施。

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Inhibition of Theaflavins on Protein Carbonylation and Aggregation in the System of BSA/MDA Carbonyl-ammonia Cross Linking Reaction in vitro

ZHANG Jing1，CAI Shuxian2，HUANG Jian'an1，3，4，LI Juan1，3，4，ZHONG Ni1，YANG Heng1，LIU Zhonghua1，3，4*

1.Key Laboratory of Ministry of Education for Tea Science，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China；
2.Peking University Health Science Center，Beijing 100191，China；
3.National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients，Changsha 410128，China；
4.Collaborative Innovation Center of Utilization of Functional Ingredients from Botanicals，Changsha 410128，China

A model of age pigment generation was builted by carbonyl-ammonia cross linking reaction in vitro，the datas indicate that theaflavins can not only inhibit the generation of age pigment in protein carbonylation，but also supress β-sheet-rich in aggregate protein in this model by thioflavin T-based fluorometric assay，scanning electron microscope，transmission electric microscope，SDS-PAGE and NBT staining，there are postive relationship between protein carbonylation on mechanism of aging and protein aggregation that lead to neurodegenerative disease.

theaflavin，carbonyl-ammonia cross linking reaction，age pigment，protein aggregation

Q946.84+1；Q51

A

1000-369X（2016）04-363-09

2016-02-28

2016-04-13

國家自然科學基金項目（31471590）、湖南省研究生科研創(chuàng)新項目（CX2015B245）、國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術體系項目（CARS-23-11B）。

張靜，女，博士，主要從事茶葉功能成分藥理研究。*通訊作者：larkin-liu@163.com