紀(jì)　昕，王　崇，李　潔，岳曉樂，張艷華，李永軍△

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科,石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心,石家莊 050011；3.河北省辛集市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科　052300)

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論著·基礎(chǔ)研究

淫羊藿苷通過增強(qiáng)Fas-FasL表達(dá)活性誘導(dǎo)裸鼠食管癌細(xì)胞凋亡*

紀(jì)昕1，王崇1，李潔2，岳曉樂1，張艷華3，李永軍1△

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科,石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心,石家莊 050011；3.河北省辛集市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科052300)

目的探討淫羊藿苷(icariin，ICA)對裸鼠體內(nèi)食管癌移植瘤生長的抑制作用，并初步探討其機(jī)制。方法應(yīng)用MTT方法和Giemsa染色法檢測和觀察ICA對食管癌細(xì)胞Eca-109和TE-13的體外抑制作用。構(gòu)建裸鼠的食管癌細(xì)胞移植性腫瘤模型，分為3組，每組6只。實(shí)驗(yàn)組每只裸鼠腹腔注射50 mg/kg ICA，對照組注射相同體積的生理鹽水，陽性對照組腹腔注射2 mg/kg順鉑，每2天1次，共14 d，每3天測量腫瘤體積，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱量腫瘤質(zhì)量；TUNEL染色法觀察各組裸鼠腫瘤組織的組織形態(tài)變化和凋亡情況；免疫組織化學(xué)法對腫瘤組織中Fas和FasL蛋白的表達(dá)變化進(jìn)行分析。ELISA法檢測外周血中FasL和IFN-γ的水平。結(jié)果ICA體外對食管癌細(xì)胞Eca-109和TE-13的增殖無明顯的抑制作用。實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組裸鼠腫瘤平均體積和質(zhì)量與對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TUNEL染色法結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組裸鼠的腫瘤組織發(fā)生了明顯的凋亡，凋亡細(xì)胞的數(shù)量較對照組明顯增加(P<0.05)。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤組織中Fas、FasL的表達(dá)明顯增加(P<0.05)。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組裸鼠外周血中FasL和IFN-γ的水平較對照組明顯增高(P<0.05)。結(jié)論ICA體外對食管癌細(xì)胞無明顯增殖抑制作用，但是通過Fas的表達(dá)、FasL和IFN-γ的分泌在體內(nèi)誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗食管癌的作用。

淫羊藿苷；食管腫瘤；Fas-FasL；細(xì)胞凋亡

食管癌是危害我國民眾健康最為嚴(yán)重的惡性腫瘤之一，依據(jù)2014年世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計(jì)結(jié)果，食管癌發(fā)病率在我國惡性腫瘤中居第5位，病死率居第4 位。2014年中國死于食管癌的人數(shù)約為197 400例，超過全世界食管癌總死亡人數(shù)的一半[1]。放射治療與化學(xué)治療對某些患者確實(shí)有效，也挽救了部分患者的生命，但有明顯的毒副作用，長期服用易造成患者免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和其他重要器官的嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致患者承受巨大的痛苦，生存質(zhì)量下降[2]。因此，尋找能夠協(xié)同或者代替放射治療與化學(xué)治療，確保治療效果，同時(shí)減低毒副作用的藥物是科研工作者長期而艱巨的任務(wù)。近年來，植物制劑及其衍生物的應(yīng)用在癌癥治療中發(fā)揮巨大作用[3-9]。淫羊藿為補(bǔ)益類中藥，具有溫腎壯陽，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕的功能，體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿的主體成分淫羊藿苷(icariin，ICA)具有良好的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性[10-13]。本研究通過構(gòu)建裸鼠食管癌移植瘤模型，并以生理鹽水和ICA分別處理裸鼠，監(jiān)測腫瘤的成瘤情況和生長狀況，并在腫瘤組織中檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，探討ICA對食管癌細(xì)胞的增殖和凋亡的影響，以期探索將ICA作為抗食管癌藥物的可能性。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料ICA購自美國Sigma公司，生產(chǎn)批號：MKBR8091V，純度大于96%，胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco-BRL公司，MTT和TUNEL染色試劑盒購自美國Promega公司，Giemsa染色試劑盒購自Baso公司，二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，IFN-γ和FasL的ELISA試劑盒購自伊萊瑞特(Elabscience)生物科技有限公司，兔抗鼠Fas、FasL一抗體購自Santa Cruz公司，SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組BALB/c型裸鼠，18只，5～6周齡，體質(zhì)量(20.2±0.7)g，雄性，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號SYXK(冀)2013-0051。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)動(dòng)物管理使用委員會(huì)和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)組裸鼠每只腹腔注射濃度10 mg/mL ICA 100 μL，給藥劑量為50 mg/kg，對照組注射相同體積的生理鹽水，陽性對照組腹腔注射順鉑(2 mg/kg)，每2天1次，共14 d，每3天測量腫瘤體積，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱量腫瘤質(zhì)量。按公式計(jì)算腫瘤體積：腫瘤體積=(1/2×長×寬2)。25 d后處死裸鼠并稱量腫瘤質(zhì)量。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)食管癌細(xì)胞系TE-13、Eca-109細(xì)胞由上?？茖W(xué)院細(xì)胞生物研究所提供。所有細(xì)胞系培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。以0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代，每1～2天換液1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4細(xì)胞活力檢測

1.4.1應(yīng)用MTT方法檢測10、50、100 mg/mL ICA對食管癌細(xì)胞Eca-109和TE-13增殖能力的影響于96孔板中加入1×104細(xì)胞并培養(yǎng)48 h，每孔加10 mg/mL MTT 10 μL并于37 ℃ 孵育3 h，然后移除上清液，加入150 μL DMSO并于室溫輕輕搖晃15～20 min。用全自動(dòng)定量酶標(biāo)儀在波長492 nm處測定吸光度(A)，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3遍。ICA對食管癌細(xì)胞增殖的作用以細(xì)胞增長抑制率表示，用公式表示：抑制率=[(對照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對照組A值]×100%。

1.4.2應(yīng)用Giemsa染色法觀察100 mg/mL ICA對食管癌細(xì)胞Eca-109和TE-13的體外抑制作用分別制備對照組和實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞涂片，干燥后于涂片上滴加A溶液0.5～0.8 mL，染液覆蓋整個(gè)涂片染色1 min，滴加B溶液于A溶液上，滴加量約為A溶液2倍，以洗耳球吹勻后染色5～10 min，蒸餾水沖洗、干燥后顯微鏡觀察細(xì)胞。

1.5裸鼠種植性腫瘤模型的建立、治療及標(biāo)本處理于BALB/c型裸鼠右側(cè)肩胛下注射0.1 mL TE-13細(xì)胞(含2×106個(gè)細(xì)胞)，當(dāng)腫瘤體積增長到約50 mm3，裸鼠被分為3組，每組6只。

1.6TUNEL染色法檢測細(xì)胞凋亡裸鼠移植瘤石蠟切片5 μm，二甲苯脫蠟，PBS沖洗，胰蛋白酶消化，PBS沖洗；加TUNEL反應(yīng)液37 ℃ 孵育60 min，PBS沖洗；加過氧化物酶抗體37 ℃ 孵育30 min，PBS沖洗；滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，室溫孵育10～30 min，PBS沖洗；封片、烘干，光鏡下觀察細(xì)胞核中有棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞。

1.7免疫組織化學(xué)檢測組織Fas、FasL蛋白表達(dá)水平將裸鼠移植瘤制成石蠟切片，按免疫組織化學(xué)試劑盒說明書所述方法檢測Fas、FasL蛋白的表達(dá)情況。FasL抗體按 1∶100 稀釋，生物素化山羊抗兔二抗和辣根過氧物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(三抗)為試劑盒中的原液。DAB試劑顯色后，用蘇木素對比染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察結(jié)果。

1.8ELISA方法檢測外周血FasL和IFN-γ表達(dá)水平通過摘眼球法取各組小鼠外周血液，凝集離心后取血清100 μL,用ELISA 試劑盒測定FasL和IFN-γ水平,操作步驟按產(chǎn)品說明書進(jìn)行,在酶標(biāo)測試儀上測定570 nm 處A值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出外周血液中FasL、IFN-γ的水平。

2　結(jié)　　果

2.1ICA對食管癌細(xì)胞增殖的抑制作用不同濃度的ICA處理食管癌細(xì)胞TE-13和Eca-109 48 h后，用MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的活性，研究結(jié)果顯示無毒劑量的10、50、100 mg/mL ICA對食管癌細(xì)胞系TE-13、Eca-109細(xì)胞的增殖無明顯影響，見圖1；且細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯的改變。

圖1　　ICA對食管癌細(xì)胞增殖抑制作用

A：對照組；B：實(shí)驗(yàn)組。

圖2TUNEL染色顯示荷瘤裸鼠移植瘤的凋亡情況(×200)

2.2ICA體內(nèi)抑制腫瘤的形成ICA能明顯抑制食管癌細(xì)胞在體內(nèi)的生長，見圖2。腫瘤細(xì)胞接種11 d后，對照組裸鼠的腫瘤體積開始增加，生長速度較快，而實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤體積增長緩慢。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)組裸鼠的腫瘤平均體積和質(zhì)量為(0.55±0.12)cm3、(0.32±0.09)mg，小于對照組的(0.91±0.35)cm3、(1.56±0.15)mg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，陽性對照組的(0.42±0.13)cm3、(0.26±0.06)mg，與對照組相比差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3ICA促進(jìn)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡對兩組荷瘤裸鼠的腫瘤組織進(jìn)行TUNEL染色。研究結(jié)果顯示，對照組裸鼠腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞核藍(lán)染，少見陽性凋亡細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤組織內(nèi)可見陽性凋亡細(xì)胞，且細(xì)胞數(shù)量明顯高于對照組。見圖2。

2.4ICA體內(nèi)調(diào)控腫瘤組織Fas和FasL蛋白的表達(dá)對兩組荷瘤裸鼠腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。Fas蛋白和FasL蛋白陽性染色定位于食管癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀分布。與對照組相比，ICA能夠升高Fas蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)升高FasL的表達(dá)水平。見圖3。

2.5ICA對裸鼠體內(nèi)血清FasL和IFN-γ分泌的影響與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血FasL和IFN-γ水平顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

A：對照組Fas；B：實(shí)驗(yàn)組Fas；C：對照組FasL；D:實(shí)驗(yàn)組FasL。

圖3裸鼠移植瘤組織中Fas和FasL蛋白的表達(dá)水平(免疫組織化學(xué)×200)

a：P<0.05，與對照組比較。

圖4荷瘤裸鼠外周血中IFN-γ和 FasL的分泌水平

3　討　　論

淫羊藿來源于小檗科多年生植物淫羊藿屬的多種植物,為傳統(tǒng)的補(bǔ)虛壯陽中藥。近年研究表明,從淫羊藿中分離的黃酮類化合物ICA具有刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)和刺激骨髓DNA合成的,增加外周血白細(xì)胞數(shù)量、骨髓造血干細(xì)胞中粒單系祖細(xì)胞數(shù)量等的功能，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。有文獻(xiàn)報(bào)道，100 mg/mL ICA能夠誘導(dǎo)肝癌HepG2.2.15細(xì)胞分化凋亡，抑制肝癌細(xì)胞和Hela細(xì)胞的生長[14]，中劑量ICA可以促進(jìn)H22肝癌移植瘤小鼠細(xì)胞凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了ICA在體內(nèi)外對食管癌細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果顯示用10、50、100 mg/mL濃度ICA體外處理食管癌細(xì)胞48 h后，對細(xì)胞的增殖無顯著影響，分析原因可能由于濃度較小未對食管癌細(xì)胞產(chǎn)生影響，但分別用生理鹽水和ICA處理小鼠25 d后，實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤的平均體積和質(zhì)量顯著降低；進(jìn)行腫瘤組織的TUNEL染色，結(jié)果顯示ICA可明顯誘導(dǎo)腫瘤組織內(nèi)的細(xì)胞發(fā)生凋亡，ICA (50 mg/kg)可明顯降低裸鼠體內(nèi)的腫瘤負(fù)荷。

凋亡的發(fā)生與基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增高等多種生物行為有關(guān)，有不同的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)介導(dǎo)和參與，其中Fas-FasL可直接啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的信號途徑，是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡最為重要的跨膜蛋白分子[16-17]。正常情況下，腫瘤細(xì)胞表達(dá)Fas，T淋巴細(xì)胞在腫瘤抗原刺激和輔助性T淋巴細(xì)胞作用下活化、增殖，表達(dá)FasL，兩者結(jié)合后，帶有死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白FADD可以激活Caspase基因，繼而激活下游半胱氨酸蛋白酶超家族系列成員，級聯(lián)反應(yīng)促使Fas蛋白所在細(xì)胞發(fā)生凋亡就可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。但是由于腫瘤細(xì)胞不表達(dá)、低表達(dá)或表達(dá)無功能的Fas[18]，亦或由于腫瘤細(xì)胞編碼的Caspase基因發(fā)生點(diǎn)突變，信號傳導(dǎo)機(jī)制產(chǎn)生缺陷，不能繼續(xù)向下傳遞凋亡信號，腫瘤細(xì)胞不發(fā)生凋亡就可能導(dǎo)致殺傷機(jī)制不能正常進(jìn)行。IFN-γ是一種由激活免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，具有直接抗腫瘤活性，或通過激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。Ⅰ型、Ⅱ型干擾素都具有調(diào)節(jié)和增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感作用。干擾素通過調(diào)節(jié)Fas-FasL信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是近年來腫瘤免疫學(xué)研究熱點(diǎn)之一，IFN-γ可以通過干擾素受體上調(diào)腫瘤細(xì)胞的Fas水平和淋巴細(xì)胞的FasL水平或影響Fas介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡敏感性加強(qiáng)該腫瘤免疫途徑，其可能機(jī)制是IFN-γ通過調(diào)控抗凋亡基因bcl-2家族、白細(xì)胞介素1β相關(guān)酶ICE基因、Caspase家族等相關(guān)基因而發(fā)揮作用。在本研究中，ICA可提升外周血中FasL和IFN-γ的分泌，并升高腫瘤組織內(nèi)Fas和FasL的表達(dá)水平，這可能是ICA發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機(jī)制之一。

迄今為止，惡性腫瘤的治療多為手術(shù)切除為主，放射治療、化學(xué)治療為輔的傳統(tǒng)方法，手術(shù)可以遏制腫瘤的繼續(xù)發(fā)展，但容易引起并發(fā)癥，如出血、術(shù)后感染、切口粘連等，且術(shù)后的復(fù)發(fā)率也較高。而放射治療和化學(xué)治療在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)也不可避免地?fù)p傷正常細(xì)胞，毒副作用往往很大，而ICA是在中醫(yī)配方中廣泛出現(xiàn)的補(bǔ)益類中藥，將可能成為一種潛在的安全的抗癌藥物。但是ICA抗腫瘤機(jī)制還需要進(jìn)一步研究和探討，解決此問題將有助于進(jìn)一步研究ICA的功能和作用機(jī)制，為ICA用于腫瘤的治療提供理論基礎(chǔ)。

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Icariin induces apoptosis of esophageal cancer cell through enhancing Fas-FasL expression activity*

JiXin1,WangChong1,LiJie2,YueXiaole1,ZhangYanhua3,LiYongjun1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,SecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050000,China;2.ScientificResearchCenter,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversit,Shijiazhuang,Hebei050011,China;3.DepartmentofClinicalLaboratory,XinjiMunicipalFirstHospital,Xinji,Hebei052300,China)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of icariin(ICA) on the xenograft tumors growth of esophageal carcinoma and to preliminarily investigate its mechanism.MethodsThe MTT assay and Giemsa staining were applied to detect and observe the in vitro inhibitory effect of ICA on esophagus cancer cell lines Eca-109 and TE-13.The xenograft tumor model of nude mouse esophagus cancer cell was constructed and divided into 3 groups,6 cases in each group.Each mouse in the experimental group was intraperitoneally injected by ICA 50 mg/kg;while the control group was injected by the same volume of normal saline and the positive control group was injected by cis-platinum 2 mg/kg,once every 2 days,a total of 14 days.The tumor volume was measured once per 3 d.After experiment,the tumor weight was measured;the TUNEL staining was used to observe the morphological changes and cell apoptosis of tumor tissue in each group.The changes of Fas and FasL protein expression in tumor tissues were analyzed by immunohistochemistry.The FasL and IFN-γ levels in peripheral blood were tested by the ELISA assay.ResultsICA exerted no obvious inhibitory effect on the proliferation of Eca-109 and TE-13 cell in vitro.The average volume and weight of xenografts tumor had statistical difference between the experimental group and the positive control group (P<0.05).The TUNEL staining results showed that the tumor tissues had obvious apoptosis,the number of apoptosis cells was significantly increased compared with the control group(P<0.05).The immunohistochemistry experimental results showed that the expression of Fas and FasL was significantly increased(P<0.05).The ELISA experimental results demonstrated that the FasL and IFN-γ levels of peripheral blood in the experimental group were significantly increased(P<0.05).ConclusionICA had no obvious inhibitory effect on esophageal cancer cell proliferation in vitro,but could induce in vivo apoptosis through the Fas expression and secretion of FasL and IFN-γ,thus plays the role of anti-esophageal cancer.

icariin;esophageal neoplasms;Fas-FasL;apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.12.008

河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃課題(2015124)。作者簡介：紀(jì)昕(1980-)，主管檢驗(yàn)師，碩士，主要從事臨床生物化學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn)研究?！?/p>

，E-mail:lyjj221@sina.com。

R735.1

A

1671-8348(2016)12-1608-04

2015-11-18

2015-12-28)