郭曉婭，年躍剛*，閆海紅,2，殷勤,2，高鵬，陳光偉

1.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院水污染控制技術(shù)研究中心，北京　100012 2.北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院，北京　100875 3.中藍(lán)連海設(shè)計(jì)研究院，上?！?01204 4.中糧生化能源(公主嶺)有限公司，吉林 四平　136100

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以玉米淀粉廢水為反硝化碳源的污染物降解特征與微生物群落結(jié)構(gòu)研究

郭曉婭1，年躍剛1*，閆海紅1,2，殷勤1,2，高鵬3，陳光偉4

1.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院水污染控制技術(shù)研究中心，北京100012 2.北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院，北京100875 3.中藍(lán)連海設(shè)計(jì)研究院，上海201204 4.中糧生化能源(公主嶺)有限公司，吉林 四平136100

反硝化；碳源；玉米淀粉廢水；三維熒光光譜；平行因子分析；微生物群落分析

廢水的脫氮效果很大程度上取決于廢水中反硝化碳源的含量及性能[1]。利用廢物作為有機(jī)碳源，不僅可以減少處理廢物的壓力，相對(duì)于目前開(kāi)發(fā)的其他類(lèi)碳源，如天然緩釋碳源[2-3]、人工降解材料[4-5]等，更能進(jìn)一步降低處理成本，在污水處理中更具有實(shí)際意義。淀粉廢水有機(jī)物濃度高、毒性小[6]，且廢水中的有機(jī)物以易降解有機(jī)物為主，是培養(yǎng)微生物的理想介質(zhì)[7-10]。

目前針對(duì)反硝化過(guò)程中有機(jī)物的降解特征主要采用CODCr和TOC濃度進(jìn)行表征，較少涉及溶解性有機(jī)物(dissolved organic matter，DOM)的降解特征。對(duì)反硝化過(guò)程中的DOM進(jìn)行分析，不僅能夠了解進(jìn)出水的DOM信息，也能反映反硝化過(guò)程中DOM隨時(shí)間的變化規(guī)律。三維熒光光譜(excitation-emission matrix spectrum, EEMs)技術(shù)近年來(lái)被廣泛用于研究DOM熒光性質(zhì)，其不僅能夠反映有機(jī)物的濃度，同時(shí)還可以提供有機(jī)物組成的信息[11]。但由于熒光峰之間的相互疊加，傳統(tǒng)的尋峰法以及區(qū)域積分法對(duì)重疊峰無(wú)法識(shí)別，2種方法均有一定的局限性。平行因子分析方法(parallel factor analysis，PARAFAC)是基于三線性數(shù)據(jù)分解理論，采用交替最小二乘法實(shí)現(xiàn)的數(shù)學(xué)模型[12]，可客觀識(shí)別出樣品中熒光峰的個(gè)數(shù)、種類(lèi)及各熒光峰的熒光強(qiáng)度等信息，具有廣泛的應(yīng)用前景。利用三維熒光光譜結(jié)合平行因子方法分析反硝化過(guò)程中DOM的降解特征，可以為反硝化反應(yīng)器的底物投加提供理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

碳源種類(lèi)是影響污泥菌群結(jié)構(gòu)的重要因素[13]，然而淀粉廢水對(duì)反硝化脫氮的菌群結(jié)構(gòu)影響卻鮮有報(bào)道。由于污泥中微生物群落組成復(fù)雜，試圖充分了解群落中微生物的結(jié)構(gòu)往往比較困難，近年來(lái)高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展為解決該問(wèn)題提供了新的方法。借助高通量技術(shù)深度研究淀粉廢水作為碳源的微生物多樣性，有助于進(jìn)一步研究反硝化過(guò)程的脫氮機(jī)理，對(duì)碳源的選擇和利用均有重要的指導(dǎo)作用。筆者分析了以玉米淀粉廢水處理過(guò)程中初沉池出水作為碳源時(shí)硝態(tài)氮和CODCr的降解過(guò)程，利用三維熒光光譜結(jié)合平行因子方法分析DOM的降解特征，并通過(guò)Illumina Hiseq 2500高通量測(cè)序技術(shù)分析廢水馴化污泥中的微生物多樣性，以期為淀粉廢水作為碳源的過(guò)程控制與資源化利用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1廢水來(lái)源

廢水取自吉林省某大型玉米深加工企業(yè)，初沉池廢水水質(zhì)指標(biāo)：CODCr為12 234 mgL；TN濃度為631 mgL；TP濃度為161 mgL；濃度為24 mgL；濃度為2.3 mgL；濃度為4.9 mgL；pH為4.0。

1.2試驗(yàn)方法

1.3分析方法

1.3.1常規(guī)指標(biāo)分析方法

1.3.2三維熒光光譜分析方法

水樣經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后稀釋10倍，使用F-7000型三維熒光分光光度計(jì)采集樣品的熒光信號(hào)。發(fā)射波長(zhǎng)為250～440 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為200～310 nm，激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)的狹縫寬度均為5 nm，掃描速度為12 000 nmmin。

在Matlab軟件上應(yīng)用drEEM工具箱[14]對(duì)樣品的三維熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行平行因子分析。在應(yīng)用模型之前，采用Delaunnay三角插值法去除拉曼和瑞利散射。結(jié)合核一致診斷法初步確定模型組分?jǐn)?shù)，通過(guò)對(duì)半檢驗(yàn)法來(lái)驗(yàn)證模型的可靠性，確定組分?jǐn)?shù)。

1.3.3微生物多樣性的測(cè)定

基因DNA的提取和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增：采用CTAB方法對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，取適量的樣品于離心管中，用無(wú)菌水稀釋樣品至1 ngμL。以稀釋后的基因組DNA為模板，選擇16S V4區(qū)，根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物(515F和806R)，New England Biolabs公司的Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序：使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit和Q-PCR定量，文庫(kù)合格后，使用Hiseq 2500 PE250進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

生物多樣性與分類(lèi)學(xué)分析：利用Uparse 軟件[15]對(duì)所有樣品的全部有效序列條數(shù)(Effective Tags)進(jìn)行聚類(lèi)，默認(rèn)以97%的一致性(identity)將序列聚類(lèi)成為OTUs(operational taxonomic units)，篩選OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋?zhuān)肦DP Classifier方法[16]與GreenGene數(shù)據(jù)庫(kù)[17]進(jìn)行物種注釋分析，并分別在界(kingdom)、門(mén)(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)、種(species)分類(lèi)水平下統(tǒng)計(jì)樣本的群落組成。

2　結(jié)果與討論

2.1反硝化過(guò)程中硝態(tài)氮濃度和CODCr的變化

污泥培養(yǎng)穩(wěn)定后，反硝化系統(tǒng)中硝態(tài)氮濃度和CODCr的變化如圖1所示。

圖1　反硝化過(guò)程中硝態(tài)氮濃度和CODCr變化Fig.1　Changes of the concentrations of nitrogen and CODCr in denitrification process

CODCr校準(zhǔn)=CODCr檢測(cè)-8

由圖1可知，反硝化過(guò)程中CODCr的降解速率較穩(wěn)定，在270 min內(nèi)，從864 mgL快速下降至102 mgL，說(shuō)明廢水中含有豐富的易降解有機(jī)物，可以被微生物快速利用。由于試驗(yàn)完全以廢水作為碳源，實(shí)際工程廢水中含有一定量碳源，廢水僅作為補(bǔ)充碳源進(jìn)行添加，廢水添加量可以進(jìn)一步減少，并且缺氧反硝化工藝后通常設(shè)有好氧工藝，有機(jī)物可以被進(jìn)一步降解，因此出水CODCr可以達(dá)到GB 8978—1996《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(100 mgL)限值，進(jìn)一步證明玉米淀粉廢水作為碳源的可行性。

2.2平行因子法解析反硝化過(guò)程

采用三維熒光光譜結(jié)合平行因子法分析反硝化過(guò)程中DOM的降解特征。利用核一致診斷法初步判斷模型組分，一般認(rèn)為核一致值大于60%時(shí)組分?jǐn)?shù)的選擇較合適。圖2為以初沉池出水作為反硝化碳源時(shí)組分?jǐn)?shù)分別為2和3的核一致診斷法結(jié)果。組分?jǐn)?shù)為2和3時(shí)，核一致值分別為99.87%和17.20%，因此初步擬定模型的組分?jǐn)?shù)為2。

對(duì)半分析法是將數(shù)據(jù)庫(kù)分為幾個(gè)部分，通過(guò)檢驗(yàn)各部分獲得的模型是否一致來(lái)判斷組分?jǐn)?shù)的合理性，以排除單獨(dú)一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)造成誤差的可能。將數(shù)據(jù)庫(kù)分解為A、B、C、D 4組，兩兩組合為1個(gè)半數(shù)據(jù)庫(kù)，驗(yàn)證AB、CD、AC、BD、AD以及BC 6個(gè)半數(shù)據(jù)庫(kù)與總數(shù)據(jù)庫(kù)的組分在激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的載荷同總數(shù)據(jù)庫(kù)的一致性。根據(jù)文獻(xiàn)[20]設(shè)定Matlab程序，即各組分的Tucker一致性系數(shù)大于0.95時(shí)可運(yùn)行成功，否則運(yùn)行錯(cuò)誤。圖3為組分?jǐn)?shù)為2時(shí)的對(duì)半分析結(jié)果。由圖3可見(jiàn)，當(dāng)模型組分?jǐn)?shù)為2時(shí)，各半數(shù)據(jù)庫(kù)與總數(shù)據(jù)庫(kù)的組分在激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的載荷基本重合。當(dāng)模型組分?jǐn)?shù)為3時(shí)，程序無(wú)法運(yùn)行成功，即數(shù)據(jù)庫(kù)各組分的Tucker一致性系數(shù)小于0.95，因此可以確定模型的組分?jǐn)?shù)為2。

圖2　核一致法判斷模型組分?jǐn)?shù)Fig.2　Model component estimation by the core consistency diagnostic

圖3　組分?jǐn)?shù)為2時(shí)的對(duì)半分析結(jié)果Fig.3　The results of split-half analysis when there were two components

根據(jù)平行因子模型識(shí)別出初沉池出水作為碳源的反硝化系統(tǒng)中DOM的2個(gè)熒光組分及各組分的最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，根據(jù)文獻(xiàn)[21-22]獲得對(duì)應(yīng)的熒光物質(zhì)類(lèi)型，如表1所示。2個(gè)熒光組分的三維熒光光譜如圖4所示。

表1　反硝化過(guò)程中2個(gè)熒光組分特征

圖4　平行因子模型鑒別出的2個(gè)熒光組分Fig.4　Two fluorescence components identified by the PARAFAC model

以初沉池出水為碳源的反硝化過(guò)程中各組分熒光強(qiáng)度和總熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化如圖5所示。

圖5　平行因子模型解析反硝化過(guò)程熒光強(qiáng)度變化Fig.5　Variation of fluorescence intensity against time identified by the PARAFAC model

由圖5可見(jiàn)，廢水中的熒光組分以組分1為主，隨著反硝化反應(yīng)的進(jìn)行，組分1的熒光強(qiáng)度以及總熒光強(qiáng)度在60 min之前呈小幅上升趨勢(shì)，這可能是由于加入廢水后，處于內(nèi)源呼吸期的微生物為應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物所致。60 min之后，組分1的熒光強(qiáng)度迅速下降，直至消失，說(shuō)明微生物可以快速利用廢水中的類(lèi)絡(luò)氨酸。系統(tǒng)中組分2在初始時(shí)刻熒光強(qiáng)度較弱，隨著時(shí)間的推移，其熒光強(qiáng)度逐漸加強(qiáng)，且組分1與組分2熒光強(qiáng)度不顯著相關(guān)，因此可以認(rèn)為組分2是反硝化過(guò)程中微生物代謝產(chǎn)生的類(lèi)色氨酸副產(chǎn)物。

2.3微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性

2.3.1污泥馴化前后綱水平下微生物群落結(jié)構(gòu)

經(jīng)初沉池廢水馴化過(guò)的二沉池活性污泥中，微生物群落在綱水平下的組成和相對(duì)豐度如圖6所示(僅列出相對(duì)豐度大于0.5%的綱類(lèi)，相對(duì)豐度低于0.5%的綱類(lèi)歸為其他)。經(jīng)初沉池廢水馴化后，活性污泥中優(yōu)勢(shì)種群種類(lèi)基本不變，但微生物豐度明顯發(fā)生變化。其中，β-變形菌綱(Betaproteobacteria)豐度顯著增加，由原二沉污泥中38.03%增加至59.34%。而β-變形菌綱的許多種類(lèi)都已證明具有良好的反硝化能力[23]。

圖6　微生物群落在綱水平的組成和相對(duì)豐度Fig.6　Composition and relative abundance of microbial communities at the class level

2.3.2馴化污泥目水平下微生物群落結(jié)構(gòu)

以初沉池廢水為碳源的反應(yīng)器內(nèi)有9種優(yōu)勢(shì)菌群，其中，第一優(yōu)勢(shì)菌群為未經(jīng)培養(yǎng)菌種(uncultured bacterium)，相對(duì)豐度為18.54%。其次為伯克氏菌目(Burkholderiales)、紅環(huán)菌目(Rhodocyclales)和嗜氫菌目(Hydrogenophilales)，相對(duì)豐度分別為14.65%、14.13%和9.63%。這3類(lèi)微生物均屬于β-變形菌綱。之后依次為梭菌目(Clostridiales)、擬桿菌目(Bacteroidales)、Saprospirales、厭氧繩菌目(Anaerolineales)和假單孢菌目(Pseudomonadales)，相對(duì)豐度分別為8.14%、5.06%、2.93%、1.57%和1.23%。

3　結(jié)論

(2)利用三維熒光光譜結(jié)合平行因子方法分析反硝化過(guò)程中DOM的降解特征，識(shí)別出反硝化過(guò)程中的2個(gè)溶解性有機(jī)物的熒光組分，分別為類(lèi)絡(luò)氨酸熒光組分〔組分1(230 nm310 nm、275 nm310 nm)〕和類(lèi)色氨酸熒光組分〔組分2(220 nm350 nm、280 nm350 nm)〕。組分1的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間先升高后降低，直至熒光峰消失；組分2熒光強(qiáng)度逐漸升高，推測(cè)組分2為微生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物；總熒光強(qiáng)度隨時(shí)間呈先升高后逐漸降低的趨勢(shì)。

(3)經(jīng)初沉池出水馴化后，污泥中的β-變形菌綱豐度明顯增加。目水平下三大優(yōu)勢(shì)菌群(相對(duì)豐度在10%以上)為未經(jīng)培養(yǎng)菌種(uncultured bacterium)、伯克氏菌目(Burkholderiales)和紅環(huán)菌目(Rhodocyclales)，相對(duì)豐度分別為18.54%、14.65%和14.13%。

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Pollutants Degradation Characteristics and Microbial Community Structure Using Cornstarch Wastewater as Denitrification Carbon Source

GUO Xiaoya1, NIAN Yuegang1, YAN Haihong1,2, YIN Qin1,2, GAO Peng3, CHEN Guangwei4

1.Research Center of Water Pollution Control Technology, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China 2.College of Water Science, Beijing Normal University, Beijing 100875，China 3.China Bluestar Lehigh Engineering Corporation, Shanghai 201204, China 4.COFCO Bio-chemical Energy(Gongzhuling) Company Limited, Siping 136100, China

denitrification; carbon source; cornstarch wastewater; excitation-emission matrix spectroscopy; parallel factor analysis; community structure

2016-03-07

國(guó)家水體污染控制與治理科技重大專(zhuān)項(xiàng)(2012ZX07202-009-01)

郭曉婭(1990—)，女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)樗廴究刂婆c資源化，xiaoyaguo1990@163.com

*責(zé)任作者：年躍剛(1963—)，男，研究員，博士，主要從事生態(tài)修復(fù)、中水回用研究，nianyg@craes.org.cn

X703

1674-991X(2016)05-0427-07

10.3969j.issn.1674-991X.2016.05.063