王慶芬， 黃麗英， 林曦瑾， 朱璐璐， 許小琦， 阮舒健

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刺參多糖超聲-微波協(xié)同提取工藝優(yōu)選

王慶芬1,2， 黃麗英1， 林曦瑾3， 朱璐璐3， 許小琦3， 阮舒健3

目的以刺參多糖(SCPS)的提取率和純度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選SCPS的提取工藝。方法以苯酚-硫酸法測(cè)定SCPS的純度，并以提取率和純度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法對(duì)SCPS的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。結(jié)果以D-葡萄糖醛酸為對(duì)照品并確定SCPS超聲-微波協(xié)同提取的最佳提取工藝為取刺參粉末加入15倍量蒸餾水，微波功率80 W，提取4次，每次30 min。結(jié)論利用超聲微波協(xié)同提取SCPS工藝科學(xué)合理、穩(wěn)定可行，提取率較高。

多糖類； 微波； 提取法； 工藝學(xué)； 酚類； 硫酸類； 正交試驗(yàn)

刺參(Stichopus japonicus)是我國(guó)20多種食用海參中品質(zhì)最好的一種，屬于棘皮動(dòng)物門(mén)刺參綱刺參科[1]，是一種海洋動(dòng)物性藥材，具有抗腫瘤、抗凝血、抗血栓、降血脂、降低血黏度、免疫調(diào)節(jié)、抗菌等作用，同時(shí)在輔助治療慢性乙型肝炎及高血壓病等常見(jiàn)疾病上得到中醫(yī)廣泛的認(rèn)同和應(yīng)用[2-3]。刺參的主要活性成分有刺參多糖、刺參皂苷、多肽、刺參神經(jīng)節(jié)苷酯等，其中刺參多糖具有抗腫瘤、抗凝血和提高免疫力等作用，在醫(yī)藥方面的應(yīng)用越來(lái)越受到人們的關(guān)注，逐步成為海洋生物活性物質(zhì)綜合利用的研究熱點(diǎn)。

多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類多樣，分子量和極性大，且常與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等結(jié)合成多糖復(fù)合物，這給多糖的提取帶來(lái)了困難。傳統(tǒng)的多糖提取方法均存在提取時(shí)間長(zhǎng)、多糖提取率不高等不足[4]。超聲-微波協(xié)同萃取技術(shù)是一種新型的提取技術(shù)，直接將超聲振動(dòng)與開(kāi)放式微波兩種作用方式相結(jié)合，利用超聲波振動(dòng)的空化作用以及微波的高能作用，實(shí)現(xiàn)了低溫常壓條件環(huán)境下，對(duì)樣品進(jìn)行快速和高效的提取。超聲-微波協(xié)同法用于中草藥有效成分提取已得到較廣泛的應(yīng)用。本文采用苯酚-硫酸法并以D-葡萄糖醛酸為對(duì)照品，測(cè)定刺參多糖的含量[5]，以刺參多糖提取率和純度作為指標(biāo)[6-7]，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選刺參多糖的超聲-微波協(xié)同提取工藝。

1　材料與方法

1.1材料干燥刺參(市售，產(chǎn)地福建霞浦)；D-葡萄糖醛酸(純度98%，批號(hào)：1216012)、葡萄糖(純度99.9%，批號(hào)：1403066)、L-巖藻糖(純度99%，批號(hào)：1102021)、D-半乳糖(純度97%，批號(hào)：1224032)、甘露糖(純度99%，批號(hào)：133708),均為阿拉丁試劑有限公司生產(chǎn)；三氯甲烷、正丁醇、苯酚、濃硫酸均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2儀器超聲-微波協(xié)同萃取儀(CW-2000，新拓微波溶樣測(cè)試技術(shù)有限公司)；低速大容量多管離心機(jī)(LXT-IIB ，上海安亭科學(xué)儀器廠)：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-2000，上海亞榮生化儀器廠)；冷凍干燥機(jī)(FD-1，北京博醫(yī)康技術(shù)公司)；紫外分光光度計(jì)(UV-2450，日本島津有限公司)；自動(dòng)三重純水蒸餾器(SZ-97，上海亞榮生儀器廠)；傾倒式粉碎機(jī)(DJ-10A，上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司)。

1.3方法

1.3.1各單糖對(duì)照品溶液的制備精密稱取D-葡萄糖醛酸、葡萄糖、L-巖藻糖、D-半乳糖、甘露糖對(duì)照品各10.0 mg于10 mL量瓶中，加蒸餾水混勻并稀釋至刻度，即得1.0 mg/mL的單糖對(duì)照液，冷藏備用。臨用前取各單糖對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 mL于10 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，得0.1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.3.2SCPS供試品溶液的制備精密稱取刺參粗多糖干浸膏20.0 mg于10 mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，即得2.0 mg/mL的樣品，冷藏備用。臨用前，取樣品儲(chǔ)備液1.0 mL于10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，即得0.2 mg/mL的供試品溶液。

1.3.3SCPS對(duì)照品的篩選精密量取蒸餾水1.0 mL，加入5%苯酚溶液0.6 mL，立即加入硫酸6. 0 mL，迅速搖勻，100 ℃水浴中加熱15 min，取出后立即放入冰浴下放置15 min，取出，冷卻，作為空白對(duì)照置于300～800 nm內(nèi)調(diào)零。精密吸取單糖對(duì)照品溶液和SCPS供試品溶液各2.0mL，同上操作，在300～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，得各溶液的吸收曲線。

1.3.4D-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與線性關(guān)系的考察精密量取0.1 mg/mL D-葡萄糖醛酸對(duì)照品溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL于25 mL具塞試管中，加蒸餾水補(bǔ)足至1.0 mL。分別加入5%苯酚溶液0.6 mL，再加入硫酸6.0 mL，迅速搖勻，100 ℃水浴中加熱15 min，取出后立即放入冰浴中15 min，取出，冷卻，在478 nm 測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定3次。以D-葡萄糖醛酸的濃度c(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制D-葡萄糖醛酸濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程:

A=4.719 8c-2.6×10-3，r=0.999 5

1.3.5SCPS提取方法的考察取刺參粉末約3.0 g，精密稱定，按照料液比1∶15加入蒸餾水，混合搖勻，分別采用超聲微波協(xié)同提取、超聲提取和加熱水煮法提取30 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液，濾渣加45 mL蒸餾水，重復(fù)提取3次，合并上清液，減壓濃縮至20 mL左右。往濃縮液中加入三氯甲烷20 mL和正丁醇5 mL，劇烈振搖10 min，5 000 r/min離心10 min，取出蛋白質(zhì)層，重復(fù)3次，取上層液，加入3倍量無(wú)水乙醇靜置過(guò)夜，5 000 r/min離心30 min，棄去上清液，所得沉淀即為含雜質(zhì)的粗多糖[8]，粗多糖經(jīng)冷凍干燥48 h后得干浸膏。

1.3.6正交試驗(yàn)優(yōu)選SCPS超聲-微波提取工藝以提取的料液比、微波功率、提取時(shí)間、提取次數(shù)為影響因素，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以刺參多糖提取率和純度為考察指標(biāo)，對(duì)刺參多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，因素及水平見(jiàn)表1。計(jì)算公式如下：

刺參粗多糖提取率=m干浸膏/m藥材×100%

刺參粗多糖純度=ρ測(cè)得的多糖/ρ粗多糖×100%

表1　正交試驗(yàn)因素水平表

A:料液比; B:微波功率; C:提取時(shí)間; D:提取次數(shù).

2　結(jié)　果

2.1對(duì)照品的選擇D-半乳糖、甘露糖、葡萄糖、L-巖藻糖、D-葡萄糖醛酸和海參多糖經(jīng)苯酚-硫酸法顯色后的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖見(jiàn)圖1。其中，D-葡萄糖醛酸和海參多糖經(jīng)苯酚-硫酸法后的紫外-可見(jiàn)吸收譜圖形狀最為相似，二者均在313 nm和478 nm處有2個(gè)吸收峰；其他單糖與苯酚-硫酸顯色后其紫外-可見(jiàn)吸收譜圖與海參多糖的吸收譜圖有4個(gè)吸收峰，除320 nm和480 nm處的吸收峰有吸收外，還有2個(gè)肩峰，分別位于405 nm及528 nm處，差別大，不適合作為測(cè)定海參多糖的標(biāo)準(zhǔn)品。故本實(shí)驗(yàn)選用D-葡萄糖醛酸作為對(duì)照品，在478 nm處測(cè)定刺參多糖含量。

2.2精密度試驗(yàn)分別精密吸取0.1 mg/mL D-葡萄糖醛酸溶液0.6 mL 于6支25 mL 具塞試管中，加水補(bǔ)足至1.0 mL。按照“1.3.4”方法測(cè)定浸膏中刺參多糖的含量，重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果表明，6份樣品的平均吸光度為0.371，RSD為0.60%。

2.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取0.2 mg/mL的樣品溶液1 mL于25 mL試管中，按照“1.3.4”方法測(cè)定浸膏中刺參多糖的含量，重復(fù)測(cè)定6次。在2 h內(nèi)每隔15 min在478 nm處測(cè)定吸光度。結(jié)果表明，樣品的平均吸光度為0.367，RSD為0.92%，表明此方法在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4日間穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取0.2 mg/mL的樣品溶液1 mL于25 mL 具塞試管中，按照“1.3.4”方法測(cè)定浸膏中刺參多糖的含量，重復(fù)測(cè)定6次，重復(fù)6 d測(cè)定結(jié)果。結(jié)果表明，樣品的平均吸光度為0.369，RSD為0.89%。

2.5加樣回收率試驗(yàn)精密吸取0.2 mg/mL的樣品溶液0.5 mL，精密量取0.1 mg/mL D-葡萄糖醛酸溶液0.20，0.35，0.50 mL于25 mL 具塞試管中，加水補(bǔ)足至1.0 mL。按照“1.3.4”方法測(cè)定浸膏中刺參多糖的含量，重復(fù)測(cè)定3次。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

n=3.

2.6SCPS提取方法的考察結(jié)果不同提取方法刺參多糖提取率結(jié)果見(jiàn)表3。采用超聲-微波協(xié)同提取得到的粗多糖干浸膏提取率最高。

表3不同提取方法刺參多糖提取率

Tab 3Extraction rate of polysaccharide of different experimental methods

2.7超聲-微波協(xié)同強(qiáng)化提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果分析正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析結(jié)果見(jiàn)表5，6。由表5可以看出，以多糖提取率各因素作用主次為B>C>A>D；以純度為考察指標(biāo)，無(wú)顯著性差異。表5結(jié)果表明微波功率對(duì)刺參多糖的提取率有極顯著的影響，提取時(shí)間對(duì)提取率有影響。故依據(jù)直觀分析結(jié)果，選擇刺參多糖的最佳提取工藝為A1B3C3D3。

表4　L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.8最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)依照正交試驗(yàn)所優(yōu)選的最佳工藝條件，采用超聲-微波協(xié)同提取法提取3批SCPS的平均提取率分別為12.387%，12.379%和12.127%；RSD為1.7%，2.5%和2.7%。該提取工藝與正交試驗(yàn)結(jié)果基本一致，表明該工藝合理可行，穩(wěn)定性較好。

3　討　論

多糖常見(jiàn)的提取方法有強(qiáng)堿提法和酶解法。傳統(tǒng)提取方法存在提取周期長(zhǎng)、多糖提取率不高等不足。超聲-微波協(xié)同提取法將微波和超聲兩種手段有機(jī)結(jié)合起來(lái)，大大提高了提取效率，還可避免了高溫對(duì)提取成分的影響，具有省時(shí)、節(jié)能、提出率高等優(yōu)點(diǎn)[9-10]，在中草藥化學(xué)成分提取中的應(yīng)用已經(jīng)顯示出明顯的優(yōu)勢(shì)。目前已有研究報(bào)道用于黃芪多糖和靈芝多糖等的提取[9，11]，但未見(jiàn)用于刺參多糖的提取報(bào)道。

A:料液比; B:微波功率; C:提取時(shí)間; D:提取次數(shù).△：P<0.05為顯著性.

表6　刺參多糖純度方差分析表

A:料液比; B:微波功率; C:提取時(shí)間; D:提取次數(shù).

多糖是海參體壁的重要成分，刺參多糖由葡萄糖醛酸、乙酰氨基半乳糖、巖藻糖及硫酸基組成的雜多糖[12],成分較為復(fù)雜。本研究對(duì)海參多糖含量測(cè)定中的單糖對(duì)照品經(jīng)過(guò)苯酚-硫酸法進(jìn)行篩選，結(jié)果表明D-葡萄糖醛酸對(duì)照品和樣品溶液的吸收曲線最為相似，所以選用D-葡萄糖醛酸為單糖對(duì)照品。

[1]張?jiān)陆?盧明鋒,吉愛(ài)國(guó). 刺參多糖藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)生化藥物雜志,2012,33(1)：74-77.

[2]Ye L B,Xu L,Li J R. Preparation and anticoagulant activity of a fucosylated polysaccharide sulfatefrom a sea cucumber Acaudina molpadioidea[J].CarbohydPolym,2012,87(3):2052-2057.

[3]Wijesinqhe W A,Jeon Y J,Ranasamy P,etal. Anticancer activity and mediation of apoptosis in human HL-60 leukaemia cells by edible sea cucumber (Holothuria edulis) extract[J].FoodChem,2013,139(s1-4):326-331.

[4]薛丹,黃豆豆,黃光輝,等. 植物多糖提取分離純化的研究進(jìn)展[J]. 中藥材,2014,37(1):157-161.

[5]張錦雀,黃麗英,吳曉珊. 金線蓮多糖苯酚-硫酸法測(cè)定條件的優(yōu)化[J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2010,30(2)：113-115.

[6]彭凱麗,李新,李元林,等. 正交試驗(yàn)優(yōu)選復(fù)方桑菊口服液中藥材的提取工藝[J].中國(guó)藥房,2014,25(3):243-245.

[7]李躍輝,凌艷君,朱沛,等.正交試驗(yàn)優(yōu)選鼻敏寧顆粒提取工藝[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2014,11(2):114-116.

[8]韓秋菊,馬宏飛. 海參多糖的提取與純化研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012，40(14):8071-8074.

[9]張玉朝,李小艷,宋強(qiáng),等. 超聲-微波協(xié)同萃取靈芝多糖最佳工藝研究[J]. 福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2011,21(2):36-38.

[10]楊勝丹,付大友. 超聲波、微波萃取及其聯(lián)用技術(shù)在中藥有效成分提取中的應(yīng)用[J]. 廣東化工,2010,37(2):120-122.

[11]杜廣芬,蔡志華,王剛,等. 黃芪多糖超聲-微波協(xié)同提取研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2012,24(1):114-117.

[12]張?jiān)陆?盧明鋒,吉愛(ài)國(guó). 刺參多糖藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)生化藥物雜志,2012,33(1):74-77.

(編輯:張慧茹)

Optimization on Ultrasound-microwave Assisted Extraction Process of Stichopus Japonicus Polysaccharide

WANG Qingfen1,2， HUANG Liying1， LIN Xijin3， ZHU Lulu3， XU Xiaoqi3， RUAN Shujian3

1.College of Pharmacy, Fujian Medical University, Fuzhou 350004，China;2.Department of Pharmacy, 175 Hospital of PLA,The Affiliated Southeast Hospital of Xiamen University, Zhangzhou 363000,China;3.College of Preclinical Medicine, Fujian Medical University, Fuzhou 350004,China

ObjectiveChoose extraction rate and the content determination of Stichopus Japonicus polysaccharide(SCPS) as evaluation indicator, then optimize the best extraction.MethodThe content of SCPS was detected by phenol-sulfuric acid method to choose the suitable standard monosaccharide and orthogonal test was applied to study the SCPS extracted factors with its extraction rate and content as evaluation index.ResultD-glucuronic acid was chosen and the best ultrasound-microwave assisted extraction of SCPS was as follows: ratio of solid and liquid 1∶15, microwave power 80 W, extracting for four times, each time for 30 min.ConclusionThe optimal extraction conditions were rational and feasible, with less time and higher extraction rate.

polysaccharides； microwaves； extraction； technolog； phenols； sulfuric acids； orthogonal test

2015-09-13

國(guó)家海洋局海洋生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放研究基金(HY201404);國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研基金(wkj-FJ-33);國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201410392016)

1.福建醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，福州350004；

2.解放軍第一七五醫(yī)院,廈門(mén)大學(xué)附屬東南醫(yī)院 制劑科，漳州363000；

王慶芬(1982-)，女，福建醫(yī)科大學(xué)2014級(jí)碩士研究生

黃麗英.Email:fjmuhly88@sina.com

R282.74； R343.9； R454.1； R927.2； R977.7

A

1672-4194(2016)02-0078-04

3.福建醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,福州350004