張莉娟， 何彬彬， 黃月紅， 陳治新， 王小眾

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HB-EGF對HSC-T6細(xì)胞Ras/ERK通路的激活及對MMP-2、TIMP-1表達(dá)的影響

張莉娟， 何彬彬， 黃月紅， 陳治新， 王小眾

目的觀察肝素結(jié)合性表皮生長因子樣生長因子(HB-EGF)激活肝星狀細(xì)胞(HSC)過程中Ras/ERK信號通路的變化和對金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)及其抑制物的影響。方法傳代培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞，分空白對照組、HB-EGF處理組(20，40，80 ng/mL)，采用QRT-PCR法檢測MMP-2、金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)及表皮生長因子受體(EGFR)mRNA的表達(dá)，并確定HB-EGF刺激HSC-T6 Ras/ERK通路(ERK1、ERK2、P38MAPK)活化的最佳濃度及最佳時間，檢測該通路活化情況。結(jié)果QRT-PCR檢測提示,MMP-2的表達(dá)隨HB-EGF干預(yù)時間的延長增加，TIMP-1的表達(dá)隨干預(yù)時間的延長遞減；40 ng/mL HB-EGF培養(yǎng)HSC-T6 48 h后，EGFR mRNA的表達(dá)較空白對照組明顯上調(diào)(P<0.05)；選擇40 ng/mL HB-EGF培養(yǎng)48 h為最佳刺激時間與濃度，該處理組ERK1 mRNA的表達(dá)較空白對照組明顯上調(diào)(P<0.05)，但ERK2、P38MAPK的變化無統(tǒng)計學(xué)意義；Western-blot檢測提示該處理組ERK1蛋白的表達(dá)較空白對照組上調(diào)(P<0.05)。結(jié)論HB-EGF可影響HSC-T6的MMP-2、TIMP-1的表達(dá)；HB-EGF通過促進(jìn)HSC-T6表達(dá)EGFR、ERK1，有效激活細(xì)胞內(nèi)Ras/ERK信號通路。

表皮生長因子； 肝素； 肝細(xì)胞； 星形細(xì)胞； 大鼠； 細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)MAP激酶類； RAS蛋白質(zhì)類； 胞間信號肽類和蛋白質(zhì)類； 基質(zhì)金屬蛋白酶類； 金屬蛋白酶1組織抑制劑

肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)為間質(zhì)來源的一種肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，它的活化與增殖是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，是分泌金屬蛋白酶及其抑制物的主要細(xì)胞，參與調(diào)節(jié)肝臟的膠原代謝[1]。HSC活化后，多種細(xì)胞因子分別結(jié)合HSC上的特異性受體，激活胞內(nèi)PI3-Akt、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[2]。已有研究發(fā)現(xiàn)，HSC內(nèi)活化的ERK信號通路參與調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的合成及降解過程，包括促進(jìn)Ⅰ、Ⅲ膠原合成，抑制金屬基質(zhì)蛋白酶-1(matrix metalloproteinase, MMP-1)、促進(jìn)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase-1、2，TIMP-1、TIMP-2)的表達(dá)[3-4]。但HSC活化后，ERK通路調(diào)控MMP及其抑制物的具體機(jī)制還未完全闡明。

肝素結(jié)合性表皮生長因子樣生長因子(heparin-binding EGF-like growth factor, HB-EGF)為表皮生長因子家族中的一員，具有高度肝素親和力。細(xì)胞內(nèi)HB-EGF可受到腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(inter leukin,IL-1β)、血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor subunit β,PDGFβ)等多種細(xì)胞因子的誘導(dǎo)表達(dá)[5]，并通過結(jié)合表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)和ErbB4，激活胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等的分裂增殖[6]。筆者以不同濃度的HB-EGF刺激HSC-T6細(xì)胞系，觀察HB-EGF對HSC的ERK通路活化情況，同時檢測MMP-2、TIMP-1蛋白的表達(dá)，探討HB-EGF及ERK通路的激活對HSC膠原代謝的影響。

1　材料與方法

1.1材料HSC-T6(湘雅細(xì)胞庫)；DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(美國Invitrogen公司)；HB-EGF試劑(美國Peprotech公司)；Trizol試劑(深圳生物晶美公司)；MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司)；RNase Inhibitor、SYBR?Premix Ex Taq(日本Takara公司)；預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(HOU-BIO科技有限公司)；兔抗ERK1/2單克隆抗體(美國CST公司)；兔抗MMP-2多克隆抗體(美國Abcam公司)；兔抗TIMP-1多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；小鼠抗GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；定量PCR儀(德國Eppendorf公司)；快速蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)PIERCEG2(美國Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞傳代培養(yǎng)用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HSC-T6，平均每3天消化傳代1次，1∶3傳代，取第3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞接種與分組以2×105mL-1的密度接種于6孔板，24 h后換含2%FBS的高糖DMEM同步化24 h后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)：空白對照組(3 mL含2%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基)、處理組 Ⅰ(HB-EGF 20 ng/mL)、處理組Ⅱ(HB-EGF 40 ng/mL)、處理組Ⅲ(HB-EGF 80 ng/mL)，分別培養(yǎng)24，48 h。

1.2.3檢測HSC-T6的TIMP-1、MMP-2的表達(dá)

1.2.3.1QRT-PCR法按試劑盒說明操作，抽提各孔HSC-T6的總RNA，用紫外分光光度法測定RNA含量及純度，A260/A280為1.8～2.1，用無核酶水調(diào)整RNA濃度為400～1 000 ng/mL；cDNA的合成采用25 mL體系，每一體系含1.5 μg樣品RNA，0.5 μg random primer(N9)，終濃度0.4 mmol dNTP，70 ℃變性5 min；每一擴(kuò)增管中再依次加入5×MMLV Buffer 5 μL，dNTP Mixture 5 μL，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，RNase A inhibitor 0.5 μL，37 ℃，60 min→70 ℃變性5 min，使MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶失活；加入1 μL RNase H，37 ℃反應(yīng)30 min→70 ℃變性5 min；加入174 μL TE(pH 8.0)，混勻后于-80 ℃保存；熒光實(shí)時定量PCR：采用Takara公司的SYBR?Premix Ex Taq試劑，配置20 μL反應(yīng)體系，含2X SYBR Green master mix 10 μL，Primer mix 0.2 mL，Sterile water 4.8 μL，cDNA 模板5 μL→95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s→63 ℃退火15 s→72 ℃延伸20 s，45個循環(huán)后進(jìn)行融解曲線程序。以管家基因GAPDH作為內(nèi)參，QRT-PCR結(jié)果通過2-△△Ct法計算不同處理組目的基因的mRNA相對表達(dá)水平。

1.2.3.2Western-blot法HB-EGF培養(yǎng)HSC-T6 24及48 h后，按1×106μL-1細(xì)胞加入100 μL細(xì)胞裂解液于6孔板，收集細(xì)胞及裂解液至EP管，冰上裂解30 min；4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液至另一EP管中，按照BCA蛋白定量法測定樣品蛋白濃度；以5×上樣緩沖液、RIPA配置40 μg蛋白上樣量于PCR管中，混勻后沸水中變性5 min；配制10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，上樣、電泳，轉(zhuǎn)膜；將硝酸纖維素(nitrocellulosefilter membrane, NC)膜置于含5%脫脂奶粉的TBST中，室溫封閉2 h；兔抗MMP-2多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗TIMP-1多克隆抗體(1∶300)、小鼠抗GAPDH單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃搖床過夜；用TBST洗膜3次(各10 min)，與相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)孵育2 h后，TBST洗膜3次(各10 min)；滴加ECL熒光液于NC膜上，暗室顯影、掃描，Gel Doc 100凝膠圖像分析儀分析，蛋白表達(dá)水平以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH吸光度值比值表示。

1.2.4QRT-PCR法檢測HSC-T6 EGFR的表達(dá)步驟及反應(yīng)條件參照1.2.3.1。

1.2.5QRT-PCR法、Western-blot法檢測HSC-T6 ERK1、ERK2的表達(dá)步驟及反應(yīng)條件參照1.2.3.1及1.2.3.2；兔抗Erk1/2單克隆抗體(1∶1 000)，小鼠抗GAPDH單克隆抗體(1∶1 000)，羊抗兔或羊抗小鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件分析。2組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P<0.05為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1 HB-EGF對HSC-T6細(xì)胞中MMP-2、TIMP-1表達(dá)的影響QRT-PCR和Western-blot法分別檢測各濃度HB-EGF(20,40,80 ng/mL)對HSC-T6細(xì)胞中MMP-2、TIMP-1的mRNA和蛋白表達(dá)。HB-EGF作用48 h后，各組MMP-2的表達(dá)隨培養(yǎng)時間延長而增加，而TIMP-1的表達(dá)則隨時間延長而逐漸下降(P<0.05)。但HB-EGF的不同作用濃度之間MMP-2的表達(dá)差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。48 h后，處理組Ⅰ、 Ⅲ的TIMP-1表達(dá)較處理組Ⅱ明顯下調(diào)(P<0.05)，MMP-2、TIMP-1蛋白的表達(dá)與mRNA的表達(dá)情況基本一致(表1，2及圖1，2)。

2.2HB-EGF對HSC-T6細(xì)胞中EGFR表達(dá)、Ras/ERK信號通路的影響QRT-PCR法檢測HB-EGF對HSC-T6細(xì)胞中EGFR表達(dá)的影響， 處理組Ⅱ中的HSC-T6細(xì)胞EGFR mRNA的表達(dá)較空白對照組明顯上調(diào)(表3，圖3)。

2.3HB-EGF對HSC-T6細(xì)胞中Ras/ERK信號通路的影響QRT-PCR法和Western-blot法檢測HSC-T6細(xì)胞中Ras/ERK信號通路中ERK1、ERK2基因的mRNA及蛋白的表達(dá)水平。HB-EGF 40 ng/mL處理48 h后，ERK1的mRNA表達(dá)較空白對照組明顯上調(diào)，ERK2無明顯變化(P<0.05，表4,圖4)；Western-blot檢測可見ERK1蛋白的表達(dá)較空白對照組明顯上調(diào)(表5,圖5)。

Tab 1The expression of MMP-2，TIMP-1 mRNA in all groups

HB-EGF：肝素結(jié)合性表皮生長因子樣生長因子； MMP-2：金屬基質(zhì)蛋白酶-2； TIMP-1：金屬蛋白酶組織抑制劑-1.Ⅰ組：HB-EGF 20 ng/mL組； Ⅱ組：HB-EGF 40 ng/mL組； Ⅲ組：HB-EGF 80 ng/mL組.與同組24 h比較，△:P<0.05.

表2各組MMP-2、TIMP-1基因蛋白的相對表達(dá)

Tab 2The expression of MMP-2,TIMP-1 protein in all groups

HB-EGF：肝素結(jié)合性表皮生長因子樣生長因子； MMP-2：金屬基質(zhì)蛋白酶-2； TIMP-1：金屬蛋白酶組織抑制劑-1.Ⅰ組：HB-EGF 20 ng/mL組； Ⅱ組：HB-EGF 40 ng/mL組； Ⅲ組：HB-EGF 80 ng/mL組.與同組24 h比較，△：P<0.05.

Ⅰ組：HB-EGF 20 ng/mL組； Ⅱ組：HB-EGF 40 ng/mL組； Ⅲ組：HB-EGF 80 ng/mL組.EGFR：表皮生長因子受體； HB-EGF：肝素結(jié)合性表皮生長因子樣生長因子； HSC-T6:肝星狀細(xì)胞.與空白對照組比較，△：P<0.05.

表448 h ERK1、ERK2基因mRNA的相對表達(dá)

Tab 4The expression of ERK1 and ERK2 mRNA in 48 h group

ERK：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶； HB-EGF：肝素結(jié)合性表皮生長因子樣生長因子.與空白對照組比較，△：P<0.05.

Tab 5The expression of ERK1 and ERK2 protein in all group

ERK：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶； HB-EGF:肝素結(jié)合性表皮生長因子樣生長因子.與空白對照組比較，△：P<0.05.

3　討　論

肝纖維化的主要病理基礎(chǔ)是ECM的合成與沉積，而調(diào)控ECM合成與降解平衡的關(guān)鍵分子是HSC分泌的MMPs及其TIMPs，二者的動態(tài)平衡與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ERK/MAPK信號通路由MAPKKK、MAPKK、MAPK順序活化的級聯(lián)反應(yīng)，主要通過Ras-Raf-MEK-ERK激活，是多種細(xì)胞因子向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號的重要通路之一，參與了急性肝損傷、肝纖維化、肝臟腫瘤等多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展。

本研究證實(shí)，HB-EGF(40 ng/mL)能夠促進(jìn)HSC-T6細(xì)胞表達(dá)EGFR、ERK1，刺激Ras/ERK信號通路的活化。同時本研究還檢測不同濃度HB-EGF對HSC-T6細(xì)胞MMP-2、TIMP-1表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)HSC-T6細(xì)胞MMP-2的表達(dá)隨培養(yǎng)時間的延長而表達(dá)增加，TIMP-1隨培養(yǎng)時間的延長而表達(dá)下降，HB-EGF 20,80 ng/mL組較40 ng/mL處理組數(shù)值明顯下調(diào)，但是各濃度HB-EGF處理組與空白對照組比較均無統(tǒng)計學(xué)意義。丁倩等的研究結(jié)果顯示，HB-EGF能夠促進(jìn)HSC(LX-2細(xì)胞株)表達(dá)TIMP-1[7]。本結(jié)果提示，HB-EGF誘導(dǎo)的Ras/ERK通路的活化對HSC-T6的MMP-2、TIMP-1表達(dá)有影響，與其不一致，考慮可能是實(shí)驗(yàn)條件、細(xì)胞株的選擇的不同等原因引起的差異。

目前認(rèn)為HSC胞內(nèi)ERK信號通路激活后，活化的ERK轉(zhuǎn)入胞核，與核轉(zhuǎn)錄因子c-fos、c-jun、stat、核因子IL-6結(jié)合并使其磷酸化，同時介導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白D、E的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖[8-9]，并調(diào)控其表型發(fā)生轉(zhuǎn)變，抑制HSC凋亡[9-10]。ERK是MAPK家族中的絲氨酸/蘇氨酸激酶，分子量約42～44 kD，包括ERK1、ERK2 2種亞型，二者互為同工異構(gòu)體[11]。肝纖維化組織中肝細(xì)胞、肝竇血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮及HSC均可表達(dá)ERK1，以HSC表達(dá)最多，而且隨肝纖維化進(jìn)展而表達(dá)增高[11]。已有少量研究認(rèn)為，ERK1、ERK2在細(xì)胞的增殖過程中具有不同的作用[12]，在神經(jīng)元的氧化應(yīng)激過程中，ERK1與ERK2可能具有互為拮抗的作用[13]。也有多項研究證實(shí)，ERK通路對細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解具有調(diào)控作用，可能促進(jìn)MMP的轉(zhuǎn)錄表達(dá)及活化[3-4，14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，HB-EGF(40 ng/mL)處理HSC-T6 48 h，能夠有效刺激HSC-T6表達(dá)EGFR、ERK1，活化胞內(nèi)Ras/ERK信號通路，同時也使MMP-2、TIMP-1的表達(dá)發(fā)生不同程度的改變。因此，筆者推測HB-EGF可能通過ERK信號通路進(jìn)一步對MMP-2、TIMP-1表達(dá)產(chǎn)生影響，從而調(diào)控HSC對膠原的合成與降解。

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(編輯:張慧茹)

Effect of HB-EGF on the Activation of Ras/ERK Signal Pathway and the Expression of MMP-2, TIMP-1 in HSC-T6 cells

ZHANG Lijuan, HE Binbin, HUANG Yuehong, CHEN Zhixin, WANG Xiaozhong

Department of Gastroenterology, Fujian Medical University Union Hospital, Fuzhou 350001, China

ObjectiveTo investigate the effect of HB-EGF on Ras/ERK signaling transduction pathway and MMPs, TIMPs of HSC.MethodsThe rat hepatic stellate cells T6(HSC-T6) were treated with DMEM supplemented with 2%FBS, HB-EGF(20,40,80 ng/mL) for 24 or 48 h.We used QRT-PCR to detect the expression of MMP-2 and TIMP-1’s mRNA in cells stimulated by HB-EGF at different concentrations and times.We analyzed EGFR gene at the level of transcription by QRT-PCR, and determined a best concentration and time of HB-EGF (40 ng/mL, 48 h) to stimulate the Ras/ERK signaling transduction pathway (ERK1, ERK2, P38MAPK) in HSC-T6 cells before detecting the activation of Ras/ERK pathway.ResultsMMP-2 mRNA and protein were increased in time-dependent pattern, while TIMP-1 was decreased; EGFR mRNA was increased when cells cultured with HB-EGF 48 h at concentration of 40 ng/mL, compared to the control group (P<0.05).Compared with control group, the expression of ERK1’s mRNA and protein were much higher after the treatment with 40 ng/mL HB-EGF 48 h; but no significant differences were found in the ERK2 and P38MAPK mRNA and protein.ConclusionHB-EGF has no appreciable effect on MMP-2 and TIMP-1 in HSC-T6; HB-EGF can promote EGFR and ERK1’s expression to activate the Ras/ERK signal transduction pathway in HSC-T6 cells.

epidermal growth factor； heparin； hepatocytes； astrocytes； rats； extracellular signal-regulated map kinases； ras proteins； intercellular signaling peptides and proteins； matrix metalloproteinases； tissue inhibitor of metalloproteinase-1

2015-10-12

福建省臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)?？瀑Y助項目(閩衛(wèi)科教[2012]149號)

福建醫(yī)科大學(xué) 附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科，福州350001

張莉娟(1973-)，女，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士. Email:zhanglijuan8482@sina.com

R332； R341； R329.24； R345.9； R575； R977.3； R977.6

A

1672-4194(2016)02-0069-05