安硯波　王　浩（1山東醫(yī)藥技師學(xué)院，泰安271016；2泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，泰安271016）

響應(yīng)面法優(yōu)化蜂膠總黃酮的提取工藝

安硯波王浩
（1山東醫(yī)藥技師學(xué)院，泰安271016；2泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，泰安271016）

優(yōu)化蜂膠總黃酮的提取工藝。方法：以蜂膠總黃酮提取得率為指標(biāo)，通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化蜂膠黃酮的提取工藝，并對最佳提取工藝進(jìn)行驗證。結(jié)果：蜂膠總黃酮提取的最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度72.48%，超聲功率82.44%，超聲時間25.11min，總黃酮的得率達(dá)到13.07%。結(jié)論響應(yīng)面分析法可以很好地對蜂膠總黃酮提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，對實際生產(chǎn)具有理論指導(dǎo)意義。

蜂膠；黃酮；響應(yīng)面法

蜂膠（Propolis）是一種天然的活性物質(zhì)，是蜜蜂從植物芽孢或樹干采集的蜂蜜，混入蜜蜂上頜腺分泌物和蜂蠟后加工制成的芳香味的膠狀固體物質(zhì)［1］。蜂膠中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，如蕓香苷、槲皮素、高良姜素、楊梅素、松屬素、山奈酚、芹菜素等，約占總黃酮的20～30%［2］。蜂膠黃酮具有多種生物學(xué)活性，如抗炎、抗過敏、抗癌、抗病毒、抗增生、抗細(xì)胞分化、抗氧化清除氧自由基等，因此蜂膠成為一種具有很大開發(fā)潛力的天然中藥材和天然保健食品［3-5］。

響應(yīng)面法（Response Surface Method，RSM）是通過對響應(yīng)曲面及等高線的分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，采用多元二次回歸方程來擬合響應(yīng)值與因素之間函數(shù)關(guān)系的一種優(yōu)化統(tǒng)計方法［6-7］，其優(yōu)點是在試驗條件優(yōu)化過程中可以連續(xù)地對試驗因素的各個水平進(jìn)行分析，所以廣泛應(yīng)用于試驗設(shè)計與工藝優(yōu)化研究［8-10］。本實驗利用超聲法提取蜂膠黃酮，并利用響應(yīng)面法對其提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以確定其較優(yōu)的提取工藝條件。

1.材料

蜂膠原膠，由山東省實驗種蜂場提供；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，購自中國藥品生物制品檢定所；三氯化鋁；無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純；KQ-600DB型數(shù)控超聲波清洗器（可控溫），昆山市超聲儀器有限公司；UV-2550紫外分光光度計，島津制作所。

2.方法

2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

參照文獻(xiàn)［11-12］，準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0050g，用70%的乙醇溶液溶解并定容至25ml搖勻，取2.5ml該溶液用70%的乙醇定容至25ml，得質(zhì)量濃度為0.0200mg/ml的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml于10 ml容量瓶中，加入70%乙醇稀釋至5.0 ml。滴加10%AlCl3溶液0.1 ml，搖勻，用蒸餾水稀釋至刻度，顯色15 min，以空白試劑為參比液，于波長422 nm處測其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=29.7x-0.0044（R2=0.9992）。

2.2蜂膠總黃酮含量的測定

以蘆丁為參照測定蜂膠總黃酮含量。準(zhǔn)確稱取蜂膠總黃酮提取物0.5g于25ml容量瓶中，按一定的液固比（V/m）加入乙醇水溶液，超聲一定時間，離心。上清液用70%乙醇水溶液定容，搖勻，準(zhǔn)確吸取0.1ml置于試管中，在試管中加入0.1ml三氯化鋁搖勻，在紫外分光光度計中測得吸光度，帶入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計算可得蜂膠總黃酮的含量，即為得率。

3.結(jié)果和討論

3.1方法學(xué)考察

3.1.1重現(xiàn)性實驗 取2.2方法提取的樣品重復(fù)測定5次，求得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.02%。

3.1.2穩(wěn)定性試驗將2.2提取的樣品每隔5min測定一次吸光度，求得RSD=0.26%，

3.1.3回收率試驗精密稱取5份蜂膠，分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.05mg按3.2所述制得樣品液，測得加標(biāo)平均回收率為112.6%，RSD為1.06%。

3.2單因素試驗

3.2.1乙醇濃度對總黃酮得率的影響

圖1為液固比20∶1、超聲30min、功率70%、30℃的條件下，不同乙醇濃度對蜂膠總黃酮得率的影響。由圖1可知，隨著乙醇濃度的提高，蜂膠總黃酮得率呈上升趨勢，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%時總黃酮得率最大，之后隨著濃度的增加，得率反而降低。

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圖1　乙醇濃度對總黃酮得率的影響

3.2.2超聲時間對總黃酮得率的影響

圖2為乙醇濃度70%、液固比20：1、功率70%、30℃的條件下，不同超聲時間對總黃酮得率的影響。由圖2可知，超聲20～40min內(nèi)總黃酮得率呈上升趨勢，然后隨時間的延長有所下降。因此，本實驗選擇超聲時間為30min。

圖2　超聲時間對總黃酮得率的影響

3.2.3液固比對總黃酮得率的影響

圖3為乙醇濃度70%、超聲30min、功率70%、溫度30℃的條件下，不同液固比對總黃酮得率的影響。由圖3可知，蜂膠總黃酮得率隨著溶劑量的增加而增加，在液固比達(dá)到15∶1后，總黃酮得率有所降低，由此確定蜂膠黃酮提取的液固比以15：1為宜。

圖3　液固比對總黃酮得率的影響

3.2.4溫度對總黃酮得率的影響

圖4為乙醇濃度70%、超聲30min、功率70%、液固比15∶1的條件下，不同溫度對總黃酮得率的影響。由圖4可知，蜂膠總黃酮得率隨著溫度的增加而增加，在溫度達(dá)到60℃后，總黃酮得率有所降低，因此，本實驗選擇蜂膠黃酮提取溫度為60℃。

圖4　溫度對總黃酮得率的影響

圖5　功率對總黃酮得率的影響

3.2.5超生功率對總黃酮得率的影響

圖5為乙醇濃度70%、超聲30min、液固比15：1、溫度60℃的條件下，不同功率對總黃酮得率的影響。由圖5可知，蜂膠總黃酮得率隨著功率的增大而增加，在功率達(dá)到70%后，總黃酮得率反而降低，由此確定蜂膠黃酮提取的功率宜設(shè)為70%。

3.3關(guān)鍵影響因素確定

3.4響應(yīng)面法對蜂膠黃酮提取工藝優(yōu)化

表1　Box-Behnken試驗設(shè)計及相應(yīng)值

3.4.1Box-Behnken設(shè)計方案及結(jié)果

由Box-Behnken設(shè)計方案所得的試驗結(jié)果見表1。

經(jīng)回歸擬合后，得到以蜂膠總黃酮得率為響應(yīng)值的回歸方程為：Y=0.031+（8.750E-004）*X1+（6.250E-004）*X2+（-2.500E-004）*X3+（1.750E-003）*X1X2+（-5.000E-004）*X1X3+（-5.575E-003）*X12+（-1.075E-003）*X22+（1.175E-003）*X32

從表2的方差分析結(jié)果看，乙醇濃度的“Prob＞F”值大于0.05，表明其對總黃酮得率的影響不顯著，超聲功率的“Prob＞F”值大于0.05，表明其對總黃酮得率的影響不顯著，超聲時間的“Prob＞F”值大于0.05，表明其影響不顯著。整體模型的“Prob＞F”值小于0.01，表明該二次方程模型高度顯著；失擬項比F值為1.22，表明失擬項相對于絕對誤差是不顯著的，而不顯著的失擬項才可??；決定系數(shù)為0.9430，表明其應(yīng)變量與全體自變量之間的多元回歸關(guān)系顯著，即說明該回歸方程對試驗擬合情況較好，試驗誤差小，因此可用該回歸方程對不同提取條件下的蜂膠總黃酮得率進(jìn)行預(yù)測。

圖6　乙醇濃度和功率對總黃酮得率的影響

圖7　超聲時間和功率對總黃酮得率的影響

表2　回歸方程方差分析

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各因素（X1、X2、X3）所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從圖6、7上可形象的看出各因素交互作用對響應(yīng)值的影響。比較圖6、7可知，乙醇濃度對蜂膠總黃酮得率的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，乙醇濃度最佳值在72%左右；而超聲功率和超聲時間次之，表現(xiàn)為曲線較為平滑，其最佳響應(yīng)值分別在82%和25min左右。

3.4.2蜂膠總黃酮提取工藝條件的確定及驗證

通過回歸模型預(yù)測的蜂膠總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度72.48%，提取功率82.44%，超聲時間25.11min，在此條件下，蜂膠總黃酮得率理論上可達(dá)13.20%?？紤]到實際操作的可行性，將蜂膠總黃酮的提取條件在回歸方程得到的理論值基礎(chǔ)上修正為：乙醇濃度70%，液固比15∶1，超聲功率80%，超聲時間25min。以優(yōu)化條件進(jìn)行驗證，共進(jìn)行3次實驗，驗證實際平均值為13.07%，比優(yōu)化前的蜂膠總黃酮得率11.39%提高了9%。實驗驗證值與預(yù)測值較為接近，證明響應(yīng)面分析法得到蜂膠總黃酮提取條件真實可靠。

4.結(jié)論

將響應(yīng)面分析應(yīng)用于蜂膠總黃酮提取工藝的研究，采用合理的試驗設(shè)計對提取工藝進(jìn)行全面研究，依據(jù)回歸分析確定各工藝條件的影響因子，從而確定蜂膠總黃酮提取的最佳條件為乙醇濃度72%，液固比15∶1，超聲時間25min，超聲功率82%，比優(yōu)化前的蜂膠總黃酮得率提高了9%。利用此工藝既可縮短提取時間，又能節(jié)約成本，試驗結(jié)果科學(xué)、可靠，為充分開發(fā)和利用蜂膠資源提供了科學(xué)依據(jù)。

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安硯波（1981-），男，助理講師，研究方向：中藥藥理。

王浩（1977-），女，副教授，研究方向：藥理學(xué)。