袁　源，劉宏偉#，劉春華，王　哲，阮玉華，邢　輝

1)河南省疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病研究所 鄭州 450016　2)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心 北京 100050

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河南省商丘市艾滋病抗病毒治療病毒未抑制患者HIV-1耐藥毒株的變異*

袁源1)，劉宏偉1)#，劉春華1)，王哲1)，阮玉華2)，邢輝2)

1)河南省疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病研究所 鄭州 4500162)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心 北京 100050

人類(lèi)免疫缺陷病毒；耐藥；抗病毒治療；基因突變；河南省

目的：了解河南省商丘市艾滋病一線抗病毒治療病毒未抑制患者HIV-1耐藥毒株的變異。方法：采集河南省商丘市一線抗病毒治療大于6個(gè)月、病毒未抑制的艾滋病患者血樣231份，提取RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄及巢式PCR擴(kuò)增HIV-1 pol區(qū)基因，所得擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序后提交斯坦福大學(xué)HIV耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因型耐藥性分析。結(jié)果：在231份樣本中，229份擴(kuò)增并測(cè)序成功，共獲得229例患者蛋白酶區(qū)和逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的基因擴(kuò)增片段。針對(duì)非核苷類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTIs)、核苷類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTIs)和蛋白酶抑制劑(PIs)，分別有185例(80.79%)、150例(65.50%)和3例(1.31%)發(fā)生耐藥性突變，針對(duì)上述各抑制劑發(fā)生最多的耐藥性突變分別為K103N/S 45.42%(104/229)、M184I/V 43.67%(100/229)和M46I 0.87%(2/229)，其中與病毒載量5～ lg拷貝/mL相比，M184I/V耐藥性突變?cè)诨颊唧w內(nèi)病毒載量3～拷貝/mL時(shí)更易出現(xiàn)(OR=0.283，95%CI為0.136～0.592，P<0.001)，與治療時(shí)間6～個(gè)月相比，K103N/S耐藥性突變?cè)诨颊咧委煏r(shí)間48～個(gè)月時(shí)更易出現(xiàn)(OR=7.422，95%CI為1.637～33.651，P<0.001)，K65R突變位點(diǎn)在使用含D4T一線抗病毒治療方案患者中發(fā)生率較高(P=0.044)。結(jié)論：河南省商丘市抗病毒治療病毒未抑制人群中耐藥性突變位點(diǎn)多、類(lèi)型復(fù)雜，應(yīng)根據(jù)耐藥突變情況選用更適合的抗病毒起始治療方案，以減少耐藥毒株的產(chǎn)生。

高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART)方法可有效地抑制HIV感染者體內(nèi)病毒復(fù)制，明顯降低患者的病死率，延長(zhǎng)患者的生存期。但如果產(chǎn)生了耐藥，病毒復(fù)制不能有效地控制，就會(huì)導(dǎo)致臨床上抗病毒治療的失敗[1]。河南省是我國(guó)最早實(shí)施HAART的省份之一，初始抗病毒治療方案為2種核苷類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)+1種非核苷類(lèi)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NNRTI)的一線抗病毒治療方案。隨著抗病毒治療時(shí)間的持續(xù)，HIV-1耐藥毒株變異不可避免會(huì)發(fā)生。為了解河南省HIV-1耐藥毒株變異的情況，作者選取商丘市一線抗病毒治療病毒未抑制的患者進(jìn)行了HIV-1基因型耐藥性的檢測(cè)與研究，為指導(dǎo)后續(xù)二線抗病毒治療、制定有效抗病毒治療方案提供依據(jù)。

1　對(duì)象與方法

1.1對(duì)象河南省商丘市重點(diǎn)縣一線抗病毒治療大于6個(gè)月，病毒未抑制(病毒載量≥3 lg拷貝/mL)的艾滋病患者231例，年齡18～68(45.3±9.1)歲，男124例，女107例，接受治療時(shí)間8.3～73.3(53.6±14.1)個(gè)月，調(diào)查時(shí)病毒載量為3.31～6.55(4.45±0.75)lg拷貝/mL。采集患者的靜脈血，經(jīng)乙二胺四乙酸三鉀(EDTA-3K)抗凝后，于6 h內(nèi)經(jīng)3 000×g離心10 min分離血漿，分裝后凍存于-80 ℃用于基因型耐藥的檢測(cè)。

1.2病毒載量檢測(cè)使用Abbott m2000 RealTime HIV-1全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量病毒載量檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Abbott公司)檢測(cè)血漿HIV病毒載量，最小檢測(cè)值1.602 lg拷貝/mL。

1.3基因型耐藥性檢測(cè)

1.3.1巢式PCR擴(kuò)增采用RNA提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)，從待檢血漿中抽提病毒RNA。以提取的RNA為模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和巢式PCR擴(kuò)增。先用一步RT-PCR方法完成逆轉(zhuǎn)錄和第一輪PCR(TaKaRa One Step RNA PCR Kit試劑盒，大連寶生物公司)，再以第一輪PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪PCR[2]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 300 bp，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，切下目的片段，用QIAamp膠回收試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物用上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司ABI 377全自動(dòng)DNA測(cè)序儀雙脫氧終止法測(cè)序。

1.3.2序列拼接與分析用ContigExpress軟件將核苷酸序列拼接、校對(duì)后，得到包括蛋白酶區(qū)1～99氨基酸和逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)1～300氨基酸的pol基因區(qū)序列，提交美國(guó)斯坦福大學(xué)HIV耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)(http://hivdb.stanford.edu/pages/algs/sierra_sequence.html)進(jìn)行比對(duì),確定耐藥性突變位點(diǎn)和對(duì)各種抗病毒藥物的耐受程度。針對(duì)每種藥物給出評(píng)分，分為低度(15～分)、中度(30～分)和高度(60～分)，低度及以上耐藥即為基因型耐藥。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SAS 9.2進(jìn)行分析，對(duì)所得到的HIV-1耐藥基因突變頻率和位點(diǎn)與艾滋病患者的病毒載量、治療時(shí)間的關(guān)系進(jìn)行單因素logistic回歸分析，抗病毒治療方案與HIV-1耐藥突變發(fā)生的關(guān)系分析Fisher精確概率法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)果

2.1抗病毒治療病毒未抑制患者情況分析共收集抗病毒治療病毒未抑制HIV患者231例， 229例患者的樣本擴(kuò)增成功，獲得229例患者蛋白酶區(qū)和逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的基因擴(kuò)增片段。229例患者中53.71%(123/229)為男性，99.56%(228/229)為漢族，年齡18～68(45.3±9.3)歲，感染途徑主要以血液傳播為主，占92.58%(212/229)?；颊呓邮苤委煏r(shí)間為8.26～73.29(53.70±14.02)個(gè)月，調(diào)查時(shí)病毒載量為3.31～6.55(4.45±0.75)lg拷貝/mL。初始抗病毒治療方案全部為2種NRTI+1種NNRTI的一線抗病毒治療方案，其中71.62%(164/229)為齊多夫定(AZT)/司他夫定(D4T)+去羥肌苷(DDI)+奈韋拉平(NVP)/依非韋倫(EFV)，22.71%(52/229)為AZT/D4T+拉米夫定(3TC)+ NVP/EFV，5.67%(13/229)為其他抑制劑組成的抗病毒治療方案。

2.2HIV-1耐藥基因突變發(fā)生情況分析成功完成HIV-1耐藥基因檢測(cè)的229例患者中，有187例患者檢測(cè)出耐藥性突變位點(diǎn)，其中針對(duì)NNRTI發(fā)生耐藥性突變的有80.79%(185/229)，發(fā)生突變的位點(diǎn)有13個(gè)，主要的耐藥性突變?yōu)镵103N/S 45.42%(104/229)、Y181C 31.00%(71/229)、G190A/S 20.52%(47/229)；對(duì)NRTI發(fā)生耐藥性突變的有65.50%(150/229)，發(fā)生突變的位點(diǎn)有16個(gè)，主要的耐藥性突變?yōu)镸184I/V 43.67%(100/229)、≥1個(gè)胸苷類(lèi)似物相關(guān)突變(TAMs) 42.79%(98/229)、T215F/Y 31.88%(73/229)；針對(duì)蛋白酶抑制劑(PIs)發(fā)生耐藥性突變的有1.31%(3/229)，發(fā)生突變的位點(diǎn)較少只有4個(gè)，分別為M46I 2例、I54I/V 1例、G73S 1例、N88S 1例。

2.3病毒載量與HIV-1耐藥性突變發(fā)生的關(guān)系 在檢測(cè)出的耐藥性突變位點(diǎn)中發(fā)現(xiàn)，M184I/V突變位點(diǎn)在病毒載量3～、4～、5～ lg拷貝/mL的患者中的發(fā)生率分別為56.76%(24/74)、43.75%(42/96)、27.12%(16/59)，單因素logistic回歸分析結(jié)果顯示當(dāng)患者病毒載量5～ lg拷貝/mL時(shí)，發(fā)生M184I/V突變的比例比病毒載量3～ lg拷貝/mL時(shí)發(fā)生的比例下降(表1)。

表1　抗HIV病毒治療病毒未抑制患者體內(nèi)病毒載量與M184I/V突變發(fā)生的關(guān)系

2.4抗病毒治療時(shí)間與HIV-1耐藥性突變發(fā)生的關(guān)系 在檢測(cè)出的耐藥性突變位點(diǎn)中發(fā)現(xiàn)，K103N/S突變位點(diǎn)在患者治療時(shí)間6～個(gè)月、24～個(gè)月及48～個(gè)月時(shí)的發(fā)生率分別為27.27%(15/55)、34.04%(16/47)、57.48%(73/127)，單因素logistic回歸分析結(jié)果顯示當(dāng)患者治療時(shí)間48～個(gè)月時(shí)比治療時(shí)間6～個(gè)月的患者發(fā)生K103N/S突變的危險(xiǎn)性增加(表2)。

表2　抗HIV病毒治療病毒未抑制患者治療時(shí)間與K103N/S突變發(fā)生的關(guān)系

2.5抗病毒治療方案與HIV-1耐藥突變發(fā)生的關(guān)系K65R突變位點(diǎn)在使用含D4T一線抗病毒治療方案患者中的發(fā)生率為7.14%(3/42)，比使用非D4T 一線抗病毒治療方案1.07%(2/187)發(fā)生率高(P=0.044)。

3　討論

該次調(diào)查的231例一線抗病毒治療病毒未抑制患者中，除2例未擴(kuò)增成功外，其余229例均擴(kuò)增并測(cè)序成功，總耐藥率為81.66%(187/229)，雖然接近南非83.5%的病毒抑制失敗患者中的耐藥率[3]，但高于福建省61.3%的耐藥率[4]，這可能與患者抗病毒治療時(shí)間長(zhǎng)(超過(guò)一半患者治療時(shí)間大于4 a)，且使用易發(fā)生耐藥的含DDI的一線抗病毒治療方案有關(guān)[5]。

該調(diào)查結(jié)果顯示，針對(duì)NNRTI發(fā)生的耐藥性突變占主導(dǎo)地位，有185例(80.97%)患者出現(xiàn)了對(duì)NNRTI的耐藥性突變，高于對(duì)NRTI(65.50%)和PI (1.31%)的耐藥性突變，這與以往河南省抗病毒治療(DDI+AZT+NVP)人群耐藥性調(diào)查[6]相符。在出現(xiàn)針對(duì)NNRTI的耐藥性突變較多的位點(diǎn)中，發(fā)生頻率超過(guò)20%的突變?yōu)镵103N/S、Y181C、G190A/S，其中K103N/S出現(xiàn)頻率最高，這可能與河南省的流行B亞型和含NVP或EFV的治療方案有關(guān)。研究[7]顯示K103N的突變?cè)谡麄€(gè)B亞型的發(fā)生率是40%，是臨床上最重要的NNRTI耐藥突變，它可造成大多數(shù)可用NNRTI藥物20～50倍的耐藥[8]。同時(shí)在分析抗病毒治療時(shí)間與耐藥突變位點(diǎn)的關(guān)系中，發(fā)現(xiàn)K103N/S突變出現(xiàn)的頻率與治療時(shí)間有關(guān)，在治療時(shí)間48～個(gè)月時(shí)K103N突變發(fā)生的危險(xiǎn)性超過(guò)治療時(shí)間6～個(gè)月患者的3.603倍，這可能與此耐藥突變隨治療時(shí)間延長(zhǎng)而累積有關(guān)。

229例患者中，針對(duì)NRTI的M184I/V耐藥突變出現(xiàn)的頻率在所有耐藥突變中排在第2位，有104例(43.67%)；同時(shí)它也是針對(duì)NRTI發(fā)生耐藥突變最多的位點(diǎn)，其次是≥1個(gè)TAMs(42.79%)和T215F/Y(31.88%)。且在多項(xiàng)耐藥調(diào)查[9-10]中出現(xiàn)，M184I/V出現(xiàn)頻率排在前列。M184I/V突變出現(xiàn)后可在幾周內(nèi)就取代野生株產(chǎn)生對(duì)3TC和FTC的高度耐藥，導(dǎo)致含3TC抗病毒治療方案的失敗[11]，進(jìn)而對(duì)所有NRTI產(chǎn)生耐藥。但在分析抗病毒治療患者體內(nèi)病毒載量與耐藥突變位點(diǎn)的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，M184I/V耐藥突變發(fā)生高的患者體內(nèi)病毒載量較低，這可能與M184I/V突變降低了耐藥毒株的復(fù)制能力有關(guān)[12]，提示此位點(diǎn)耐藥突變的出現(xiàn)可降低患者體內(nèi)HIV病毒載量的水平。該研究中未發(fā)現(xiàn)高頻出現(xiàn)的耐藥突變位點(diǎn)在含3TC和DDI的一線抗病毒治療方案中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與使用這些初始治療方案的患者有約一半患者曾經(jīng)更換一線治療方案有關(guān)，但在低頻率出現(xiàn)的耐藥位點(diǎn)中發(fā)現(xiàn)使用含D4T的一線抗病毒治療方案的患者更易出現(xiàn)K65R耐藥突變，這與國(guó)外文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致。

由于河南省是國(guó)內(nèi)最早開(kāi)始一線抗病毒治療的省份，病毒未抑制患者產(chǎn)生的耐藥突變位點(diǎn)較多，耐藥模式復(fù)雜，雖然針對(duì)NNRTI和NRTI的耐藥性突變率較高，但針對(duì)PI的耐藥突變率還很低(1.31%)，建議應(yīng)根據(jù)耐藥監(jiān)測(cè)情況調(diào)整治療方案，減少或避免使用耐藥突變發(fā)生率高的NNRTI類(lèi)藥物的使用，選擇合適的二線抗病毒治療方案，以減少耐藥毒株的產(chǎn)生。

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(2015-11-19收稿責(zé)任編輯李沛寰)

Genotype resistant mutations among patients failed to high antiretroviral therapy in Henan Province

YUANYuan1),LIUHongwei1),LIUChunhua1),WANGZhe1),RUANYuhua2),XINGHui2)

1)InstituteforAIDS/STDControlandPrevention,HenanCenterforDiseaseControlandPrevention，Zhengzhou4500162)NationalCenterforAIDS/STDControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206

human immunodeficiency virus;drug resistance;antiretroviral treatment;gene mutation;Henan Province

Aim: To analyze the prevalence and diversity of genotype resistant mutations among patients failed to high antiretroviral therapy(HAART) in Henan Province. Methods: A total of 231 serum specimens of AIDS individuals with virus load ≥1 000 copies/mL were collected and had received more than six months treatment with HAART.The HIV-1 pol gene was amplified by RT-PCR，the sequences were then submitted to the Stanford University HIV drug resistance database to analyze the prevalence of resistant mutations. Results: A total of 229 plasma samples were amplified successfully for protease and reverse transcriptase fragments.Out of 229 sequences,185(80.79%),150(65.50%) and 3(1.31%) sequences occurred resistance mutations for non-nucleotide reverse transcriptase inhibitors(NNRTIs),nucleotide reverse transcriptase inhibitors(NRTIs) and protease inhibitors(PIs), respectively.The most common mutations to NNRTIs, NRTIs, and PIs were K103N/S 45.42%(104/229), M184I/V 43.67%(100/229) and M46I 0.87%(2/229), respectively. Univariate logistic regression analysis showed that among AIDS individuals, virus load 5- lg copies/mL decreased the risk of M184I/V mutation(OR=0.283，95%CI=0.136-0.592，P<0.001) compared with virus load 3- lg copies/mL. More than 48 months treatment with HAART had high rate of K103N/S mutation(OR=7.422，95%CI=1.637-33.651，P<0.001), compared with 6- months treatment. HAART with D4T was associated with high K65R mutation rate(P=0.044). Conclusion: The prevalence of HIV-1 drug resistance with complex patterns is higher among patients failed to HAART in Henan. Selecting more suitable antiretroviral treatment regimen is necessary to reduce the emergence of the drug resistant strains.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.05.022

*河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目102102310003，112102310005；河南省衛(wèi)生科技創(chuàng)新型人才工程專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目2010年

，男，1972年2月生，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：艾滋病防治，E-mail:Hongweiliu36@163.com

R183.9