鄭　玲　史靈敏　田?，摗巍±住∵叀§场」》濉⌒帯∪f書波，*　彭振英，3，*

1山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心 / 山東省作物遺傳改良與生態(tài)生理重點實驗室， 山東濟南 250100；2山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟南 250100；3新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 新疆烏魯木齊 830000

花生AhDGAT2a基因啟動子的克隆和功能驗證

鄭玲1，2史靈敏1，3田?，?，2單雷1，2邊斐1郭峰1宣寧1萬書波1，2，*彭振英1，2，3，*

1山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心 / 山東省作物遺傳改良與生態(tài)生理重點實驗室， 山東濟南 250100；2山東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟南 250100；3新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 新疆烏魯木齊 830000

二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGAT）是三酰甘油（TAG）合成途徑的限速酶， 對脂肪酸合成的調(diào)節(jié)具有關(guān)鍵作用。為了研究AhDGAT2a的表達調(diào)控， 利用GenomeWalking方法從魯花14基因組中克隆了AhDGAT2a上游5'側(cè)翼調(diào)控區(qū)1200 bp序列， 即AhDGAT2a啟動子（pAhDGAT2a）序列， 并利用生物信息學(xué)軟件分析其包含的調(diào)控元件， 發(fā)現(xiàn)其含有多個TATA-box和CAAT-box、光調(diào)控元件、脅迫防御相關(guān)元件和激素響應(yīng)元件。用pAhDGAT2a構(gòu)建pAhDGAT2a:GUS植物表達載體并轉(zhuǎn)化煙草品種SR1。利用組織染色法鑒定轉(zhuǎn)基因煙草的GUS表達模式， 發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因煙草的各個器官均有GUS酶活， 在柱頭、花藥和幼嫩種子中表達量較高， 說明pAhDGAT2a具有一定的組成型啟動子活性。

花生； AhDGAT2a基因； 啟動子； 功能驗證

植物油是食用油的主要來源， 約占全世界脂類消耗的75%［1］。植物油是由脂肪酸和甘油化合而成的天然化合物。脂肪酸， 是指一端含有一個羧基的長的脂肪族碳氫鏈，是機體主要能量來源之一。植物油的不飽和脂肪酸含量比較高， 作為食用油， 可以降低人體血液中膽固醇的含量，降低動脈硬化發(fā)生的幾率［2］。三酰甘油（triacylgycerol， TAG）是大多數(shù)植物和動物體內(nèi)最重要的油脂貯藏形式，具有重要的社會經(jīng)濟價值。?；o酶A:二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（acyl-CoA diacylgycerol acyltransferase， DGAT）是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細胞微粒體酶， 其主要作用是催化二酰甘油（diacylglycerol， DAG）加上?；舅嵝纬蒚AG［3］。該基因不僅與脂肪酸合成相關(guān)， 在種子萌發(fā)和葉片衰老等過程中也有一定的作用［4-7］。

1956年DGAT基因首次被發(fā)現(xiàn)［8］， 并很快引起研究人員的廣泛關(guān)注。根據(jù)結(jié)構(gòu)和細胞定位的差異， DGAT被分為DGAT1、DGAT2、WS/DGAT和胞質(zhì)DGAT四種類型［9-10］。DGAT1屬于包括酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶ACAT1和ACAT2在內(nèi)的膜結(jié)合?；D(zhuǎn)移酶（membrane-bound O-acyltransferases， NBOAT）家族的一部分［11］。DGAT2是一個蛋白超級家族， 在動物［12］、植物［13］和酵母［14］中都存在， 但是與DGAT1蛋白家族沒有明顯的相關(guān)性。WS/DGAT和胞質(zhì)DGAT是近幾年發(fā)現(xiàn)的DGAT基因家族的新成員， 目前相關(guān)研究較少。胞質(zhì)DGAT （Cyto DGAT）是從花生未成熟種子中獲得的一類新型二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因［9］， 該基因沒有跨膜結(jié)構(gòu)， 與WS/DGAT具有13%的一致性， 與DGAT1和DGAT2家族具有不到10%的相似性。DGAT1和DGAT2大多被定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［15-16］， 而胞質(zhì)DGAT是一種定位于細胞質(zhì)中的可溶性蛋白［9］。

DGAT1和DGAT2對于種子油脂合成非常重要［17-18］，是Kennedy途徑中唯一的限速酶。在擬南芥中過量表達DGAT1基因可使種子含油量顯著提高， 而且可使轉(zhuǎn)基因擬南芥種子內(nèi)的DGAT活性比野生型提高10%～70%［19］。在玉米中過量表達DGAT1不僅可使轉(zhuǎn)基因玉米種子含油量提高， 而且改變了油脂組成［20］。DGAT2在大豆等轉(zhuǎn)基因油料作物中過量表達均能提高種子的含油量［21-22］。

DGAT基因一直是油料作物的研究熱點?；ㄉ谖覈姆N植面積已超過460萬公頃， 總產(chǎn)量居世界首位［23］?；ㄉ讶蚀种竞?0%左右， 僅次于芝麻［24］。由于DGAT在植物種子發(fā)育過程中影響種子油分含量、脂肪酸組成等，對于油料作物花生DGAT的研究具有重要經(jīng)濟意義。目前花生的DGAT基因也有一些研究成果［9，25-27］， 但是對DGAT基因啟動子的研究卻很少。

我們前期從花生中克隆得到了AhDGAT2a基因（GenBank登錄號為JF897614）， 該基因編碼區(qū)為1005 bp，將該基因在煙草中過表達， 發(fā)現(xiàn)其能改變轉(zhuǎn)基因煙草葉片的總脂肪酸含量和組成［25］。將AhDGAT2a基因在大腸桿菌Rosetta （DE3）表達， 能使大腸桿菌的體積增大2.4～2.5倍， 同時提高大腸桿菌的總脂肪酸含量［26］。為進一步研究AhDGAT2a基因的表達模式和基因組信息， 我們通過GenomeWalking方法從花生中克隆了AhDGAT2a基因的啟動子序列（pAhDGAT2a）， 并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草進行功能驗證。這為我們研究植物DGAT2的功能和油料作物TAG的合成及調(diào)控提供了依據(jù)， 為我們培育油料作物新品種奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1 試驗材料及菌液

花生品種魯花14由實驗室保存， 室內(nèi)培育后取幼葉，液氮速凍保存在–80℃。煙草品種SR1由實驗室保存。大腸桿菌（Escherichia coil） DH5α， 根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株LBA4404， 表達載體pCAMBIA2301均由本實驗室保存。

1.2生化試劑及試劑盒

材料基因組DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒DNA提取試劑盒為TIANGEN公司產(chǎn)品。Genome Walking試劑盒購自TaKaRa。T4 DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶購自Fermentas。其他化學(xué)試劑為國藥產(chǎn)品。引物合成和測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3pAhDGAT2a克隆與序列測定

pAhDGAT2a的克隆按照GenomeWalking試劑盒進行3輪擴增。用到的引物SP1: 5'-GGAGAGAGGTAGAA AGAGAAG-3'， SP2: 5'-CGCAAGCGCCAGCGTCGTTTT GAAGC-3'， SP3: 5'-CCGCCGGCGGCGCCACCGTGACG TT-3'從上海生工合成。反應(yīng)體系含基因組DNA 1 μg、2.5 mmol L–1dNTPs混合物8 μL、10×LA PCR buffer II 5 μL、5 U TaKaRa LA Taq 0.5 μL、100 μmol L–1AP1 Primer 1 μL、10 μmol L–1SP1 Primer 1 μL， ddH2O加到總體積50 μL。反應(yīng)條件為94℃ 1 min， 98℃ 1 min， 5個循環(huán)的94℃ 30 s， 65℃ 1 min， 72℃ 2 min， 然后94℃ 30 s； 25℃ 3 min； 72℃ 2 min， 15個循環(huán)的94℃ 30 s； 65℃ 1 min； 72℃ 2 min； 94℃ 30 s； 65℃ 1 min； 72℃ 2 min； 94℃ 30 s；44℃ 1 min； 72℃ 2 min， 最后72℃延伸10 min。第1輪產(chǎn)物稀釋100倍后取1 μL作為第2輪模板， 以AP1 Primer為上游引物， SP2為下游引物， 其余同第1輪擴增體系。反應(yīng)條件為15個循環(huán)的94℃ 30 s； 65℃ 1 min； 72℃ 2 min； 94℃ 30 s； 65℃ 1 min； 72℃ 2 min； 94℃ 30 s； 44℃1 min； 72℃ 2 min， 最后72℃延伸10 min。第2輪產(chǎn)物稀釋100倍后取1 μL作為第3輪模板， 以AP1 Primer為上游引物， SP3為下游引物其余同第1輪擴增體系， 反應(yīng)條件同第2輪。第2輪和第3輪PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測， 回收純化目的條帶， 連接到pMD18-T載體測序。測序完成后用PlantCARE軟件分析其調(diào)控元件。

1.4pAhDGAT2a:GUS植物表達載體構(gòu)建

將得到的pAhDGAT2a序列用引物PD2F/PD2R擴增，引物序列為PD2F: 5'-TCTAGA ACGACTGCCACATTATA CATTCTAGC-3'， PD2R: 5'-CCATGGTTTGGATTCGGTGG CTGTTG-3'， 引物兩側(cè)分別添加Xba I和Nco I酶切位點。提取花生幼葉的基因組DNA， 用基因組DNA為模板進行PCR擴增， 得到的序列進行雙酶切， 利用T4連接酶連接到pCAMBIA2301載體， 替換pCAMBIA2301載體上的CaMV35S啟動子。連接體系為PCR片段6 μL， 載體DNA 2 μL， 10×T4連接酶1 μL， T4 DNA連接酶1 μL。上述體系于16℃過夜連接， 連接體系轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，測序確定pAhDGAT2a:GUS表達載體構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的pAhDGAT2a:GUS表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞， 挑取單菌落進行PCR驗證， 陽性克隆保存菌液待用。

1.5煙草遺傳轉(zhuǎn)化

煙草種子經(jīng)75%乙醇和次氯酸鈉消毒， 無菌水洗凈后播于1/2 MS0基本培養(yǎng)基上生長4～5周， 利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草。將攜帶pAhDGAT2a:GUS表達載體的農(nóng)桿菌于28℃， 200轉(zhuǎn) min–1振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。取煙草葉片，剪成小塊（0.5 cm × 0.5 cm）置MS0重懸的菌液中15 min，取出后用無菌濾紙吸干水分。在MS分化培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2 d后取出， 于MS選擇培養(yǎng)基（含100 mg L–1kanamycin）上誘導(dǎo)長出叢生芽， 將叢生芽切下放入伸長培養(yǎng)基長至3～5 cm時， 轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基使其生根。將生根后的幼苗移入盛有無菌土的花盆， 溫室常規(guī)管理。

1.6 陽性植株的分子檢測

利用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因煙草葉片的DNA， 利用引物PD2F/PD2R進行PCR檢測。將陽性煙草的幼苗和其他組織器官加入GUS染液， 37℃保溫16 h。用70%乙醇沖洗浸泡， 在體視解剖鏡下觀察染色情況并照相。

2　結(jié)果與分析

2.1pAhDGAT2a啟動子克隆與測序

利用GenomeWalking試劑盒， 經(jīng)過3輪擴增得到pAhDGAT2a的核苷酸片段（圖1）， 長度1200 bp左右。將該序列連接到pMD18-T載體上測序表明， 該序列為AhDGAT2a基因的啟動子序列。

圖1　pAhDGAT2a的兩輪擴增結(jié)果Fig. 1 PCR products of pAhDGAT2a promoterM: DL2000； A: 第2輪擴增結(jié)果； B: 第3輪擴增結(jié)果。M: DL2000； A: products of the second round PCR； B: products of the third round PCR.

2.2pAhDGAT2a啟動子的序列分析

PlantCARE分析顯示該序列含有126個TATA-box和22個CAAT-box元件， 符合啟動子的一般特點。該啟動子序列含有多個與脅迫和防御相關(guān)的順式作用元件， 主要包括一個參與干旱應(yīng)答反應(yīng)的MBS元件， 3個參與高溫應(yīng)答反應(yīng)的HSE元件， 2個參與脅迫和防御應(yīng)答反應(yīng)的TC-rich repeats。另外還含有3種激素應(yīng)答元件， 包括2個激素應(yīng)答元件TGA-元件， 2個茉莉酸應(yīng)答元件CGTCA-motif和TGACG-motif， 一個赤霉素應(yīng)答元件GARE-motif。該啟動子還含有真菌激活子應(yīng)答元件W1-box及一些光應(yīng)答元件（Sp1、I-box、GT1-motif、ACE和MNF1）。這表明AhDGAT2a的表達調(diào)控可能受多種因素的影響。

2.3煙草的遺傳轉(zhuǎn)化與分子檢測

先利用卡那霉素初步篩選， 再利用PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因煙草株系（圖2）。結(jié)果表明， 有14個株系在1200 bp左右出現(xiàn)條帶， 該片段與目的條帶大小一致， 表明我們得到了陽性轉(zhuǎn)基因煙草株系。

2.4轉(zhuǎn)基因煙草的GUS染色

利用GUS染色方法檢測GUS基因在T2代轉(zhuǎn)基因煙草的各組織器官表達的結(jié)果表明（圖3）， GUS在轉(zhuǎn)基因煙草的營養(yǎng)和生殖器官均有表達， 其中在柱頭、花藥和幼嫩種子中表達量較高（圖3-G， H）， 而在花絲和花柱中則基本不表達（圖3-F， G）。

圖2　PCR檢測轉(zhuǎn)基因煙草Fig. 2 PCR detection of the transgenic tobacco lines1～18: 轉(zhuǎn)基因煙草株系； M: DL2000； +: 陽性對照； –: 陰性對照； WT: 野生型煙草。1–18: transgenic tobacco lines； M: DL2000； +: positive control； –: negative control； WT: wide type tobacco.

3　討論

TAG是大多數(shù)植物和動物體內(nèi)最重要的油脂貯藏形式， DGAT是TAG合成反應(yīng)的限速酶， 對于種子油脂合成非常重要［17-18］。在擬南芥等多種植物中過量表達DGAT基因均能顯著提高種子的含油量［17，19，28-30］。我們實驗室前期從花生中克隆得到了DGAT2基因， 將其與CaMV35S啟動子相連接， 構(gòu)建植物表達載體轉(zhuǎn)化煙草并對其進行了功能驗證， 發(fā)現(xiàn)其能提高轉(zhuǎn)基因煙草的總脂肪酸含量［25］。

啟動子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游區(qū)的DNA序列，能夠使RNA聚合酶與之結(jié)合并起始目標基因轉(zhuǎn)錄， 是轉(zhuǎn)錄水平上基因表達調(diào)控的關(guān)鍵部位。啟動子上的順式作用元件通常含有TATA-box、CAAT-box和GC-box元件， 其中TATA-box是啟動子上最具特征的序列。本研究的pAhDGAT2a中含有126個TATA-box和22個CAAT-box元件， 表明其具有典型啟動子的特征。

不同的啟動子都具有自己特異的調(diào)節(jié)序列， 如USE、MSP等。大多數(shù)綠色植物都包含若干個光應(yīng)答元件（light response element）， 如G-box［31-32］、I-box［31］、GT1元件（或GATA元件）［33］、AT富含元件［34-35］、Z-box［36］等， 這些作用元件對光調(diào)控的轉(zhuǎn)錄激活是必需的［37］。在pAhDGAT2a中也含有一些光應(yīng)答元件， 而前期研究表明AhDGAT2基因在花生葉片中具有一定的表達量［25］， 這些結(jié)果表明AhDGAT2的表達調(diào)控可能會受到光信號的影響。pAhDGAT2a還包含激素響應(yīng)元件和脅迫誘導(dǎo)元件， 預(yù)示AhDGAT2a的表達受激素誘導(dǎo)， 并且在脅迫響應(yīng)中起一定的作用。我們前期分析了AhDGAT2基因在不同脅迫（冷、干旱、鹽、紫外照射、ABA、機械損傷和病害）下的表達模式， 結(jié)果表明AhDGAT2基因在受到機械損傷時表達下調(diào)最明顯， 在冷、干旱、鹽和紫外照射脅迫下表達量略有下降， 而在ABA處理和病害脅迫下表達顯著上調(diào)［25］。這恰好與pAhDGAT2a含有多種脅迫相關(guān)元件相吻合。在他人研究中也有類似報道， 如麻風(fēng)樹的種子特異性啟動子JcMFT1受脫落酸誘導(dǎo)， 是由于其含有ABA應(yīng)答元件、G-box、RY repeat等元件［38］； Xu等［39］在中國華東野生葡萄中克隆了一個受白粉病和赤星病誘導(dǎo)表達的VpSTS誘導(dǎo)型啟動子， 通過序列分析發(fā)現(xiàn)該啟動子含有Box-W1、TC-rich element、ABRE、MBS、LTR等特殊元件。

圖3　轉(zhuǎn)基因煙草的GUS染色圖Fig. 3 GUS staining of the transformed tobacco linesA～D: 野生型煙草； E～H: 轉(zhuǎn)基因煙草； A， E: 煙草幼苗； B， F: 花；C， G: 花藥和柱頭； D， H: 未成熟的種子。A～C， E～G比例尺為1 cm； D， H比例尺為1 mm。A–D， wild type tobacco； E–H， transgenic tobacco. A and E: seedlings； B and F: flowers； C and G: anthers and stigmas；D and H: immature seeds. Bars = 1 cm in A–C and E–G； bars = 1 mm in D， H.

目前關(guān)于植物DGAT1基因組織特異性表達的研究有較多報道， 而關(guān)于植物DGAT2基因的組織器官特異性表達的研究較少。普遍認為大多數(shù)高等植物的DGAT1基因在各組織器官中均表達， 而DGAT2則與植物種子中特殊脂肪酸的積累有關(guān)。擬南芥DGAT1在發(fā)育中的種子、花瓣、花芽中表達量高， 而在葉和莖中表達量低［19］， 大多數(shù)雙子葉植物例如大豆、斑鳩菊、油菜的表達模式與擬南芥相似［14，17，40］， 而旱金蓮DGAT1只在發(fā)育的種子中表達［41］。桐樹DGAT2基因在種子發(fā)育中期被較強誘導(dǎo)表達， 而在其他器官中表達量很低， 表明桐樹DGAT2與種子中脂肪酸積累直接相關(guān)［28］。斑鳩菊、大戟、琉璃苣和蓖麻的DGAT2基因在種子發(fā)育早期高表達， 而大豆DGAT2基因在種子中的表達量很低。相反， 大豆DGAT1基因在種子中表達量較高［42］。我們前期關(guān)于AhDGAT2基因組織器官特異性表達模式研究表明， 該基因在花生的各個器官都表達， 但是在葉、花以及種子發(fā)育前期表達量較高［25］。本研究中將pAhDGAT2a構(gòu)建GUS植物表達載體并轉(zhuǎn)化煙草， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列不僅能正確啟動GUS基因表達， 而且在轉(zhuǎn)基因煙草的各個器官中都表達， 與我們前期研究結(jié)果一致， 但是與桐樹DGAT2和大豆DGAT2的表達特點顯著不同。本研究中GUS活性在轉(zhuǎn)基因煙草柱頭和花藥中較強表達， 顯示出AhDGAT2a基因在花生授粉中的重要性， 這一點在其他文獻中未見報道。這些研究均表明，DGAT1與DGAT2基因的組織器官特異性表達模式因物種而異。二者不僅在植物種子脂肪酸合成中具有重要作用，同時對于其他組織器官內(nèi)的脂肪酸合成（比如維持細胞膜脂類的動態(tài)平衡）， 甚至對于植物個體的整個發(fā)育過程都具有十分重要的作用。

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Cloning and Functional Analysis of Peanut AhDGAT2a Promoter

ZHENG Ling1，2， SHI Ling-Min1，3， TIAN Hai-Ying1，2， SHAN Lei1，2， BIAN Fei1， GUO Feng1， XUAN Ning1，WAN Shuo-Bo1，2，*， and PENG Zhen-Ying1，2，3，*

1Biotechnology Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences / Shandong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement，Ecology and Physiology， Jinan 250100， China；2College of Life Science， Shandong University， Jinan 250100， China；3College of Agronomy， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830000， China

Diacylglycerol acyltransferase （DGAT） is a rate-limiting enzyme in triacylglycerol （TAG） biosynthesis pathway. In this study， GenomeWalking method was used for cloning the promoter sequence of AhDGAT2a gene from Luhua 14， and finally a 1200 bp fragment flanking 5′-upstream of AhDGAT2a was obtained and named as pAhDGAT2a. The crucial regulatory elements in pAhDGAT2a were further analyzed with software PlantCARE. There were many TATA-box， CAAT-box， light regulation， stress and defense response and hormone response elements. To assess the activity of pAhDGAT2a， we constructed pAhDGAT2a:GUS cassettes and introduced it into the tobacco SR1 genome by Agrobacterium-mediated transformation. Expression pattern was monitored by histochemical staining. Results showed that GUS activity driven by the pAhDGAT2a was detected in almost all vegetative and reproductive tissues， with a higher expression level in stigma， anther and young seeds than in the other organs，indicating that pAhDGAT2a has a constitutive promoter activity.

Arachis hypogaea L.； AhDGAT2a gene； Promoter； Function analysis

10.3724/SP.J.1006.2016.01094

本研究由山東省自然科學(xué)基金項目（ZR2013CM036）和山東省良種工程項目（2014-2017）資助。

This study was supported by Natural Science Foundation of Shandong （ZR2013CM036） and Shandong Province Germplasm Innovation and Utilization Project （2014–2017）.

（Corresponding authors）: 萬書波， E-mail: wansb@saas.ac.cn， Tel: 0531-83178335； 彭振英， E-mail: pengzhenying2005@126.com

聯(lián)系方式: E-mail: zhengling0000@sina.com， Tel: 0531-83178083

Received（）: 2016-01-11； Accepted（接受日期）: 2016-05-09； Published online（網(wǎng)絡(luò)出版日期）: 2016-05-11.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160511.1551.006.html