劉　藝，馮坤苗，狄志彪，張盼盼，韓春超，顧正位

靈芝液體發(fā)酵菌絲體中Agaricoglyceride A前體物質(zhì)篩選

劉藝，馮坤苗，狄志彪，張盼盼，韓春超，顧正位*

（山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250355）

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對靈芝液體發(fā)酵菌絲體中合成Agaricoglyceride A的前體物質(zhì)（二氯茴香酸、甲醇、甘油）加入量進(jìn)行優(yōu)化，篩選提高Agaricoglyceride A含量的前體物質(zhì)的最適添加量。并采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）法對Agaricoglyceride A含量進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，同時加入二氯茴香酸75 mg/L，甲醇1.5 mL/L，甘油1.5 mL/L對靈芝進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定得到AgaricoglycerideA的實際含量為21.09mg/L，與不添加任何前體物質(zhì)相比，AgaricoglycerideA的含量提高了25.31%。

靈芝；發(fā)酵；前體物質(zhì)；Agaricoglyceride A；響應(yīng)面分析

靈芝（Ganoderma lucidum）始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是一種珍貴的藥食兩用菌［1］，具有補氣安神，止咳平喘的作用［2-3］。2015年版《中華人民共和國藥典》將赤芝或紫芝的干燥子實體收入作為藥材靈芝的來源［4］。目前對于靈芝的培育多采用液體深層發(fā)酵法［5-7］，得到的菌絲體周期短、成本低、質(zhì)量穩(wěn)定［8-10］。有研究表明，靈芝菌絲體中含有一種新型的真菌次生代謝物蘑菇酸甘油脂Agaricoglyceride A，其能夠選擇性地抑制溶神經(jīng)素的活性，而該溶神經(jīng)素對一些生物學(xué)上具有特殊活性（如鎮(zhèn)痛）的肽類物質(zhì)具有一定的滅活作用［11-13］，Agaricoglyceride A對溶神經(jīng)素的選擇性抑制能夠增強這些肽類物質(zhì)的鎮(zhèn)痛等活性［14-15］，因此研究Agaricoglyceride A對于靈芝的有效利用和新藥的開發(fā)具有重要意義和應(yīng)用前景。

STADLER M等［15］對Agaricoglyceride A進(jìn)行化學(xué)合成，利用氯化的4-羥基苯甲酸和丙三醇反應(yīng)得到蘑菇酸甘油脂。除此之外，Stadler還對其加入不同前體物質(zhì)進(jìn)行生物合成后的Agaricoglyceride A含量進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)加入合成酸和羥基苯甲酸均能提高Agaricoglyceride A的含量。在Agaricoglyceride A化學(xué)合成及其生物合成的基礎(chǔ)上，本文加入前體物質(zhì)二氯茴香酸、甘油及甲醇在靈芝液體發(fā)酵過程中進(jìn)行生物合成，來提高Agaricoglyceride A的含量。前期研究發(fā)現(xiàn)，在不添加任何前體物質(zhì)的情況下，靈芝液體發(fā)酵菌絲中Agaricoglyceride A的含量為16.83 mg/L。實驗以二氯茴香酸、甘油及甲醇的加入量作為影響因子，靈芝液體發(fā)酵菌絲中Agaricoglyceride A的含量作為響應(yīng)值，采用3因素3水平的Box-Behnken中心組合設(shè)計進(jìn)行響應(yīng)面法分析，為Agaricoglyceride A的開發(fā)提供理論依據(jù)和方法指導(dǎo)，同時為靈芝的深入研究提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

靈芝菌株：購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種保存在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上，于4℃進(jìn)行保存。

1.1.2對照品與試劑

Agaricoglyceride A對照品（純度為96%）：中國科學(xué)院心理研究所；無水乙醇、乙酸乙酯（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甘油（純度為99.5%）、甲醇（純度為99%）：天津富宇精細(xì)化工有限公司；乙腈（均為色譜純）：美國天地公司；三氟乙酸：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；二氯茴香酸：帝鑫化工制造有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基

常規(guī)馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：土豆20%，瓊脂2%，葡萄糖2%；

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：土豆用量為21.79 g/100 mL，葡萄糖2.23 g/100 mL，麩皮用量為5.00 g/100 mL，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.15%。

1.2儀器與設(shè)備

YP100C2電子天平：上海天平儀器廠；YX-280D手提式壓力蒸汽滅菌鍋：寧波久興醫(yī)療器械有限公司；ZHJHC1109B潔凈工作臺：深圳市碧海青云凈化科技有限公司；XMTD-4000恒溫培養(yǎng)箱：金壇市岸頭良友實驗儀器廠；HY-5A回旋振蕩器：金壇市文華儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；XMTD-4000儀表恒溫水浴鍋、ZKXB-2電熱真空干燥箱：上海樹立儀器儀表有限公司；KQ-100B型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；Waters e2695型高效液相色譜儀、Waters 2424型蒸發(fā)光散射檢測器：美國Waters有限公司。

1.3方法

1.3.1靈芝液體發(fā)酵菌絲中Agaricoglyceride A的含量測定

（1）Agaricoglyceride A供試品的制備

將發(fā)酵培養(yǎng)完成的靈芝用紗布過濾后獲得菌絲，將其轉(zhuǎn)移至不同的蒸發(fā)皿中，置于烘箱60℃干燥至質(zhì)量恒定。干燥菌絲粉碎，過100目篩。加入10倍量無水乙醇160 W超聲提取2次，3 000 r/min離心5 min后合并提取液，水浴60℃蒸干后加入一定量蒸餾水，用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液水浴蒸干后精密稱定，用甲醇溶解定容至容量瓶中。

（2）Agaricoglyceride A對照品的制備

精密稱取Agaricoglyceride A對照品25.00 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得1 mg/mL的對照品溶液。

（3）高效液相色譜條件

表1　梯度洗脫程序Table 1 The gradient eluted program

美國Waters e2695型高效液相色譜儀及Empower3工作站；檢測器：Waters2424型蒸發(fā)光散射檢測器（evaporative light scattering detector，ELSD）；色譜柱：Welch Ultimate XB-C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相A為0.1%三氟乙酸水，流動相B為乙腈；采用梯度洗脫，洗脫程序見表1。流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；ELSD參數(shù)：漂移管溫度60℃，氮氣流速25 mL/min，柱溫30℃；運行時間60 min。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密吸?。?）項下對照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，分別用色譜甲醇定容至10 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50 mg/mL的對照品溶液，各取10 μL注入色譜儀中，按（1）項方法測定，記錄峰面積。其質(zhì)量濃度與峰面積的線性回歸方程為Y=1.47X+6.3，R=0.999 3，在0.10～0.50 mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

（5）高效液相色譜法測定Agaricoglyceride A的含量

取發(fā)酵菌絲樣品，按（1）項方法制備供試品溶液，每種菌種平行制備3份，精密量取10μL進(jìn)樣，利用Agaricoglyceride A對照品的工作曲線Y=1.47X+6.3計算各樣品中被測Agaricoglyceride A的質(zhì)量濃度，每個樣品測3次求平均值，最后計算每升發(fā)酵液中Agaricoglyceride A的含量。

1.3.2前體物質(zhì)加入量單因素試驗

采用液體發(fā)酵培養(yǎng)，進(jìn)行前體物質(zhì)加入量的單因素試驗，研究Agaricoglyceride A合成前體物二氯茴香酸、甲醇、甘油的加入量對靈芝液體發(fā)酵中Agaricoglyceride A含量的影響。

（1）二氯茴香酸加入量單因素試驗

在培養(yǎng)基中分別加入甲醇1 mL、甘油1 mL，再分別加入0、25 mg/L、50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L、125 mg/L的二氯茴香酸，根據(jù)“1.3.1”項下的方法測定Agaricoglyceride A的含量，各試驗均進(jìn)行3次重復(fù)處理。

（2）甲醇加入量單因素試驗

在培養(yǎng)基中分別加入二氯茴香酸50 mg、甘油1 mL，再分別加入0、0.5mL/L、1.0mL/L、1.5mL/L、2.0 mL/L、2.5mL/L的甲醇，根據(jù)“1.3.1”項下的方法測定Agaricoglyceride A的含量，各試驗均進(jìn)行3次重復(fù)處理。

（3）甘油加入量單因素試驗

在培養(yǎng)基中分別加入二氯茴香酸50 mg、甲醇1 mL，再分別加入0、0.5mL/L、1.0mL/L、1.5mL/L、2.0mL/L、2.5mL/L的甘油，根據(jù)“1.3.1”項下的方法測定Agaricoglyceride A的含量，各試驗均進(jìn)行3次重復(fù)處理。

1.3.3 Agaricoglyceride A前體物質(zhì)加入量響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化分析法中Box-Behnken中心組合設(shè)計的原理，綜合單因素試驗的結(jié)果，采用Design-Expert（version8.0.6.1）分析軟件設(shè)計并進(jìn)一步進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗，試驗因子和水平見表2，優(yōu)化試驗以發(fā)酵菌絲中Agaricoglyceride A的含量作為考察指標(biāo)，來確定各個因素對靈芝液體發(fā)酵菌絲中Agaricoglyceride A含量影響的顯著性及各前體物質(zhì)的最佳加入量。

表2　響應(yīng)面試驗因素水平及編碼Table 2 Factors and coded levels of response surface methodology

1.3.4數(shù)據(jù)處理

采用響應(yīng)面分析軟件Design-Expert（version 8.0.6.1）對本試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸模擬方程的建立及相關(guān)方差分析，并對模擬方程所代表的響應(yīng)面進(jìn)行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1 Agaricoglyceride A前體物質(zhì)加入量單因素試驗結(jié)果

2.1.1二氯茴香酸的加入量對AgaricoglycerideA含量的影響

二氯茴香酸的加入量對AgaricoglycerideA含量的影響如圖1所示。由圖1可知，隨著二氯茴香酸加入量的增加，靈芝發(fā)酵菌絲中Agaricoglyceride A的含量也在逐漸增大，根據(jù)Agaricoglyceride A的結(jié)構(gòu)分析考慮，可能二氯茴香酸是其合成的主要前體物質(zhì)之一，故二氯茴香酸的加入量增加其AgaricoglycerideA的含量也相應(yīng)增大。但是當(dāng)二氯茴香酸的加入量超過75 mg/L時，Agaricoglyceride A的含量增幅很小，綜合成本考慮，在優(yōu)化試驗中選擇二氯茴香酸加入量在25～75mg/L范圍內(nèi)。

圖1　二氯茴香酸加入量對Agaricoglyceride A含量的影響Fig.1 Effect of dichloro anisic acid addition on Agaricoglyceride A production

2.1.2甲醇加入量對Agaricoglyceride A含量的影響

甲醇的加入量對Agaricoglyceride A含量的影響如圖2所示。隨著甲醇加入量的增加，Agaricoglyceride A的含量先增大后減小，在甲醇加入量為1.0 mL/L時，達(dá)到最大值即18.03 mg/L，隨后Agaricoglyceride A的含量逐漸降低。由圖2可知，甲醇對靈芝液體發(fā)酵菌絲中Agaricoglyceride A含量的提高有一定促進(jìn)作用，但甲醇的量過多反而會減少Agaricoglyceride A的含量。因此，在優(yōu)化試驗中選擇甲醇加入量在0.5～1.5 mL/L范圍內(nèi)。

圖2　甲醇加入量對Agaricoglyceride A含量的影響Fig.2 Effect of methanol addition on Agaricoglyceride A production

2.1.3甘油加入量對Agaricoglyceride A含量的影響

甘油的加入量對Agaricoglyceride A含量的影響如圖3所示。隨著甘油加入量的增加，Agaricoglyceride A的含量也逐漸增大。當(dāng)甘油加入量達(dá)到1.0mL/L時，Agaricoglyceride A的含量達(dá)到最大為18.55 mg/L，而當(dāng)甘油加入量繼續(xù)加大后，Agaricoglyceride A的含量出現(xiàn)下降的趨勢?？紤]在靈芝液體發(fā)酵過程中，甘油的加入量過大會一定程度上抑制Agaricoglyceride A的合成。因此，在優(yōu)化試驗中選擇甘油添加量為0.5～1.5 mL/L。

圖3　甘油加入量對Agaricoglyceride A含量的影響Fig.3 Effect of glycerinum addition on Agaricoglyceride A production

2.2響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素試驗的結(jié)果，以二氯茴香酸加入量（A）、甲醇加入量（B）和甘油加入量（C）作為影響因子，以靈芝發(fā)酵菌絲體中Agaricoglyceride A的含量（Y）作為響應(yīng)值，并在單因素的試驗基礎(chǔ)上采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行優(yōu)化，其試驗方案及結(jié)果見表3。

表3　響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface methodology

2.2.2模擬方程的建立與方差分析

采用Design-Expert（version 8.0.6.1）分析軟件對表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多項式擬合回歸，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型：Y=19.61+1.21A+0.22B+0.23C+0.11AB+0.17AC+0.19BC-0.14A2-0.22B2-0.061C2，各因素方差分析結(jié)果見表4。其中，回歸方程中各變量對指標(biāo)（響應(yīng)值）影響的顯著性，由F檢驗來判定，概率P（F＞Fα）的值越?。ǎ?.05），則其相應(yīng)變量的顯著程度就越高。由表4可見，各因素中一次項都是高度顯著的（P＜0.01），因素A、B二次項對Agaricoglyceride A含量的影響有顯著性影響（P＜0.05），而因素C的二次項對Agaricoglyceride A含量的影響不顯著（P＞0.05），交互項BC對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。該模型模擬的回歸方程也顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著，并且該模型的決定系數(shù)R2= 0.994 1，調(diào)整決定系數(shù)RAdj2=0.986 4，則說明該模型與實際試驗擬合程度較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于靈芝液體發(fā)酵菌絲體中Agaricoglyceride A含量的理論預(yù)測。

表4　靈芝發(fā)酵菌絲中Agaricoglyceride A含量方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis of Agaricoglyceride A production in Ganoderma lucidumliquid fermentation mycelium

2.2.3響應(yīng)面分析

試驗因素交互作用對響應(yīng)值影響的響應(yīng)面分析結(jié)果見圖4。由圖4可知，并非所有的因素都對AgaricoglycerideA的含量有顯著性影響。由圖4（A）可知，二氯茴香酸和甘油的加入量對靈芝發(fā)酵菌絲體中Agaricoglyceride A的含量影響最顯著，且隨著二氯茴香酸和甘油加入量的增加，AgaricoglycerideA的含量也隨之增大。由圖4（B）可知，隨著二氯茴香酸加入量的增加，Agaricoglyceride A的含量也在逐漸增大，而當(dāng)甲醇加入量增加時Agaricoglyceride A的含量變化不大。由圖4（C）可知，說明甲醇和甘油加入量對Agaricoglyceride A的含量影響顯著。經(jīng)過軟件分析，得到靈芝液體發(fā)酵菌絲體中Agaricoglyceride A的含量達(dá)到預(yù)測最大值為21.15 mg/L，此時其前體物質(zhì)的最佳加入量分別是二氯茴香酸74.665 mg/L，甲醇1.504 mL/L，甘油1.498 mL/L。結(jié)合實際操作，最佳加入量調(diào)整為75 mg/L，甲醇1.5 mL/L，甘油1.5 mL/L。

圖4　二氯茴香酸、甲醇、甘油添加量交互作用對Agaricoglyceride A含量影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effect of dichloro anisic acid，methanol and glycerinum addition on Agaricoglyceride A production

2.2.4模型驗證

通過軟件分析，預(yù)測得到靈芝液體發(fā)酵菌絲體中Agaricoglyceride A含量最大為21.15 mg/L，為驗證響應(yīng)面分析法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化的前體物加入量（二氯茴香酸75 mg/L，甲醇1.5 mL/L，甘油1.5 mL/L）進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，利用高效液相色譜法分析測定計算的AgaricoglycerideA的實際含量為21.09mg/L，結(jié)果見圖5，與理論預(yù)測值相比，相對誤差約為1%。因此，該響應(yīng)面模型能夠較好地來預(yù)測合成AgaricoglycerideA的前體物質(zhì)加入量對靈芝液體發(fā)酵菌絲體中AgaricoglycerideA含量的影響。前期不添加任何前體物質(zhì)進(jìn)行靈芝的液體發(fā)酵，得到Agaricoglyceride A含量約為16.83mg/L，在該優(yōu)化工藝下得到的菌絲與其相比，Agaricoglyceride A含量提高了25.31%，提高幅度較大，表明該條件下發(fā)酵靈芝菌絲體以增加Agaricoglyceride A含量是可行的。

圖5　Agaricoglyceride A標(biāo)準(zhǔn)品（A）與靈芝樣品（B）色譜圖Fig.5 High performance liquid chromatography ofGanoderma lucidumstandard（A）and sample（B）

3　結(jié)論

本試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對靈芝液體發(fā)酵菌絲體中合成Agaricoglyceride A的前體物質(zhì)加入量進(jìn)行優(yōu)化，在最優(yōu)條件下靈芝液體發(fā)酵菌絲體中Agaricoglyceride A的含量得到了提高。在菌種發(fā)酵期間，采用在發(fā)酵液中直接滴加前體可顯著提高發(fā)酵效價，但前體物質(zhì)的濃度、滴加時間、加入量均對發(fā)酵效價有一定的影響。為了進(jìn)一步提高AgaricoglycerideA的產(chǎn)量，下一步需要研究前體物質(zhì)的最優(yōu)加入時間。近年來對Agaricoglyceride A藥理活性的研究不斷深入，其對溶神經(jīng)素的選擇性抑制作用也得到了證實，因此研究和開發(fā)Agaricoglyceride A對于靈芝的有效利用和新藥的開發(fā)具有重要意義和應(yīng)用前景。

［1］朱強，夏艷秋，汪志君，等.4種中藥對靈芝生長與發(fā)酵的影響［J］.中國釀造，2010，29（7）：163-165.

［2］倪宗耀.食用菌的食療作用與保健療效［J］.食藥用菌，2013，21（1）：22-25.

［3］何晉浙，邵平，倪惠東，等.靈芝多糖結(jié)構(gòu)及其組成研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2010，30（1）：123-127.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：188.

［5］周連玉，劉明月，夏志蘭，等.靈芝發(fā)酵液體種子培養(yǎng)條件研究［J］.食用菌學(xué)報，2005，12（4）：33-39.

［6］邱海龍，陳建偉，李祥，等.4種藥用真菌發(fā)酵對番荔枝種子總內(nèi)酯成分的影響［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18（4）：135-138.

［7］劉思妤，王艷，何蓉蓉，等.靈芝的化學(xué)成分［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2008，25（3）：183-193.

［8］王偉.HPLC-ELSD法測定5種食用菌中agaricoglyceride A的含量［J］.中南藥學(xué)，2015，13（7）：757-759.

［9］高玉榮，盧艷明.靈芝菌絲液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基的研究［J］.中國釀造，2006，25（1）：18-20.

［10］朱強，夏艷秋，董克克，等.響應(yīng)面法優(yōu)化靈芝藥性固體發(fā)酵培養(yǎng)基［J］.中國生物工程雜志，2010，30（9）：75-79.

［11］荊留萍，杜雙田，金凌云，等.8種物質(zhì)對蛹蟲草液體發(fā)酵中蟲草素及多糖含量的影響［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報，2010，38（11）：156-160.

［12］文庭池，雷幫星，康冀川，等.添加前體促進(jìn)蛹蟲草發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體和蟲草菌素的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（8）：49-53.

［13］陳麗艷，楊曉旭，曹思思.靈芝菌發(fā)酵基質(zhì)的條件優(yōu)化及菌質(zhì)活性物質(zhì)的分析［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（8）：106-109.

［14］YU H T，HAN C C，SUN Y，et al.The Agaricoglyceride of royal sun medicinal mushroom，agaricus brasiliensis（higher basidiomycetes）is anti-inflammatory and reverses diabetic glycemia in the liver of mice［J］. Int J Med Mushroom，2013，15（4）：357-364.

［15］STADLER M，HELLWIG V，MAYER-BARTSCHMID A，et al.Novel analgesic triglycerides from cultures ofAgaricus macrosporesand other Basidiomycetesas selective inhibitors of neurolysin［J］.J Antibiot，2005，58（12）：775-786.

Screening of Agaricoglyceride A precursor inGanoderma lucidumliquid-state fermentation mycelium

LIU Yi，F(xiàn)ENG Kunmiao，DI Zhibiao，ZHANG Panpan，HAN Chunchao，GU Zhengwei*
（School of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China）

On the basis of single factor experiment，the precursor of Agaricoglyceride A（dichloride anisic acid，methanol，glycerin）was added and the precursor addition was optimized inGanoderma lucidumliquid-state fermentation mycelium.Agaricoglyceride A content was detected by HPLCELSD.As a result，dichloride anisic acid 75 mg/L，methanol 1.5 ml/L and glycerin 1.5 ml/L was the optimal addition.The actual value of Agaricoglyceride A was 21.09 mg/L，which was increased by 25.31%compared with the one without any precursor addition.

Ganoderma lucidum；fermentation；precursor；Agaricoglyceride A；RSM

TQ920.6

0254-5071（2016）07-0045-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.010

2016-01-31

山東省重點研發(fā)計劃（520864）

劉藝（1992-），女，碩士研究生，主要從事中藥活性物質(zhì)與新劑型研究工作。

顧正位（1979-），男，講師，本科，主要從事中藥活性物質(zhì)與新劑型研究工作。