閆靜芳，張麗娟，顏智勇，王龍剛，武奔月，張生生，王昱灃，*（.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京0095；.江蘇聯(lián)益生物科技有限公司，江蘇盱眙700）

白鰱魚頭蛋白酶解工藝研究

閆靜芳1，張麗娟1，顏智勇2，王龍剛2，武奔月1，張生生1，王昱灃1，*
（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095；2.江蘇聯(lián)益生物科技有限公司，江蘇盱眙211700）

以白鰱魚下腳料中最為重要的魚頭為原料，以水解液中氨基氮含量為指標(biāo)，比較了木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶5種酶的水解效果，從中選出最佳水解酶，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)其水解工藝進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，并對(duì)其水解產(chǎn)物中游離氨基酸組成進(jìn)行分析。結(jié)果表明：胰蛋白酶對(duì)魚頭蛋白的水解效果最佳，最佳工藝條件為水解溫度55℃，pH8.0，料水比1∶3（g/mL），加酶量80 U/g，在此條件下水解液中游離氨基氮含量為63.69 mg，水解液中游離氨基酸含量較高。

白鰱魚頭，酶解，氨基氮，氨基酸

低值水產(chǎn)蛋白質(zhì)主要包括低值魚及水產(chǎn)加工副產(chǎn)物，這類原料鮮銷價(jià)值較低，但因其加工復(fù)雜，目前主要的加工方法是加工成魚粉或直接作為飼料。我國水域遼闊，淡水魚資源豐富，占我國漁業(yè)產(chǎn)量的40%以上［1］，然而數(shù)據(jù)顯示我國淡水魚的加工率僅為14.1%［2］，而下腳料的加工產(chǎn)業(yè)更是少見，因此，積極開展淡水魚特別是低值水產(chǎn)蛋白的深加工勢在必行。

自1946年聯(lián)合國糧農(nóng)組織（VAO）倡導(dǎo)開發(fā)未利用或低利用的漁業(yè)資源以來，世界各國己開展了大量的魚類加工方面的研究［3］，而魚類蛋白質(zhì)的酶水解是一個(gè)非常重要的利用方式。魚蛋白質(zhì)經(jīng)酶作用降解，功能和品質(zhì)都得到提高［4］。國外對(duì)魚蛋白水解的利用主要針對(duì)近海魚，這與當(dāng)?shù)氐馁Y源和條件有關(guān)［5-7］，目前，日本、西歐和美國己有此方面的產(chǎn)品問世，許多新產(chǎn)品也正在研制開發(fā)中。與國外相比，國內(nèi)關(guān)于魚蛋白水解技術(shù)尤其是下腳料深加工方面的研究相對(duì)滯后，以魚蛋白水解物為基料的醫(yī)藥品和食品幾乎沒有［8］。導(dǎo)致大量的淡水魚資源得不到充分利用。

鰱魚是四大家魚之一，也是一種產(chǎn)量很大的淡水魚，其營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，但食用價(jià)值較低，加工下腳料利用率低［9-10］，不僅造成了資源的浪費(fèi)，還會(huì)導(dǎo)致環(huán)境污染，而鰱魚頭作為下腳料中最重要的一部分，占魚體總重的24%～34%，含有蛋白質(zhì)、脂肪、鈣、鐵、磷等多種營養(yǎng)成分，具有較高的利用價(jià)值。本文研究了鰱魚頭蛋白的酶解技術(shù)，并對(duì)其水解產(chǎn)物進(jìn)行氨基酸分析，不僅為鰱魚下腳料的深加工及高值化利用提供了理論依據(jù)，更可以減少資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鰱魚頭 童衛(wèi)路菜市場；木瓜蛋白酶（65萬U/g）、胰蛋白酶（4000 U/g）、中性蛋白酶（20萬U/g）、堿性蛋白酶（20 U/g）、風(fēng)味蛋白酶（20萬U/g） 廣西南寧龐博生物有限公司；NaOH、HCl、甲醛等均為分析純 南京試劑有限公司。

JYL-Y3九陽營養(yǎng)破壁調(diào)理機(jī) 九陽股份有限公司；CP124C先行者精密電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TDZ5-WS離心機(jī) 長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；MS-H280-Pro LED數(shù)顯加熱型磁力攪拌器 上海漢林實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚頭蛋白水解液的制備 將鰱魚頭洗凈后放入JYL-Y3九陽營養(yǎng)破壁調(diào)理機(jī)打漿，分別取15 g魚漿于100 mL錐形瓶中，加入一定比例的蒸餾水，調(diào)節(jié)pH，在設(shè)定水解溫度下保溫15 min，待水解魚漿達(dá)到水解溫度，加入蛋白酶水解，水解結(jié)束后沸水浴滅酶10 min，冷卻后于5000 r/min離心15 min，取上清液即為蛋白水解液。

1.2.2 蛋白酶的選擇 分別以木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶為水解酶，由于單位質(zhì)量的5種蛋白酶價(jià)格相近，因此在酶的選擇中，從生產(chǎn)成本角度考慮，選擇酶用量均為0.08 g，料水比為1∶2（g/mL）。

不同種類蛋白酶的最適反應(yīng)條件不同，選用木瓜蛋白酶［11］的水解溫度為55℃，pH為6.5；胰蛋白酶［12］的水解溫度為50℃，pH為7.5；風(fēng)味蛋白酶［13］的水解溫度為50℃，pH為7.0；中性蛋白酶［14-15］的水解溫度為55℃，pH為7.5；堿性蛋白酶［16］的水解溫度為50℃，pH為8.0，分別水解1、2、3、4、6 h，以水解液中游離氨基氮含量為指標(biāo)，篩選出最佳蛋白酶。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以最佳蛋白酶為水解酶，稱取15 g魚頭漿，選取料水比、水解溫度、pH、加酶量四因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，固定水解時(shí)間3 h，測定水解液中氨基氮含量。

1.2.3.1 加酶量的確定 固定溫度50℃，pH7.5，料水比1∶2，加酶量分別為10、20、40、60、80 U/g。

1.2.3.2 料水比的確定 固定溫度50℃，pH7.5，加酶量0.08 g，設(shè)定料水比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5。

1.2.3.3 反應(yīng)溫度的確定 固定料水比1∶2，pH7.5，加酶量0.08 g，設(shè)定溫度分別為40、45、50、55、60℃。

1.2.3.4 水解pH的確定 固定溫度50℃，料水比1∶2，加酶量0.08 g，設(shè)定pH分別為5、6、7、8、9。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定正交實(shí)驗(yàn)參數(shù)范圍，以水解液中游離氨基酸含量為指標(biāo)，對(duì)加酶量、料水比、水解溫度、pH進(jìn)行L9（34）正交優(yōu)化，因素水平見表1，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.5 游離氨基氮含量測定 精確量取水解液5 mL，加入60 mL蒸餾水稀釋，采用甲醛滴定法［17］測定水解液中氨基氮含量。因氨基酸分析儀成本較高，在蛋白酶選擇和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中無需測定氨基酸種類，甲醛滴定法即可滿足測量需求，且測量簡單快速，因此，采用甲醛滴定法測定游離氨基氮含量。

表1 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels of L9（34）orthogonal test

1.2.6 酶解液中游離氨基酸分析 在最佳條件下分別水解鰱魚頭蛋白2、4、6、9、12、15 h，得到不同時(shí)間的水解液，分別取不同水解時(shí)間的水解液2 μL，用超純水稀釋500倍，0.45 μm親水濾膜過濾，采用全自動(dòng)氨基酸分析儀測定水解液中游離氨基酸的種類及含量。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法 文中所有數(shù)據(jù)均取三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，采用Origin 8.0軟件作圖，SAS軟件進(jìn)行顯著性分析，顯著水平p＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的選擇

由于不同蛋白酶的水解位點(diǎn)不同，產(chǎn)物分子量、功能特性及氨基氮含量等都存在明顯差異，選擇合適的蛋白酶對(duì)提高水解效率具有重要意義。實(shí)驗(yàn)采用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶，分別在較適條件下進(jìn)行水解，測定不同時(shí)間游離氨基氮含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 最佳水解酶的選擇Fig.1 The select of the best hydrolysis enzyme

從圖1中可以看出，隨著水解時(shí)間的延長，水解液中游離氨基氮含量呈明顯的上升趨勢，其中，胰酶的水解效果最好，水解1～6 h水解液中游離氨基氮含量由19.34 mg增至27.45 mg，而其余4種酶水解效果差異不顯著。水解效果最差的為木瓜蛋白酶，當(dāng)水解時(shí)間從1 h延長至6 h，水解液中氨基氮含量僅從13.98 mg增至21.80 mg。因此，實(shí)驗(yàn)選擇胰蛋白酶進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 加酶量對(duì)水解效果的影響 如圖2所示，隨著酶用量的增加，水解液中氨基氮含量不斷增加，但超過40 U/g時(shí)，水解效果變化并不顯著。這是因?yàn)椋诿复俜磻?yīng)中，當(dāng)有充足的底物存在時(shí)，酶促反應(yīng)速率隨酶濃度增加而加快［18］；但當(dāng)酶濃度超過一定水平，由于底物被酶飽和，沒有多余的底物與之結(jié)合，酶促反應(yīng)速率便不再增加，此時(shí)，加酶量的增加不僅不會(huì)使反應(yīng)速率加快，反而造成了酶的浪費(fèi)，使成本增加。因此，實(shí)驗(yàn)選取40、60、80 U/g為正交實(shí)驗(yàn)中考察酶用量的水平。

圖2 酶用量對(duì)水解效果的影響Fig.2 The effect of enzyme concentration for hydrolysis

2.2.2 料水比對(duì)水解效果的影響 料水比的大小影響酶與底物的結(jié)合程度［19］，料水比過低，酶與底物分布不均勻，降低了酶與底物的結(jié)合程度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出，當(dāng)料水比從1∶1增加到1∶3時(shí)，水解液中游離氨基氮含量明顯增加，超過1∶3后水解效果差異并不顯著，且當(dāng)料水比為1∶4時(shí)氨基氮含量達(dá)到最大值24.85 mg。因此，實(shí)驗(yàn)選擇1∶3、1∶4、1∶5作為正交實(shí)驗(yàn)中考察料水比的三個(gè)水平。

圖3 料水比對(duì)水解效果的影響Fig.3 The effect of the ratio of water to materials for hydrolysis

2.2.3 水解溫度對(duì)水解效果的影響 溫度對(duì)酶促反應(yīng)具有較大影響，每種酶促反應(yīng)都有一個(gè)最適溫度。由圖4可知，40～50℃時(shí)隨著溫度的增長，水解液中氨基氮含量呈增加的趨勢，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)達(dá)到最大值27.53 mg，繼續(xù)增加溫度，水解液中氨基氮含量開始降低，但經(jīng)顯著性分析得出，溫度為45、50、55℃時(shí)，氨基氮含量差異并不顯著。因此，實(shí)驗(yàn)選擇45、50、55℃為正交實(shí)驗(yàn)中溫度的三個(gè)水平。

圖4 水解溫度對(duì)水解效果的影響Fig.4 The effect of hydrolysis temperature for hydrolysis

溫度的改變不僅影響胰蛋白酶的穩(wěn)定性，還會(huì)影響胰蛋白酶酶促反應(yīng)中的締合解離平衡、酶-底物絡(luò)合物的締合解離以及底物溶解度等。當(dāng)溫度較低時(shí)，和普通化學(xué)反應(yīng)一樣，升高溫度可加快反應(yīng)速率，因此，隨著溫度升高，胰蛋白酶的水解效率升高，游離氨基酸含量不斷增大，但酶本身是一種蛋白質(zhì)，在高溫下其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致變性失活，酶促反應(yīng)效率降低，水解液中氨基酸含量開始降低，且溫度越高酶的變性程度越大，導(dǎo)致55℃后氨基酸含量迅速降低。酶的最適溫度并不是一個(gè)固定值，底物濃度、離子強(qiáng)度、反應(yīng)時(shí)間以及pH等均會(huì)影響胰蛋白酶促反應(yīng)的最適溫度［20］。

2.2.4 pH對(duì)水解效果的影響 當(dāng)pH改變時(shí)，水解液中氨基氮含量變化如圖5所示。從圖5中可知，當(dāng)pH＜8時(shí)，水解液中氨基氮含量隨pH的增大明顯增加，并在pH8.0時(shí)達(dá)到最大值26.27 mg；但當(dāng)pH繼續(xù)增大時(shí)，水解液中氨基氮含量顯著降低。由于實(shí)驗(yàn)所用胰酶對(duì)pH較為敏感，為了精確考察水解的最佳pH，實(shí)驗(yàn)選擇了7.5、8.0、8.5為正交實(shí)驗(yàn)中考察pH的水平范圍。

圖5 pH對(duì)水解效果的影響Fig.5 The effect of pH for hydrolysis

pH對(duì)酶活性的影響主要表現(xiàn)在兩方面：pH變化改變了底物分子和酶分子的帶電狀態(tài)，從而影響底物和酶的結(jié)合；過高或過低的pH都會(huì)影響酶分子的穩(wěn)定性，進(jìn)而導(dǎo)致其變性失活。一般情況下，胰蛋白酶最適pH為7，此時(shí)水解效率最高，高于或低于此pH時(shí)，酶分子與底物結(jié)合能力減弱，穩(wěn)定性降低，導(dǎo)致水解液中氨基酸含量顯著降低。但酶的最適pH受多種因素影響，如酶的來源、純度、底物種類、反應(yīng)體系中的鹽類、反應(yīng)溫度等［21］。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由k值可得水解條件的最佳組合為A3B2C1D3，即水解溫度55℃，pH8.0，料水比1∶3，加酶量80 U/g。各因素對(duì)酶解效果的影響順序?yàn)椋篋＞A＞B＞C，即加酶量＞溫度＞pH＞料水比，恰為正交實(shí)驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)8。三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，此時(shí)的含量為（63.69±0.5143）mg。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Combinations and results of orthogonal test

2.4 水解液中游離氨基酸分析

在蛋白質(zhì)酶解過程中，不同程度的酶解產(chǎn)物含有的氨基酸種類及含量有很大差異，這在美拉德反應(yīng)生產(chǎn)香味物質(zhì)中具有較大影響。表3為不同水解時(shí)間的水解液中氨基酸組成分析。

從表3結(jié)果中可看出，鰱魚頭蛋白水解液中的氨基酸含量較高，種類較為齊全，且包含了除色氨酸外的所有必需氨基酸，具有很高的應(yīng)用價(jià)值?？傮w來看，隨著酶解時(shí)間的延長，氨基酸總量呈增長的趨勢，且在2～9 h增長較快，之后變化不大，甚至出現(xiàn)了下降的趨勢，這可能是由于合成了類蛋白的緣故。在魚頭水解液中，含量較高的氨基酸有亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸等，但半胱氨酸和脯氨酸的含量較低，其中，半胱氨酸在美拉德反應(yīng)中可合成肉類香味化合物的中間體，對(duì)于肉味的產(chǎn)生極為重要，而脯氨酸可形成烤香味［22］，因此，在以該水解液為原料生產(chǎn)香味物質(zhì)過程中，應(yīng)根據(jù)實(shí)際需要添加合適的氨基酸化合物，以提高水解液的利用程度，節(jié)約成本，減少浪費(fèi)。

3 結(jié)論

比較了木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶5種酶的水解白鰱魚頭的效果，得到胰蛋白酶為最適水解酶，并通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)確定最佳酶解工藝條件為：水解溫度55℃，pH8.0，料水比1∶3，加酶量80 U/g，在此條件下水解液中游離氨基氮含量為（63.69±0.5143）mg，經(jīng)檢測，水解液中氨基酸含量較高，種類齊全。

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Enzymatic hydrolysis process of silver carp head

YAN Jing-fang1，ZHANG Li-juan1，YAN Zhi-yong2，WANG Long-gang2，WU Ben-yue1，ZHANG Sheng-sheng1，WANG Yu-feng1，*
（1.College of Food Science and Technology，Nanjing Angricultural Univeisity，Nanjing 210095，China；2.Jiangsu Lian Yi Biotechnology Limited Company，Xuyi 211700，China）

In this paper，the head of silver carp，the most important part of fish byproducts were taken as raw materials.The hydrolysis effects of papain，trypsin，flavourzyme，neutral protease and alkali protease were compared and selected，with the content of amino nitrogen in the hydrolysate as an index.The hydrolysis process was optimized by orthogonal tests on the basis of single factor，and the composition of free amino acid in hydrolysate was analyzed.The results showed that trypsin could be selected as the best hydrolysis enzyme，and the maximal content of amino nitrogen in hydrolysate reached 63.69 mg with the following conditions：hydrolysis temperature of 55℃，pH8.0，the ratio of water to materials 1∶3，enzyme concentration 80 U/g，and the content of free amino acid in hydrolysate was higher.

silver carp head；enzymatic hydrolysis；amino nitrogen；amino acid

TS254.5

A

1002-0306（2016）06-0221-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.037

2015－07－17

閆靜芳（1990-），女，在讀碩士研究生，主要從事食品工程方面的研究，E-mail：2014808102@njau.edu.cn。

王昱灃（1976-），男，博士，副教授，主要從事生物工程和食品科學(xué)方面的研究，E-mail：Joywangyu@sina.com。

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生工作站和江蘇省研究生工作站（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)-江蘇聯(lián)益生物科技有限公司）項(xiàng)目；江蘇省科技項(xiàng)目蘇北科技專項(xiàng)（BN2015071）。