田淑芬，路鳳珍，2，溫曉敏，2，張娜，陳三春，2（. 天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究中心/天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 30092；2. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

外源添加物對(duì)無(wú)核葡萄胚挽救及胚珠發(fā)育的影響

田淑芬1，路鳳珍1，2，溫曉敏1，2，張娜1，陳三春1，2
（1. 天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究中心/天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192；2. 天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387）

為了研究部分外源添加物對(duì)無(wú)核葡萄胚珠發(fā)育及胚培養(yǎng)的影響，以紅寶石無(wú)核×玫瑰香優(yōu)系、希姆勞特×玫瑰香優(yōu)系雜交胚為試材，研究了6-BA不同處理濃度、不同甘氨酸濃度和不同活性炭用量對(duì)胚珠生長(zhǎng)發(fā)育的影響。結(jié)果表明，0.5 mg/L 6-BA濃度處理的紅寶石無(wú)核×玫瑰香優(yōu)系胚發(fā)育率最高，為15.89%；紅寶石無(wú)核×玫瑰香優(yōu)系最適甘氨酸濃度為4.00 mmol/L，胚發(fā)育率13.33%，1.00 mmol/L甘氨酸濃度處理對(duì)希姆勞特×玫瑰香優(yōu)系雜交胚發(fā)育率最高，為17.33%；兩組合最適活性炭濃度為1.0 g/L。

無(wú)核葡萄；6-BA；甘氨酸；活性炭；胚挽救

近年來(lái)，世界鮮食葡萄育種目標(biāo)趨于大粒、無(wú)核、優(yōu)質(zhì)、香氣、抗病。無(wú)核葡萄以其食用方便，且在鮮食和制干方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，一直以來(lái)備受消費(fèi)者的喜愛。無(wú)核品種的主要育種方法為有性雜交育種，傳統(tǒng)雜交育種只能以有核品種為母本無(wú)核品種為父本，后代無(wú)核率低且選育一個(gè)無(wú)核品種所需的時(shí)間較長(zhǎng)（10～20年），隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)胚挽救技術(shù)獲得無(wú)核葡萄新品種的方法被眾多育種者［1-6］所采用。胚挽救及輔助育種技術(shù)的廣泛應(yīng)用，大大加快了培育優(yōu)質(zhì)無(wú)核葡萄的育種進(jìn)度。在無(wú)核葡萄胚挽救中，胚珠發(fā)育培養(yǎng)基組分是影響胚挽救效率的關(guān)鍵因素，唐冬梅等［7］研究發(fā)現(xiàn)，在Nitsch基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加6-BA能顯著提高雜交胚的萌發(fā)率。陶建敏等［8］利用5 mg/L與10 mg/L兩個(gè)濃度的6-BA，在花前兩周對(duì)火星無(wú)核進(jìn)行處理，得到的有胚種子率大于60%。郭修武等［9］在MS、ER、改良Nitsch、White培養(yǎng)基中分別添加6-BA均能提高胚挽救效率。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上探索細(xì)胞分裂素6-BA濃度、不同甘氨酸濃度和不同活性炭濃度對(duì)紅寶石無(wú)核×玫瑰香優(yōu)系、希姆勞特×玫瑰香優(yōu)系2個(gè)雜交組合胚珠生長(zhǎng)發(fā)育的影響，旨在確定適宜無(wú)核葡萄紅寶石無(wú)核和希姆勞特為母本的胚挽救幼胚離體培養(yǎng)體系。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2015年5月至2016年5月在天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄研究中心武清試驗(yàn)基地、天津市葡萄遺傳與育種企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試母本為紅寶石無(wú)核和希姆勞特，其中紅寶石無(wú)核是從皇帝×Pirovan075雜交后代選育出的晚熟無(wú)核品種。供試父本為玫瑰香優(yōu)系，是由天津農(nóng)科院葡萄研究中心采用生物分子標(biāo)記技術(shù)與田間營(yíng)養(yǎng)系混合選種方法相結(jié)合對(duì)茶淀玫瑰香葡萄提純復(fù)壯，篩選出的玫瑰香優(yōu)系葡萄。親本特性見表1。

表1　 雜交親本特性

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1田間雜交及幼果采集

紅寶石無(wú)核×玫瑰香優(yōu)系、希姆勞特×玫瑰香優(yōu)系雜交組合參照王愛玲等［10］的方法進(jìn)行。

上述兩組合分別在授粉后29 d、25 d開始取樣。將采集的幼果帶回實(shí)驗(yàn)室，剪去果柄，用自來(lái)水沖洗干凈后放入超凈工作臺(tái)消毒：先用70%酒精沖洗一次，用無(wú)菌水沖洗3次，放入次氯酸鈉中浸泡3 min，再用無(wú)菌水沖洗3次。用解剖刀切開漿果，取出胚珠，將其接種到發(fā)育培養(yǎng)基中進(jìn)行胚珠發(fā)育培養(yǎng)。

1.2.2試驗(yàn)處理

試驗(yàn)選取兩組合的雜交胚珠為試材，每個(gè)處理重復(fù)3次。接種30 d后調(diào)查胚珠發(fā)育率，然后進(jìn)行剝胚處理，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)胚萌發(fā)率。

胚珠發(fā)育培養(yǎng)基：Nitsch+1.5 mol/L IAA+0.5 mol/L GA3+60 g/L蔗糖+5 g/L瓊脂。

（1）胚珠發(fā)育基中添加不同濃度6-BA。以紅寶石無(wú)核×玫瑰香優(yōu)系雜交胚珠為試驗(yàn)材料，發(fā)育培養(yǎng)基分別添加0.2 mg/L、0.5 mg/L、0.8 mg/L、1.0 mg/L濃度的6-BA，空白試驗(yàn)為CK。

（2）不同甘氨酸濃度。以紅寶石無(wú)核×玫瑰香優(yōu)系、希姆勞特×玫瑰香優(yōu)系雜交胚珠為試材，在胚珠發(fā)育階段，甘氨酸濃度設(shè)定為：1.0 mmol/L、2.0 mmol/L、4.0mmol/L、6.0 mmol/L和CK共5個(gè)處理。

（3）不同活性炭濃度。以參試兩組合的雜交胚珠為試材，在發(fā)育基本培養(yǎng)基上，分別添加0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L濃度的活性炭。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析（P＜0.05）。

胚發(fā)育率/%=（發(fā)育胚數(shù)/接種胚珠數(shù)）×100

2　結(jié)果與分析

2.1不同濃度6-BA對(duì)雜交胚珠發(fā)育率的影響

在發(fā)育培養(yǎng)基中添加不同濃度的6-BA，對(duì)紅寶石無(wú)核×玫瑰香優(yōu)系胚珠發(fā)育率的影響不同（表2）。添加6-BA試驗(yàn)組的發(fā)育率均高于對(duì)照組，說(shuō)明6-BA對(duì)胚珠發(fā)育具有促進(jìn)作用。如表2所示，添加0.5 mg/L 6-BA的胚發(fā)育率可達(dá)到15.89%，顯著高于其他試驗(yàn)組，說(shuō)明在發(fā)育培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加0.5 mg/L 6-BA適用于紅寶石無(wú)核×玫瑰香優(yōu)系的胚珠發(fā)育。

2.2不同甘氨酸濃度對(duì)雜交胚珠發(fā)育率的影響

添加不同濃度甘氨酸的胚發(fā)育培養(yǎng)基，對(duì)量組合胚挽救效率的影響不同（表3）。結(jié)果表明：添加甘氨酸能顯著提高胚珠發(fā)育率，紅寶石無(wú)核×玫瑰香優(yōu)系在4.00 mmol/L水平上，胚的發(fā)育率可達(dá)13.33%，顯著高于其他處理組。希姆勞特×玫瑰香優(yōu)系在1.00 mmol/L、2.00 mmol/L水平上胚的發(fā)育率顯著，分別為17.27%、17.33%。說(shuō)明添加甘氨酸能顯著提高胚珠發(fā)育率，不同雜交組合適宜的甘氨酸濃度不同。

表2　6-BA對(duì)紅寶石無(wú)核×玫瑰香雜交胚珠發(fā)育率的影響

表3　不同甘氨酸濃度對(duì)雜交胚珠發(fā)育率的影響

2.3不同活性炭濃度對(duì)胚珠發(fā)育生長(zhǎng)的影響

不同濃度的活性炭處理對(duì)胚珠發(fā)育的影響不同（表4）。結(jié)果表明：添加活性炭可以顯著提高胚的發(fā)育率，不添加的僅為5.56%。添加活性炭的最佳濃度為1.0 g/L，兩組合雜種胚珠的發(fā)育率均最高，分別為17.33%、15.69%，這說(shuō)明添加1.0 g/L活性炭對(duì)胚的生長(zhǎng)發(fā)育有明顯促進(jìn)作用。

表4　不同活性炭濃度對(duì)胚珠發(fā)育生長(zhǎng)的影響

3　討論與結(jié)論

適宜的外源激素的種類及適當(dāng)?shù)呐浔葘?duì)胚珠和胚的培養(yǎng)效果有著重要影響。對(duì)激素的敏感程度會(huì)隨著葡萄的品種變化和胚的發(fā)育程度的變化而呈現(xiàn)顯著差異。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，培養(yǎng)基中附加合適的外源激素對(duì)胚的發(fā)育有促進(jìn)作用。唐冬梅［11］的研究認(rèn)為添加0.2 mg/L 6-BA比不加6-BA的無(wú)核葡萄胚挽救成功率高，郭印山等［12-13］認(rèn)為，幼胚的發(fā)育可能需要相對(duì)較低濃度的6-BA，采用White培養(yǎng)基+2.0 mg/L IBA+0.9 mg/L 6-BA+0.7 mg/L GA3培養(yǎng)87-1×京秀，成苗率高達(dá)95.08%。劉佳［14］研究表明，金星無(wú)核葡萄胚發(fā)育階段適宜的6-BA濃度是1.0 mg/L。劉巧等［15］研究不同6-BA濃度對(duì)抗寒無(wú)核葡萄的影響，認(rèn)為添加低濃度水平的6-BA有助于促進(jìn)胚發(fā)育、萌發(fā)和成苗，且不同雜交組合對(duì)6-BA的敏感程度不同。本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，紅寶石無(wú)核×玫瑰香優(yōu)系最適6-BA濃度為0.5mg/L，胚發(fā)育率可達(dá)到15.89%，顯著高于其他試驗(yàn)組。

氨基酸是胚形成和發(fā)育必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。不同種類的氨基酸對(duì)胚發(fā)育的影響不同，一般認(rèn)為，半胱氨酸（Cys）、絲氨酸（Ser）、谷氨酞胺（Gln）、天冬酞胺（Asn）、甘氨酸（Gly）能夠促進(jìn)葡萄胚珠內(nèi)胚的發(fā)育。10 mmol/L甘氨酸有利于幼胚的發(fā)育和成苗［16］，田莉莉［17］研究發(fā)現(xiàn)，甘氨酸對(duì)底來(lái)特×北醇和愛莫無(wú)核×北醇胚發(fā)育和成苗都有促進(jìn)作用。本研究結(jié)果表明，雜交組合不同，最佳甘氨酸濃度也不相同，紅寶石無(wú)核×玫瑰香優(yōu)系最適濃度為4.00 mmol/L，胚發(fā)育率13.33%，1.00 mmol/L甘氨酸濃度處理對(duì)希姆勞特×玫瑰香優(yōu)系雜交胚發(fā)育率最高，為17.33%，2.00 mmol/L水平上胚發(fā)育率次之。

活性炭可通過(guò)吸附發(fā)生作用，對(duì)大多植物的幼胚培養(yǎng)都有明顯的促進(jìn)作用［18］。胚珠中含有酚類物質(zhì)，在培養(yǎng)過(guò)程中易發(fā)生氧化作用而導(dǎo)致胚珠褐化。在培養(yǎng)基中加入一定量的活性炭可吸附有害物質(zhì)，防止胚珠褐化［19］，但是活性炭的吸附作用屬非選擇性吸附，其在吸附有害物質(zhì)的同時(shí)也會(huì)吸附營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以需要控制活性炭的濃度。田莉莉［17］研究發(fā)現(xiàn)，添加1.5 g/L的活性炭，有利于提高胚的發(fā)育率和成苗率。夏培培等［20］研究了活性炭對(duì)木納格葡萄胚挽救的影響，結(jié)果表明，隨著活性炭濃度的增加，胚萌發(fā)率為先增后減趨勢(shì)，濃度為0.5 g/L時(shí)，萌發(fā)率達(dá)到最高。在本試驗(yàn)中添加適宜濃度的活性炭（1.0 g/L）可以顯著提高胚的發(fā)育率，濃度過(guò)高會(huì)吸附營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，胚發(fā)育率降低。

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Effect of exogenous additives on embryo rescue and development of ovules of seedless grape

TIAN Shufen1，LU Fengzhen1，2，WEN Xiaomin1，2，ZHANG Na1，CHEN Sanchun1，2
（1. Grape Research Center， Tianjin Academy of Agricultural Sciences/Tianjin enterprise Key Laboratory of grape genetics and breeding， Tianjin 300192， China； 2. College of life science， Tianjin Normal University， Tianjin 300387， China）

The young ovules from Ruby Seedless×Muscat Hamburg， Himrod×Muscat Hamburg were taken as experimental materials， to investigate the effects of exogenous additives （6-BA， glycine and activated carbon）on ovule and embryo development of seedless grape. The results showed that the concentration of 0.5 mg/L 6-BA treatment gained the highest embryo development rate from Ruby Seedless×Muscat Hamburg， which was 15.89%；4.00 mmol/L glycine was the optimum concentrations for Ruby Seedless×Muscat Hamburg and 1.00 mmol/L glycine concentration was the best for Himrod ×Muscat Hamburg， the embryo development rate were 13.33% and 17.33%， respectively. The optimum concentration of activated carbon was 1.0 g/L for two combinations.

seedless grapes； 6-BA； glycine； activated carbon； embryo rescue

S663.1

A

10.13414/j.cnki.zwpp.2016.05.006

2016-08-02

天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長(zhǎng)基金（15010）

田淑芬（1966-），女，博士，研究員，主要從事葡萄栽培與選育種方面的研究。E-mail： tianshufen@263.net