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肽組學(xué)在食源性活性肽研究中應(yīng)用的進(jìn)展

2016-09-14 04:02于志鵬薛如陽趙文竹張宏陽勵建榮劉靜波渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心遼寧錦州203吉林大學(xué)營養(yǎng)與功能食品研究室吉林長春30062
食品工業(yè)科技 2016年4期
關(guān)鍵詞:食源性組學(xué)蛋白酶

于志鵬,薛如陽,趙文竹,*,張宏陽,吳 雨,張 霜,勵建榮,劉靜波(.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州203;2.吉林大學(xué)營養(yǎng)與功能食品研究室,吉林長春30062)

肽組學(xué)在食源性活性肽研究中應(yīng)用的進(jìn)展

于志鵬1,薛如陽1,趙文竹1,*,張宏陽1,吳雨1,張霜1,勵建榮1,劉靜波2,*(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,
遼寧錦州121013;
2.吉林大學(xué)營養(yǎng)與功能食品研究室,吉林長春130062)

肽組學(xué)作為食品科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域一個新興的重要研究方法,正逐漸應(yīng)用到生物活性肽制備、純化、結(jié)構(gòu)鑒定以及構(gòu)效關(guān)系研究中,涉及活性肽的定性與定量的各個方面的內(nèi)容。本文綜述了肽組學(xué)在食源性活性肽制備工藝優(yōu)化、特定功能活性的活性肽篩選、活性肽與受體的作用機制以及構(gòu)效關(guān)系等研究的國內(nèi)外進(jìn)展,以期為肽組學(xué)在活性肽中廣泛深入地應(yīng)用提供參考。

活性肽,肽組學(xué),純化,結(jié)構(gòu)表征,構(gòu)效關(guān)系

活性肽是一類易于機體吸收并具多種生物活性的物質(zhì),其主要來源于動植物蛋白水解[1-4]或微生物發(fā)酵[5-6],并可被進(jìn)一步化學(xué)修飾。食源性活性肽以其安全無副作用等優(yōu)點,吸引了越來越多的食品科學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)及其交叉領(lǐng)域研究人員的研究興趣[7-8],并已被應(yīng)用于食品和保健品行業(yè)。目前對于食源性活性肽的研究主要集中在酶解制備、純化和結(jié)構(gòu)鑒定方面:對于制備方法多采用外源蛋白酶進(jìn)行酶解[9-10],通過優(yōu)化設(shè)計等手段獲得最優(yōu)酶解條件。近年來對于利用內(nèi)源性蛋白酶進(jìn)行酶解制備活性肽的研究逐漸興起,利用內(nèi)源性蛋白酶和外源性蛋白酶協(xié)同酶解制備活性肽的研究也有報道[9-12],但對于內(nèi)源性和外源性酶解所制備的活性肽的生理活性的差異對比研究鮮有報道;對于食源性活性肽的純化與結(jié)構(gòu)鑒定,主要通過膜過濾、色譜過濾進(jìn)行逐級純化,多維色譜純化手段的應(yīng)用顯著提高了活性肽的純化效率[13-15]。多維色譜純化為獲得高純度的單一肽組分及結(jié)構(gòu)鑒定發(fā)揮了重要作用,但是由于食源性蛋白酶解產(chǎn)物組分復(fù)雜,含有成百甚至上千條肽段,而且分子量相近或電荷相等的肽段難以進(jìn)行分離純化,給后續(xù)的結(jié)構(gòu)鑒定帶來了巨大的難題。目前肽結(jié)構(gòu)鑒定的方法主要為質(zhì)譜法和化學(xué)法,提供單一肽的純化組分是結(jié)構(gòu)鑒定的前提[16-20]。采用逐級分離純化輔以活性跟蹤手段經(jīng)過多次分離純化和富集獲得單一肽組分最后進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定的傳統(tǒng)經(jīng)典研究路線,一方面工作量大、阻礙了活性肽研究的快速發(fā)展;更重要的是活性跟蹤純化過程中不可避免的將高活性肽序列遺漏,致使最終獲得的活性肽序列僅是最初活性肽復(fù)雜體系中活性相對較高的一部分,造成更高活性的活性肽的丟失,因此目前食源性活性肽的高效純化結(jié)構(gòu)鑒定成為獲得完整的高活性活性肽的研究瓶頸,尋求高通量的生物活性肽結(jié)構(gòu)的快速表征方法有助于推進(jìn)生物活性肽研究的進(jìn)展。本文綜述了肽組學(xué)在活性肽研究中應(yīng)用的進(jìn)展情況。

1 肽組學(xué)

肽組學(xué)(peptidomics)是在蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一個重要分支,是研究低分子量蛋白質(zhì)和活性肽及其變化規(guī)律的科學(xué),是近些年快速發(fā)展的一種可大規(guī)模表征活性肽的技術(shù)[21-24]。目前國際上對于肽組學(xué)的研究對象(即低分子量蛋白和活性肽)的分子量還沒有明確的規(guī)定,多數(shù)分子量低于20 ku。肽組(peptidome)為食品原料、產(chǎn)品以及在儲藏加工過程中存在或產(chǎn)生的所有活性肽的集合。肽組學(xué)研究內(nèi)容主要涉及活性肽及其前體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定、特定功能活性肽的水解條件最優(yōu)化、活性肽結(jié)構(gòu)及其活性的預(yù)測以及定量構(gòu)效關(guān)系等[25-26]。肽組學(xué)研究對象分為兩類:一類為體內(nèi)自身存在的活性肽;另一類為蛋白質(zhì)經(jīng)特殊水解酶產(chǎn)生的酶解產(chǎn)物。因此,肽組學(xué)在食源性活性肽的研究中既可以闡明天然存在的活性肽,又可以表征酶解作用后產(chǎn)生的活性肽結(jié)構(gòu)[25-27]。肽組學(xué)研究過程包括樣品前處理、分離純化、目標(biāo)肽定性、目標(biāo)肽定量和數(shù)據(jù)分析,其中每一個環(huán)節(jié)對于獲得準(zhǔn)確肽信息都起著重要作用。肽組學(xué)在活性肽的結(jié)構(gòu)表征研究中,主要通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)快速高效鑒定新的活性肽的序列,并借鑒肽數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索和構(gòu)效關(guān)系預(yù)測[25-29]。肽組學(xué)這一新技術(shù)在解決活性肽的高效結(jié)構(gòu)表征領(lǐng)域的應(yīng)用有望能夠突破活性肽傳統(tǒng)技術(shù)所面臨的瓶頸問題。借助肽組學(xué)快速、高效的特點,將肽組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于活性肽活性組分的結(jié)構(gòu)表征是活性肽的未來研究發(fā)展方向之一。

2 肽組學(xué)在活性肽制備優(yōu)化中的應(yīng)用

當(dāng)前對于食源性活性肽的制備主要利用生物酶解技術(shù),通過對原料中蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸全序列分析或通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索獲得原料蛋白的結(jié)構(gòu)信息后,通過利用不同性質(zhì)蛋白酶進(jìn)行酶解并跟蹤測定水解度以及目標(biāo)活性,最終確定所用蛋白酶及所對應(yīng)的最優(yōu)酶解制備工藝[28-30]。雖然食源性活性肽的酶解制備技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟,但是在篩選過程中需要花費大量的時間,因此尋找一種更為快捷、周期短且能預(yù)測出裂解片段活性肽的氨基酸序列的方法將實現(xiàn)對目前研究現(xiàn)狀的突破。肽組學(xué)的虛擬酶解數(shù)據(jù)庫在活性肽制備優(yōu)化中可以發(fā)揮更多的作用,在利用虛擬酶解數(shù)據(jù)庫進(jìn)行特定蛋白酶的水解需要首先通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索出原料蛋白的分子量和氨基酸序列,常用到的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫有UniProt database(http://www.uniprot.org/),ExPASy(http://web. expasy.org/)和world wide protein date bank(http://www. wwpdb.org/)等。在獲得原料蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,利用肽組學(xué)技術(shù)根據(jù)所使用的蛋白酶種類分別進(jìn)行虛擬水解,常用的蛋白酶有Arg-C proteinase,Asp-N endopeptidase,Asp-N endopeptidase+N-terminal Glu,Caspase1,Caspase2,Caspase3,Caspase4,Caspase5,Caspase6,Caspase7,Caspase8,Caspase9,Caspase10,Chymotrypsin-high specificity(C-term to[FYW],not before P),Chymotrypsin-low specificity(C-term to [FYWML],not before P),Clostripain(Clostridiopeptidase B),Enterokinase,Glutamyl endopeptidase,GranzymeB,Neutrophil elastase,Pepsin(pH1.3),Pepsin(pH>2),Proline-endopeptidase,Proteinase K,Staphylococcal peptidase I,Tobacco etch virus protease,Thermolysin,Thrombin,Trypsin,這些蛋白酶的選擇可根據(jù)篩選活性肽結(jié)構(gòu)特性而定,既可以選擇一種蛋白酶進(jìn)行水解也可以選擇多種蛋白酶協(xié)同水解。虛擬酶解操作中通過錄入原蛋白序列信息和選擇裂解蛋白酶的種類,便可獲得在此條件下酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)信息。Raus等[30]利用protein cutter在線虛擬酶解軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解,并對所獲得的肽段分子量、等電點、氨基酸組成以及疏水性進(jìn)行了分析。計算機虛擬酶解的運用將有利于大規(guī)模篩選食源性蛋白質(zhì)和特定生物活性肽的前體潛在片段,對于節(jié)省成本和時間發(fā)揮重要作用[31]。

3 肽組學(xué)在活性肽結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用

在過去幾年里,生物活性肽的結(jié)構(gòu)鑒定與表征已發(fā)展成為食源性活性肽研究中新的研究熱點,傳統(tǒng)的生物活性肽結(jié)構(gòu)鑒定的研究思路主要是通過色譜技術(shù)、膜技術(shù)等進(jìn)行逐級純化,并在純化過程中進(jìn)行目標(biāo)活性的測定跟蹤,不斷收集高活性組分后再進(jìn)行純化,直到獲得單一活性肽組分后進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)分析。側(cè)重于研究食品原料中肽的結(jié)構(gòu)組成、相互作用關(guān)系和生物活性的肽組學(xué)技術(shù)在這方面的作用日益突出。高分辨率質(zhì)譜、計算機模擬水解、構(gòu)效關(guān)系模型、化學(xué)計量學(xué)和肽數(shù)據(jù)庫管理(表1)等作為肽組學(xué)的重要部分在食源性活性肽研究中逐漸被廣泛深入地運用[28-29]。這些在線工具的應(yīng)用以及與當(dāng)前高靈敏度的生物質(zhì)譜技術(shù)的有機結(jié)合為活性肽的結(jié)構(gòu)鑒定提供了解決結(jié)構(gòu)鑒定的難題。目前生物質(zhì)譜中的液相色譜-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜以及四級桿線性離子阱質(zhì)譜開始逐漸應(yīng)用到生物活性肽結(jié)構(gòu)分析,并輔以質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析軟件protein pilot極大的縮短了活性肽結(jié)構(gòu)表征的周期[32-36]。

表1 肽組學(xué)研究中的主要工具Table 1 Available tools used in peptidomics

生物活性肽的結(jié)構(gòu)鑒定是后續(xù)構(gòu)效關(guān)系模型、化學(xué)計量學(xué)分析和肽數(shù)據(jù)庫管理的研究基礎(chǔ)。肽組學(xué)作為活性肽結(jié)構(gòu)表征的有效策略,主要通過串聯(lián)質(zhì)譜快速鑒定解析食源性蛋白酶解物中活性肽的結(jié)構(gòu),目前在乳品及蛋清源活性肽結(jié)構(gòu)鑒定中已有運用[28-29],其主要研究思路如下:

肽組學(xué)技術(shù)目前在食源性活性肽中的應(yīng)用主要集中在乳源和蛋源活性肽的結(jié)構(gòu)鑒定中,Liu等[37-38]借鑒肽組學(xué)技術(shù)利用三重四級桿線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜從雞蛋清蛋白酶解產(chǎn)物中高效鑒定出19個活性肽序列,其氨基酸序列分別為RVPSLM,TPSPR,DLQGK,AGLAPY,RVPSL,DHPFLF,HAEIN,QIGLF,HANENIF,VKELY,TNGIIR,KLPGF,EAGVD,EVSGL,NVLQPS,QITKPN,LEPINF,AEAGVD和ANENIF,并通過后續(xù)的生物活性篩選獲得具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性肽RVPSL和抗糖尿病活性肽KLPGF。Wu等[39]利用肽組學(xué)中的LC-MS/MS并輔以定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)對大豆蛋白源ACE抑制肽進(jìn)行了純化和表征,闡明五條三肽序列分別為IVF,LLF,LNF,LSW和LEF。肽組學(xué)尤其在乳源蛋白酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定方面應(yīng)用更為成熟,Laura等[29]對近年來肽組學(xué)在乳源生物活性肽的發(fā)現(xiàn)、生物活性篩選以及監(jiān)測等方面的應(yīng)用進(jìn)行了報道,并闡明具有一定生理活性肽的一級結(jié)構(gòu),質(zhì)譜分析中主要應(yīng)用ESI、nano ESI、MALDI以及ESI&MALDI離子源,利用IT、TOF以及IT&TOF質(zhì)量分析器進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析[33-35],肽組學(xué)的一系列應(yīng)用研究為肽組學(xué)在食源性活性肽結(jié)構(gòu)表征中的運用提供了一個成功的參考范例。

4 展望

鑒于食源性生物活性肽已成為功能性食品中重要功效成分且這些化合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的復(fù)雜性,科學(xué)先進(jìn)的技術(shù)手段對其后續(xù)深入研究發(fā)揮中決定性作用。肽組學(xué)技術(shù)將會成為食源性生物活性肽研究領(lǐng)域的一個重要手段,因為生物活性肽的純化、結(jié)構(gòu)鑒定、體內(nèi)吸收分布以及代謝等研究均要涉及肽組學(xué)技術(shù)。肽組學(xué)還可應(yīng)用于活性肽加工和儲存過程中的變化研究,而多維液相色譜和毛細(xì)管電泳色譜與生物串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)協(xié)同跟蹤監(jiān)測活性肽一級結(jié)構(gòu)變化為產(chǎn)品質(zhì)量溯源提供技術(shù)保障。同時肽組學(xué)中的生物信息學(xué)工具也逐漸應(yīng)用于食源性生物活性肽的構(gòu)效關(guān)系研究中,可為闡明生物活性肽發(fā)揮生理活性的作用機制提供輔助工具。隨著生物活性肽基礎(chǔ)研究的深入,體內(nèi)吸收的生物活性肽的濃度以及在靶器官中分布情況的相關(guān)性研究將成為未來生物活性肽研究的熱點,肽組學(xué)將成為開展這些研究的有效的技術(shù)手段,將使感興趣的生物活性肽發(fā)現(xiàn)、優(yōu)化生產(chǎn)的周期大大縮短,并有助于理解活性肽與受體之間的相互作用機制。

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Progress on the application of peptidomics methods in food-derived bioactive peptides

YU Zhi-peng1,XUE Ru-yang1,ZHAO Wen-zhu1,*,ZHANG Hong-yang1,WU Yu1,ZHANG Shuang1,LI Jian-rong1,LIU Jing-bo2,*
(1.College of Food Science and Engineering,Bohai University,National&Local Joint Engineering Research Center of Storage Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China;2.Lab of Nutrition and Functional Food,Jilin University,Changchun 130062,China)

Food peptidomics as an emerging field of food science and technology is gradually applied to the biological activity of the peptide preparation,purification,identification,and structure-activity relationship,involved the qualitative and quantitative aspects of bioactive peptides.Objective of this review was to highlight the increasing role of peptidomics as indispensable tool in the fields of production,purification,characterization,and structure-activity relationship of food-derived bioactive peptides,aimed to support extensive application reference of peptidomics in the food-derived peptides field.

bioactive peptide;peptidomics;purification;identification;structure activity relationship

TS201

A

1002-0306(2016)04-0382-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.069

2015-06-12

于志鵬(1984-),男,博士,講師,研究方向:蛋白質(zhì)及活性肽的功能研究與產(chǎn)品開發(fā),E-mail:yuzhipeng20086@sina.com。

趙文竹(1986-),女,博士,講師,研究方向:植物多糖及糖蛋白,E-mail:zhaowenzhu777@163.com。劉靜波(1962-),女,博士,教授,研究方向:營養(yǎng)與功能食品,E-mail:ljb168@sohu.com。

國家自然科學(xué)基金面上項目(31271907);國家科技支撐課題-“食源性功能肽生物制備技術(shù)研究(2012BAD00B03)”。

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