龍明秀，王　輝，蔣　緯，譚書明（.貴州省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究所，貴州貴陽550006；.貴州省生物技術(shù)研究所，貴州貴陽550006；.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，貴州遵義56006；4.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽55005）

固載ClO2保鮮劑對米良獼猴桃腐敗菌的抑菌活性

龍明秀1，王輝2，蔣緯3，譚書明4，*
（1.貴州省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展研究所，貴州貴陽550006；2.貴州省生物技術(shù)研究所，貴州貴陽550006；3.遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校，貴州遵義563006；4.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025）

為考察固載ClO2保鮮劑對米良獼猴桃腐敗菌的抑菌效果，通過PDA平板培養(yǎng)法從米良獼猴桃病害組織中分離腐敗菌，運用有傷和無傷接種法篩選最強(qiáng)致病力菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定菌株，采用菌絲生長速率測定法考察固載ClO2保鮮劑對最強(qiáng)致病力菌株的抑菌效果。結(jié)果顯示，從米良獼猴桃病害組織中分離出的7種腐敗菌中，有3種致病力最強(qiáng)的菌株，經(jīng)鑒定分別為漆斑菌屬（Myrothecium sp.）、莖點菌屬（Phoma sp.）和交鏈孢霉屬（Alternaria sp.）；常溫下固載ClO2保鮮劑對3株菌株均有抑制作用，但都不能完全抑制菌種的生長，抑制活性交鏈孢霉屬＞漆斑菌屬＞莖點菌屬；2℃下固載ClO2保鮮劑幾乎能使3株菌株完全受到抑制。結(jié)果表明，固載ClO2對米良獼猴桃腐敗菌有較好的抑菌效果，可以作為米良獼猴桃的保鮮劑用于降低腐敗率。

固載二氧化氯，保鮮劑，獼猴桃，腐敗菌，抑菌活性

獼猴桃營養(yǎng)豐富，極易軟化腐爛，霉菌侵染是造成獼猴桃貯運期間果實大量腐爛變質(zhì)的重要原由之一，發(fā)病率在20%～50%左右［1-3］。國內(nèi)外學(xué)者對獼猴桃腐敗菌做了大量研究。目前從獼猴桃中分離的腐敗菌主要有Bortytis cinerea，Penicillium sp.［1］，Botryosphaeria sp.［4］，Phomopsis sp.［1，4-6］和Diaportheactinidiae等［7］屬真菌，并認(rèn)為病原菌主要是通過機(jī)械損傷侵染才導(dǎo)致腐爛。其中，大多數(shù)研究均表明Phomopsis sp.是獼猴桃貯藏期最主要的病原菌，且只有機(jī)械損傷的獼猴桃才會被Phomopsis sp.浸染［6］。因此，減少獼猴桃貯藏期霉菌的侵染是減少獼猴桃采后損失的有效途徑之一。

ClO2具有高效殺菌和防霉保鮮的作用［8-10］，殺菌消毒能力強(qiáng)，對人及動物無毒，不產(chǎn)生致癌、致突、致畸物質(zhì)［11］。近年來，有關(guān)ClO2對獼猴桃的防腐保鮮應(yīng)用進(jìn)行了大量的研究。結(jié)果顯示，固載ClO2不但對幾種常見菌具有較好的殺菌效果，能有效降低獼猴桃的腐敗率［12］，而且能明顯降低機(jī)械損傷獼猴桃的呼吸速率、乙烯釋放速率及腐爛率［13］。采前ClO2處理能有效殺滅獼猴桃表面的有害微生物［14］，CaCl2與ClO2對獼猴桃的保鮮有協(xié)同作用，其復(fù)合浸泡液能有效降低獼猴桃的腐爛率［15］。

貴州是我國獼猴桃的主產(chǎn)區(qū)之一，而米良是貴州主栽品種之一。本實驗從腐爛的米良獼猴桃中分離、純化得到獼猴桃致病菌，然后通過形態(tài)觀察并結(jié)合分子鑒定，確定獼猴桃致病菌的種類，并研究固載ClO2保鮮劑對獼猴桃致病菌的抑菌作用，旨在為米良獼猴桃的防腐保鮮提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

供分離的腐爛獼猴桃收集于修文縣獼猴桃基地；固載ClO2保鮮劑自制［16］。

SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；數(shù)碼生物顯微鏡上海精科天美科學(xué)儀器有限公司

1.2實驗方法

1.2.1腐敗菌的分離與純化用0.1%升汞對獼猴桃的腐爛表面消毒，切取腐爛部位接種到PDA平板培養(yǎng)基上，在28℃下培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落形態(tài)，挑取不同形態(tài)菌絲植入另一PDA培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；重復(fù)上述操作直至得到純化菌種，4℃保存?zhèn)溆茫?7-18］。

1.2.2致病力的測定將純化后的腐敗菌對獼猴桃進(jìn)行有傷和無傷接種［19-22］。10 d左右觀察病斑的侵染狀況和發(fā)展程度，判斷腐敗菌致病能力的大小，選擇致病力最強(qiáng)的3株進(jìn)行菌屬鑒定，并作為抑菌實驗供試菌。1.2.3腐敗菌屬的鑒定

1.2.3.1形態(tài)學(xué)鑒定用苯酚-乳酸染液染色，然后進(jìn)行鏡檢，觀察記錄菌落形態(tài)特征（包括菌體大小、形狀、表面特征等），記錄孢子大小、形狀、類型等，并依據(jù)《真菌鑒定手冊》確定菌屬［23］。

1.2.3.2致病菌的ITS序列測定由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行DNA測序，并通過GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對［24-25］。

1.2.4固載ClO2保鮮劑的制備按m亞氯酸鈉∶m酒石酸∶m氯化鈣∶m活性炭=6∶2∶1∶2比例分別稱取3 g亞氯酸鈉，1 g酒石酸，0.5 g氯化鈣，1 g活性炭，然后將各試劑均勻混合于10 mL小燒杯中，固載ClO2保鮮劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，每份配制5.5 g［16］。

1.2.5固載ClO2保鮮劑對獼猴桃致病菌抑菌活性測定采用菌絲生長速率法。將菌種在PDA上活化（25℃培養(yǎng)72 h）后，用無菌打孔器在菌種邊緣打出7 cm菌餅，然后將菌餅接于另一PDA平板中央。在相同體積的無菌干燥器中加入5 mL無菌水，放入固載ClO2保鮮劑，并做對照。再將含獼猴桃腐敗菌的PDA培養(yǎng)基放入干燥器中，分別在常溫和2℃下觀察記錄菌落直徑變化，用十字交叉法測量菌落直徑［26-28］，實驗重復(fù)5次。

2　結(jié)果與分析

2.1獼猴桃腐敗菌的分離與致腐性鑒定

在28℃下，對從獼猴桃病害組織中分離出的7種腐敗菌分別進(jìn)行有傷和無傷接種，通過腐敗菌對獼猴桃致腐性的測定（結(jié)果見表1），篩選出致腐性最強(qiáng)的3株進(jìn)行菌屬鑒定，并作為供試菌種。

表1　7種腐敗菌對獼猴桃的致病力（10 d）Table 1　Pathogenicity of seven pathogens on kiwifruit（10 d）

表1顯示，7種腐敗菌的有傷接種皆有不同程度的感染，編號為A、C、D的3株菌種致病性最強(qiáng)，而無傷接種均未出現(xiàn)感染，說明7種腐敗菌都只能通過傷口浸染。研究表明，傷口侵染是大部分霉菌侵入獼猴桃果實的主要途徑［6，29-31］，而獼猴桃在采收、分級、儲存、包裝、運輸和銷售等環(huán)節(jié)均容易造成機(jī)械損傷，大大增加了霉菌浸染的機(jī)會，以至于霉菌發(fā)病率高達(dá)30%～50%［1-3］。

2.2獼猴桃優(yōu)勢致病菌鑒定結(jié)果

結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)［32］鑒定了3株致病力較強(qiáng)的腐敗菌分別為：漆斑菌屬（Myrothecium sp.）、莖點菌屬（Phoma sp.）和交鏈孢霉屬（Alternaria sp.）。

2.2.1漆斑菌屬（Myrothecium sp.）的鑒定菌種A 在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和顯微鏡下的圖片如圖1所示。PDA培養(yǎng)基上菌落生長有一定的局限性，菌落正背面均為雪白色，菌絲短而密，邊緣不褪色。顯微鏡下菌絲有隔膜，分生孢子外生，呈堆墊狀，顏色有深有淺，無隔膜，不串生，分生孢子座有向外伸出的菌絲，分生孢子梗幾乎無色。測定顯示基因序列長度為572 bp，與GenBank同源性比對相似度為99%，所以確定該菌株為漆斑菌屬（Myrothecium sp.），且GenBank登錄號為AB472083.1。

2.2.2莖點菌屬（Phoma sp.）的鑒定菌種C在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)和顯微鏡下的圖片如圖2所示。菌種C在PDA上生長較快，菌落呈絮狀生長，隨著菌落的擴(kuò)大，從中心開始出現(xiàn)粉紅色輪紋，并逐漸向外擴(kuò)展，漸次轉(zhuǎn)變?yōu)榧t褐色，背面為褐色至黑色，有輪紋，表面有水珠。顯微鏡下觀察到菌絲有隔膜，分生孢子梗短或幾乎沒有，分支或不分支，分生孢子器密集，呈球形或錐形，分生孢子很小，透明，圓形或橢圓形。測定顯示基因序列長度為527 bp，與GenBank同源性比對相似度為99%，所以確定該菌株為莖點菌（Phoma sp.），且GenBank登錄號為HQ630963.1。

圖2　莖點菌屬在PDA平板上的菌落形態(tài)及其菌絲和孢子梗形態(tài)Fig.2　Colony morphology of Phoma sp.on PDA and it’s hyphal and conidiophore morphology

2.2.3交鏈孢霉屬（Alternaria sp.）的鑒定菌種D在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)和顯微鏡下的圖片如圖3所示。菌種D在PDA培養(yǎng)基上菌落生長迅速，棉絮狀，開始為淺灰色，后變?yōu)榘稻G色，背面為褐色至黑色，表面生長疏松的淺灰色棉花狀氣生菌絲。在顯微鏡下觀察到棕色分隔菌絲，分生孢子梗自菌絲發(fā)出，直立，不分枝，與營養(yǎng)菌絲區(qū)別不大。分生孢子頂生，呈暗色，橢圓形或卵形，縱橫分隔呈壁磚狀，較少單生，常有數(shù)個成鏈的同節(jié)孢子。測定顯示基因序列長度為552 bp，與GenBank同源性比對相似度為100%，所以確定該菌株為交鏈孢霉屬（Alternaria sp.），且GenBank登錄號為JN867466.1。

圖3　交鏈孢霉屬在PDA平板上的菌落形態(tài)及其菌絲和孢子梗形態(tài)Fig.3　Colony morphology of Alternaria sp.on PDA and it’shyphal and conidiophore morphology

目前，鑒定的獼猴桃病原菌有Cryptosporiopsis、Cylindrocarpon、Phomopsis、Phoma、Botrytis和Altemaria等屬真菌［1，6，30］。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果較為一致。Phoma和Altemaria是造成獼猴桃腐爛的常見病原菌。永田賢嗣［33］認(rèn)為大莖點菌屬（Macrophoma）真菌是日本獼猴桃軟腐癥主要病原菌。Bisiach等［34］也從獼猴桃上分離出了Phoma和Altemaria等病原菌。交鏈孢霉屬（Alternaria sp.）是許多果蔬褐斑病的病原菌，具有很強(qiáng)的潛伏侵染能力，是造成江西奉新縣獼猴桃［31］、四川“紅陽”［35］、陜西省周至“華優(yōu)”、“海沃德”、“秦美”［36］、“中華”［37-38］等獼猴桃果實潰瘍病、褐斑病等的主要病原菌之一。Myrothecium sp.可引起番茄［39］、辣椒［40］、茄子［41］等果實的腐爛，而在獼猴桃上還未見報道。

2.3固載ClO2保鮮劑對米良獼猴桃致腐菌的抑菌活性

2.3.1固載ClO2保鮮劑對漆斑菌的抑菌活性如圖4所示，常溫下對照組漆斑菌生長迅速，處理組生長速率較對照組顯著降低，說明常溫下固載ClO2保鮮劑對漆斑菌有較好的抑制作用，但不能完全抑制其生長。處理組與對照組差異極顯著（p＜0.01）。2℃時對照組生長非常緩慢，處理組生長幾乎完全受到抑制，說明2℃時固載ClO2保鮮劑能夠完全抑制漆斑菌的生長。

圖4　常溫（a）及2℃（b）下固載ClO2保鮮劑對漆斑菌的抑菌活性Fig.4　The bacteriostatic effect of solid ClO2preservative on Myrothecium sp.under the normal temperature（a）and 2℃（b）

2.3.2固載ClO2保鮮劑對莖點菌的抑菌效果如圖5所示，常溫下固載ClO2保鮮劑對莖點菌有一定的抑制作用，但也不能完全抑制其生長，處理組與對照組差異極顯著（p＜0.01）。2℃下對照組菌落前10 d生長很緩慢，10 d后菌落直徑開始逐漸擴(kuò)大，生長迅速，而處理組菌落直徑不隨時間擴(kuò)大，并且出現(xiàn)菌絲層變薄的現(xiàn)象，菌落直徑稍有萎縮，莖點菌的生長幾乎完全受到抑制。

2.3.3固載ClO2保鮮劑對交鏈孢霉的抑菌效果如圖6所示，常溫下交鏈孢霉處理組第5 d時菌落直徑基本不再擴(kuò)大，說明ClO2對該菌有很強(qiáng)的抑制作用。處理組與對照組差異極顯著（p＜0.01）。2℃時對照組菌落生長隨時間變化逐漸加快，而處理組菌落直徑只擴(kuò)大了0.5～1 mm左右，并且也出現(xiàn)菌絲層變薄的現(xiàn)象，生長幾乎完全受到抑制。

圖5　常溫（a）及2℃（b）下固載ClO2保鮮劑對莖點菌的抑菌活性Fig.5　Thebacteriostaticeffectofsolidchlorinedioxidepreservative on Phoma sp.under the normal temperature（a）and 2℃（b）

圖6　常溫（a）及2℃（b）下固載ClO2保鮮劑對交鏈孢霉的抑菌效果Fig.6　The bacteriostatic effect of solid chlorine dioxide preservative on Alternaria sp.under the normal temperature（a）and 2℃（b）

3　結(jié)論

從貴州省修文縣米良獼猴桃病害組織中分離出3株腐敗菌。通過形態(tài)學(xué)并結(jié)合分子生物學(xué)鑒定為漆孢霉屬（Myrothecium sp.）、莖點菌屬（Phoma sp.）和交鏈孢霉屬（Alternaria sp.），且3株腐敗菌均只能通過傷口浸染果實。說明減少獼猴桃采收、分級、包裝、運輸過程中的機(jī)械損傷能有效減少腐敗菌的浸染，從而減少產(chǎn)后損失。本研究分離的病原菌Phoma sp.和Altemaria sp.與前人研究結(jié)果較為一致，而Myrothecium sp.可引起獼猴桃果實腐爛還未見報道，有待進(jìn)一步研究。

固載ClO2保鮮劑通過持續(xù)釋放低濃度ClO2起到殺菌抑菌的作用。常溫下對3株菌株有明顯的抑制作用，但不能完全抑制菌種的生長。抑制作用交鏈孢霉屬＞漆孢霉屬＞莖點菌屬。2℃下固載ClO2保鮮劑幾乎能使3株菌株完全受到抑制。說明固載ClO2保鮮劑在低溫下的殺菌力更強(qiáng)，冷藏結(jié)合固載ClO2保鮮劑的使用將大大降低獼猴桃腐敗率。

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Antimicrobial activity of solid ClO2preservative on miliang kiwifruit pathogenic fungi

LONG Ming-xiu1，WANG Hui2，JIANG Wei3，TAN Shu-ming4，*
（1.Guizhou Institute of Integrated Agriculture Development，Guiyang 550006，China；2.Guizhou Institute of Biotechnology，Guiyang 550006，China；
3.Zunyi Medical and Phamaceutical College，Zunyi 563006，China；4.College of Life Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

In order to investigated antimicrobial activity of solid chlorine dioxide preservative on miliang kiwifruit，pathogenic fungi were isolated from diseased tissue by PDA plate.Using injury and no injury inoculation to screening strongest virulence strains.Morphological and molecular way were used to identify strains.The antimicrobial activity of solid ClO2preservative on the most virulent strains was investigated by using the method of mycelium growth rate.Research had revealed that seven pathogen strains were parted from rotten miliang kiwifruit.Three of them were deemed as the most virulent strains and identified as Myrothecium sp.，Phoma sp. and Alternaria sp.All three strains were inhibited by solid ClO2preservative under room temperature but couldn’t completely inhibit their growth.The sequence of inhibition was Alternaria sp.，Myrothecium sp.and Phoma sp.The three strains were almost inhibited by solid ClO2preservative under 2℃.Solid ClO2spoilage of miliang kiwifruit had a good antibacterial effect.It can be used as a preservative for reducing the rate of corruption.

solid ClO2；preservative；kiwifruit；pathogenic fungi；antimicrobial activity

TS255.3

A

1002-0306（2016）04-0342-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.060

2015-06-10

龍明秀（1989-），女，研究實習(xí)員，主要從事食品貯藏與加工方面的研究，E-mail：692825923@qq.com。

譚書明（1964-），男，教授，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏方面的研究，E-mail：tshuming2003@yahoo.com。

黔科合NY［（2014）3011］；黔科合人才團(tuán)隊（2012）4019；黔科合院所創(chuàng)能［2012（4002）］；黔科合條X［2014］4001號。