鄭　爽，李新華，楊　強(qiáng)，孫步云（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110866）

玉竹多糖純化工藝的優(yōu)化研究

鄭爽，李新華*，楊強(qiáng)，孫步云
（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110866）

選擇合適的玉竹多糖脫蛋白方法進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)，得出最優(yōu)脫蛋白條件；在此基礎(chǔ)上，對比不同類型的樹脂對玉竹多糖的脫色效果，選出最適合玉竹多糖脫色的樹脂類型及最優(yōu)動(dòng)態(tài)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明酶法與sevag法聯(lián)用為最佳的脫蛋白方法，在酶用量0.1 g，酶解溫度40℃，酶解時(shí)間1 h，pH為5的條件下，玉竹多糖的脫蛋白效果最好，蛋白質(zhì)脫除率為72.43%，多糖損失率為13.14%；對玉竹多糖脫色效果好的是大孔陰離子交換樹脂脫色1號，上樣濃度為4 mg/mL，上樣速率為1 mL/min，上樣量為2 BV條件下，玉竹多糖的脫色效果最好，脫色率達(dá)到80.65%，多糖保留率達(dá)到87.82%。

玉竹多糖，脫蛋白，脫色，多糖損失，樹脂

玉竹［Polygonatum odoratum（Mill.）Druce］別名玉參、葳蕤、甜草根等，是百合科黃精屬植物玉竹的干燥根莖是一種營養(yǎng)價(jià)值高的多年生草本藥食兩用植物，具有滋陰潤燥、除煩祛暑、擴(kuò)張冠脈、降血脂、降血壓、改善心肌缺血［1］、降血糖［2］和增強(qiáng)免疫力［3］等功效。玉竹營養(yǎng)豐富［4］，含有許多營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖、淀粉、黃酮、生物堿、苷類、甾醇、揮發(fā)油［5］以及多種微量元素，其中，多糖是玉竹根中最主要的成分。

現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究證明，玉竹多糖生理活性顯著，具有降血壓、降血脂、改善心肌缺血等作用，對玉竹多糖結(jié)構(gòu)及功能性的進(jìn)一步深入研究有利于玉竹資源的合理利用。玉竹粗多糖的提取分離和純化需要除去共存的蛋白、色素等雜質(zhì)。目前，分離純化有多種方法，選擇和優(yōu)化玉竹多糖分離、純化方法及工藝參數(shù)是合理分析檢測玉竹多糖生理功效的前提。大孔樹脂是一類新型高分子聚合物，其具有脫色范圍廣、可重復(fù)利用、可洗脫等優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)如今應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣，尤其是在天然產(chǎn)物提取純化方面。陳振興等［6］利用D900樹脂對巴戟天多糖進(jìn)行了脫色工藝優(yōu)化，獲得了較好的脫色率以及較高的多糖保留率。目前，針對玉竹多糖進(jìn)行大孔樹脂脫色的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)還很少。

本文通過考察不同脫蛋白方法即sevag法、三氯乙酸法（TCA法）、酶法與sevag法聯(lián)用等對玉竹多糖蛋白質(zhì)脫除效果的影響，選擇合適的方法進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)，得出最優(yōu)脫蛋白條件；在此基礎(chǔ)上，對比不同的大孔吸附樹脂和離子交換樹脂對玉竹多糖的脫色效果，選出最適合玉竹多糖脫色樹脂類型，進(jìn)行樹脂柱動(dòng)態(tài)參數(shù)優(yōu)化。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

玉竹根遼寧省寬甸滿族自治縣；大孔樹脂：D900、脫色1號、D001、D101、DA201、DM130、S8滄州寶恩吸附材料科技有限公司；牛血清白蛋白（生化試劑） 南京奧生化學(xué)技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250（Fluka）上?；瘜W(xué)試劑公司；木瓜蛋白酶（pangbo enzyme） 10000 u/g，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯仿、正丁醇、三氯乙酸、鹽酸、乙醚、丙酮、硫酸、苯酚均為分析純。

HZS-H型水浴振蕩器哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；JD200-2型電子天平北京賽多利斯儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司；TDL-5-A型離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；DZF-6050真空干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；XA-1型固體樣品粉碎機(jī)河南省鞏義市光壓儀器廠；7200型分光光度計(jì)尤尼柯（上海）儀器有限公司；HZS-H型水浴振蕩器哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；DHL-A恒流泵上海青浦滬西儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1玉竹多糖的制備玉竹根粉末（清洗、烘干粉碎）→熱水提?。?0℃）→離心取上清液（10000 r/min，10 min）→濃縮至原來體積的三分之一→加4倍體積乙醇沉淀12 h→丙酮、乙醚洗滌沉淀→干燥得玉竹粗多糖。

1.2.2多糖脫蛋白

1.2.2.1方法一［7］sevag法脫蛋白：1 mg/mL的玉竹多糖溶液50 mL，按體積的1/3加入有機(jī)溶劑（氯仿∶正丁醇=5∶1），混勻，劇烈振蕩20 min，離心（10000 r/min、10 min）去除沉淀后，取上清液測定蛋白質(zhì)及多糖的含量，反復(fù)進(jìn)行至無蛋白層。

1.2.2.2方法二［7］鹽酸法脫蛋白：取1 mg/mL的玉竹多糖溶液50 mL，逐滴加入1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH為4，在低溫下（4℃）放置12 h，離心（10000 r/min、10 min）去除沉淀后，取上清液測定蛋白質(zhì)及多糖的含量，反復(fù)進(jìn)行至無蛋白層。

1.2.2.3方法三［7］三氯乙酸法（TCA法）：取1 mg/mL的玉竹多糖溶液50 mL，緩慢加入體積分?jǐn)?shù)為5%的三氯乙酸溶液，混勻劇烈振蕩，在低溫下（4℃）放置12 h，離心（10000 r/min、10 min）去除沉淀后，取上清液測定蛋白質(zhì)及多糖的含量，反復(fù)進(jìn)行至無蛋白層。

1.2.2.4方法四酶法與sevag法聯(lián)用脫蛋白：取一定體積的玉竹多糖溶液，在一定的pH下加入一定量的木瓜蛋白酶，在水浴振蕩器中振蕩酶解一定的時(shí)間，離心得上清液，加入有機(jī)溶劑（氯仿和正丁醇），混勻，劇烈振蕩，離心去除沉淀后，反復(fù)進(jìn)行至無蛋白層。

1.2.3酶法與sevag法聯(lián)用脫蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)主要因素有酶用量、酶解pH、酶解溫度與酶解時(shí)間。

1.2.3.1酶用量對蛋白質(zhì)脫除效果的影響酶的質(zhì)量分別為0.017、0.025、0.050、0.100、0.150 g，pH為7，溫度50℃，酶解1 h。

1.2.3.3酶解溫度對蛋白質(zhì)脫除效果的影響酶的用量為0.05 g，pH為7，溫度（40、50、60、70、80℃），酶解1 h。

1.2.3.4pH對蛋白質(zhì)脫除效果的影響酶的用量為0.05 g，pH分別為5、6、7、8、9，溫度50℃，時(shí)間1 h。

1.2.4正交實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)。1.2.5多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作采用硫酸-苯酚法［8］，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=14.16C-0.004，R2=0.9998。

表1　實(shí)驗(yàn)因素水平表L9（34）Table 1　Factors and levels of L9（34）orthogonal test

牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取10 mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水中，定容至100 mL，配得標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。精密量取標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，各加水以補(bǔ)至1.0 mL，然后向每支試管中加入考馬斯亮藍(lán)G250蛋白試劑5 mL，迅速振蕩搖勻，靜置2 min后于595 nm處測定吸光度。以牛血清白蛋白濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=10.004C+ 0.0403，R2=0.995。

蛋白質(zhì)脫除率的計(jì)算：

式中：M1為未脫蛋白溶液蛋白含量；M2為脫蛋白后溶液蛋白含量。

多糖損失率的計(jì)算：

式中：M1為未脫色溶液多糖含量；M2為脫色后溶液多糖含量。

1.2.2 測量方法 由科研護(hù)士篩選患者，跟蹤并發(fā)放問卷(放療期間的第0、1、2、3、4、5、6 和第7 周及第 11 周分別發(fā)放問卷，(因?yàn)榛颊叻暖熤芷谝话銥?周，因此第8、9、10周未予以每周測量，而是在放療結(jié)束后1個(gè)月進(jìn)行再次隨訪測量，也就是第11周)。講解填寫方法，填寫有困難者由調(diào)查人員逐條詢問記錄完成。共接觸患者127例，最后所有資料填寫完整有效的為84例。

1.2.6樹脂的預(yù)處理陽離子交換樹脂→5%HCl浸泡10h→水洗，接近中性→5%NaOH浸泡10 h→水洗，接近中性→5%HCl浸泡10 h→水洗，接近中性；陰離子交換樹脂（與陽離子交換樹脂酸堿順序相反）；吸附樹脂（同陽離子交換樹脂，最后用無水乙醇浸泡10 h，清洗至無味）。

1.2.7靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)三角瓶中加入30 mL 20 mg/mL的玉竹多糖溶液，再分別加入1 g不同的處理好的大孔樹脂，25℃恒溫振蕩脫色12 h。4000 r/min離心15 min后取上清液測定多糖的脫色率和多糖保留率，篩選出效果最好的樹脂。

1.2.8動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)將處理好的樹脂進(jìn)行濕法裝柱，體積為1 BV（20 mL），分別將不同濃度（1、2、3、4、5 mg/mL）的多糖溶液上樣，上樣量為（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 BV），上樣速率為（1、2、3、4、5 mL/min），然后用2 BV的蒸餾水洗脫，收集合并多糖脫色液和洗脫液，分別測定脫色率和多糖保留率。

1.2.8.1上樣濃度對多糖脫色效果的影響將1、2、3、4、5 mg/mL的多糖溶液上樣，上樣量為1BV，上樣速率為1.0 mL/min。

1.2.8.2上樣速率對多糖脫色效果的影響3 mg/mL的多糖溶液1 BV上樣，上樣速率分別設(shè)為1、2、3、4、5 mL/min。

1.2.8.3上樣量對多糖脫色效果的影響3 mg/mL的多糖溶液上樣，上樣量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 BV，上樣速率為1.0 mL/min。

1.2.8.4脫色率的測定及計(jì)算方法［9-10］將待測多糖溶液分別在450、550、650 nm處測定吸光度。

式中：OD1為脫色前溶液在450、550、650 nm處吸光度的總和；OD2為脫色后溶液在450、550、650 nm處吸光度的總和。

多糖保留率的計(jì)算：式中：M1為溶液脫色前的多糖含量；M2為溶液脫色后的多糖含量。

1.2.9數(shù)據(jù)處理方法Minitab單因素方差分析，對單因素不同水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同脫蛋白方法的結(jié)果分析及比較

圖1　不同脫蛋白方法的結(jié)果比較Fig.1　Comparison of the different deproteinization methods in polygonatum polysaccharides

從以上幾種方法的脫蛋白效果來看，sevag法、鹽酸法與三氯乙酸法均比酶法+sevag法聯(lián)用的蛋白質(zhì)脫除率高，但sevag法進(jìn)行脫蛋白需要重復(fù)的次數(shù)多［11］，多糖也會隨著蛋白的除去而除去［12］；三氯乙酸法中多糖的損失率較高，該法除蛋白反應(yīng)較劇烈，易引起多糖降解［13］。經(jīng)過對比可知，酶法+sevag法聯(lián)用時(shí)多糖損失率較低，為22.16%，重復(fù)三次，蛋白質(zhì)的脫除率也有所提高，為69.26%。

綜合考慮各個(gè)脫蛋白方法的蛋白質(zhì)脫除率與多糖損失率，可以看出在多糖損失率較低的情況下酶法+sevag法聯(lián)用的蛋白質(zhì)脫除率較高為69.26%。因此，對酶法+sevag法聯(lián)用進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)來確定脫蛋白的最優(yōu)條件。

2.2酶法+sevag法聯(lián)用參數(shù)優(yōu)化

2.2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1.1酶的用量對蛋白質(zhì)脫除效果的影響由圖2可以看出，當(dāng)酶的用量在0.025～0.05 g之間蛋白質(zhì)的脫除率較高，在0.05 g時(shí)為最大值67.6%，當(dāng)大于0.05 g時(shí)蛋白質(zhì)的脫除率逐漸下降，由于酶也是一種蛋白，當(dāng)增加酶的用量時(shí)，也會增加待測溶液中蛋白的含量，因此蛋白質(zhì)的脫除率低。當(dāng)酶的用量為0.017 g時(shí)，由于酶的用量不夠底物完全酶解，蛋白質(zhì)脫除率小為19.8%。因此，綜合考慮蛋白質(zhì)的脫除率、酶量與節(jié)約成本方面，選擇的酶的用量為0.025、0.05、0.1 g進(jìn)行接下來的正交實(shí)驗(yàn)。

圖2　酶的用量對蛋白質(zhì)脫除效果的影響Fig.2　Effect of enzyme dosage on the protein removal rate

2.2.1.2酶解時(shí)間對蛋白質(zhì)脫除效果的影響由圖3可以看出，當(dāng)酶解時(shí)間在1～2 h時(shí)，隨著時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)脫除率不斷增大；在2～3 h時(shí)，隨著時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)脫除率減少。在2 h蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到最大為67.60%。而且隨著酶解時(shí)間的延長也會增加能源消耗，增加成本。因此，選擇進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)的酶解時(shí)間為1、1.5、2 h。

圖3　酶解時(shí)間對蛋白質(zhì)脫除效果的影響Fig.3　Effect of enzymolysis time on the protein removal rate

2.2.1.3酶解溫度對蛋白質(zhì)脫除效果的影響由圖4可知，酶解溫度在60℃時(shí)蛋白質(zhì)的脫除率最高為70.1%。但隨著溫度繼續(xù)升高，蛋白質(zhì)的脫除率不斷減小，是由于高溫使蛋白酶的活性降低。由此可以看出溫度對酶的活性有很大的影響，而且隨著溫度的升高，會增加成本。因此，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)選擇的酶解溫度為40、50、60℃。

圖4　酶解溫度對蛋白質(zhì)脫除效果的影響Fig.4　Effect of enzymolysis temperature on the protein removal rate

2.2.1.4pH對蛋白質(zhì)脫除效果的影響由圖5可以看出，pH為5～6蛋白質(zhì)的脫除率為63.7%～67.8%，當(dāng)pH大于6時(shí)，隨著pH的增加蛋白質(zhì)的脫除率不斷減小，這是由于堿性條件下木瓜蛋白酶的活性降低導(dǎo)致的。因此，正交實(shí)驗(yàn)選擇的溶液pH為5、6、7。

圖5　pH對蛋白質(zhì)脫除效果的影響Fig.5　Effect of pH on the protein removal rate

2.2.2正交實(shí)驗(yàn)從表2極差（R）可知，以上4個(gè)因素對蛋白質(zhì)脫除效果影響的主次關(guān)系：酶用量（A）＞pH （D）＞酶解時(shí)間（C）＞酶解溫度（B），最優(yōu)組合為A3B1C1D1，即最優(yōu)的脫蛋白條件為：酶用量0.1 g，酶解溫度40℃，酶解時(shí)間1 h，pH為5，在此條件下，蛋白質(zhì)脫除率為72.43%，多糖損失率為13.14%。

2.3不同樹脂脫色效果的對比

由表3可知，從脫色率方面考慮，D900、脫色1號與S-8對玉竹多糖的脫色效果較好，均在60%左右，而且多糖保留率也在70%以上。但綜合考慮，脫色1號的效果最好，在多糖保留率較高的基礎(chǔ)上，達(dá)到較好的脫色效果。不同類型的樹脂對色素、多糖的吸附效果各不相同。D900和脫色1號屬于陰離子交換樹脂，S-8屬于極性樹脂，因此推測玉竹多糖提取液中存在的色素可能以帶負(fù)電荷的極性分子為主。但綜合考慮，脫色1號的效果最好，在多糖保留率較高的基礎(chǔ)上，達(dá)到較好的脫色效果。

2.4樹脂柱動(dòng)態(tài)操作參數(shù)優(yōu)化

2.4.1上樣速率對脫色效果的影響由圖6可知，玉竹多糖溶液上樣速率不同對脫色效果有一定的影響。隨著上樣速率的增加，脫色率呈現(xiàn)下降的趨勢。這是由于速率越快，多糖溶液與樹脂接觸的時(shí)間越短，因而不夠充分，脫色效果差。低速率有利于多糖溶液在通過樹脂的過程中更充分地進(jìn)行擴(kuò)散作用，脫色效果更明顯［14］。因此，上樣速率選擇較低的速率1 mL/min。

表2　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 2　Orthogonal array design and corresponding experimental results

表3　不同樹脂對玉竹多糖脫色效果的比較Table 3　Comparison of decolorization efficiencies of differentresins on polygonatum polysaccharides

圖6　上樣速率對多糖脫色效果的影響Fig.6　Effect of the sample rate on decolorization of polysaccharide

2.4.2上樣濃度對脫色效果的影響由圖7可知，當(dāng)上樣濃度小于4 mg/mL時(shí)，隨著上樣濃度的不斷增加，多糖液脫色率呈緩慢減小的趨勢，但減小趨勢緩慢。當(dāng)多糖溶液濃度大于4 mg/mL時(shí)，脫色率小于50%。對以上數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，可知，p≤0.01，有極顯著差異；其次考慮到后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要對多糖溶液進(jìn)行濃縮，提高實(shí)驗(yàn)效率，因此在脫色率相差不大的情況下選擇較高的上樣濃度，選擇比較合適的多糖溶液濃度為4 mg/mL。

圖7　上樣濃度對多糖脫色效果的影響Fig.7　Effect of the sample concentration on decolorization of polysaccharide

2.4.3上樣量對脫色效果的影響由圖8可知，一定量的樹脂的脫色能力有限，上樣量越大，脫色效果就會越差。當(dāng)上樣量小于2 BV時(shí)，脫色率大小相差不多；當(dāng)上樣量大于2 BV時(shí)，脫色率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，這說明這一定質(zhì)量的樹脂的脫色能力達(dá)到了極限。因此，綜合考慮脫色率和實(shí)驗(yàn)效率，選擇上樣量為2 BV。

圖8　上樣量對多糖溶液脫色效果的影響Fig.8　Effect of the sampling amount on decolorization of polysaccharide

2.5最佳工藝驗(yàn)證

由靜態(tài)吸附和動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果可知，脫色樹脂為脫色1號，上樣濃度為4 mg/mL，上樣速率為1 mL/min，上樣量為2 BV的條件下為最佳的脫色工藝，經(jīng)過3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，計(jì)算脫色率和多糖保留率，結(jié)果脫色率為80.65%，多糖保留率為87.82%。

3　結(jié)論

酶法與sevag法聯(lián)用為最佳的脫蛋白方法，在酶用量0.1 g，酶解溫度40℃，酶解時(shí)間1 h，pH為5的條件下，玉竹多糖的脫蛋白效果最好，蛋白質(zhì)脫除率為72.43%，多糖損失率為13.14%；對玉竹多糖脫色效果好的是大孔陰離子交換樹脂脫色1號，上樣濃度為4 mg/mL，上樣速率為1 mL/min，上樣量為2 BV時(shí)，脫色率達(dá)到80.65%，多糖保留率達(dá)到87.82%。

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Optimization study on purification of polysaccharides in polygonatum odoratum

ZHENG Shuang，LI Xin-hua*，YANG Qiang，SUN Bu-yun
（Shenyang Agricultural University Food Institute，Shenyang 110866，China）

Single factor experiment and orthogonal experiment were undertaken to study the best deproteinization methods of polygonatum polysaccharides.On this basis，by contrasting the decolorizing effects of polygonatum polysaccharides of the different types of resin，choose the most suitable decolorization resin type and the optimal dynamic parameters.Enzymatic and sevag method combination was the best deproteinization.The results showed that the enzyme dosage of 0.1 g，enzymolysis temperature of 40℃，enzymolysis time of 1 h，solution pH of 5，the loss rate of polysaccharide was 13.14%and the protein removal rate was 72.43%.Under the conditions of using decolorization 1 resin，sample concentration 4 mg/mL，flow rate 1 mL/min，sample loading amount 2 BV，the decolorization rate of polygonatum polysaccharides was 80.65%，and the retention rate of the polysaccharides was 87.82%.

polygonatum polysaccharides；deproteinization；decoloration；polysaccharide losses；resin

TS201.1

B

1002-0306（2016）04-0322-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.056

2015－05－25

鄭爽（1990-），女，碩士研究生，研究方向：糧油加工與轉(zhuǎn)化，E-mail：zhengshuang_2013@163.com。

李新華（1955-），男，博士，教授，研究方向：糧油加工與轉(zhuǎn)化，E-mail：lixh.syau@163.com。