馬艷芳，李玉洋，劉金龍，鄭明剛，孫中濤，*（.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安708；.國(guó)家海洋局海洋生物活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島66000）

水解度對(duì)螺旋藻肽乳化性、起泡性及抗氧化性的影響

馬艷芳1，李玉洋1，劉金龍1，鄭明剛2，孫中濤1，*
（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安271018；2.國(guó)家海洋局海洋生物活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266000）

研究了水解度對(duì)螺旋藻肽乳化性、起泡性以及抗氧化能力的影響。結(jié)果表明，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，螺旋藻肽的水解度逐漸增大。水解過程中，螺旋藻肽的起泡性、DPPH自由基清除能力以及還原力均隨著水解度的增加先增大后減小，羥基自由基清除能力隨著水解的進(jìn)行先減小后增大，達(dá)到最大后再減小。而泡沫穩(wěn)定性、乳化性、乳化穩(wěn)定性則隨著水解度的增大逐漸減小。這說明，在螺旋藻肽的生產(chǎn)過程中，并不是水解度越大越好，而應(yīng)根據(jù)對(duì)產(chǎn)品物化性質(zhì)與抗氧化能力的要求，確認(rèn)最佳水解度。

螺旋藻肽，水解度，乳化性，起泡性，抗氧化性

螺旋藻（Spirulina platensis Geitl）是一類由單細(xì)胞或多細(xì)胞組成的絲狀低等原核生物。螺旋藻富含藻膽蛋白，其含量可達(dá)細(xì)胞干重的10%～24.8%［1］。藻膽蛋白是一類存在于某些藻類藻膽體中的色素復(fù)合蛋白，其氨基酸組成比例非常理想，其中8種必需氨基酸的含量接近或者超過FAO推薦的標(biāo)準(zhǔn)［2］。螺旋藻是一種應(yīng)用廣泛的功能性食品原料，具有減輕癌癥放療、化療的毒副反應(yīng)，提高免疫功能，降低血脂等多種功效［3-4］。目前，螺旋藻多以干粉的形式直接應(yīng)用于食品行業(yè)，但是由于其溶解性差、腥味濃重的缺點(diǎn)，使其應(yīng)用受到一定的限制。

采用蛋白酶對(duì)藻膽蛋白進(jìn)行水解，可以改善其物化特性，擴(kuò)大應(yīng)用范圍。與藻膽蛋白相比，其水解產(chǎn)物螺旋藻肽不僅具有較低的分子量和良好的物化特性，更容易被人體消化吸收，而且還具有提高人體免疫功能，消除并防止機(jī)體受到自由基破壞，全面調(diào)節(jié)人體代謝機(jī)能等生理作用，其中以其抗氧化能力最受關(guān)注［5］。

螺旋藻肽的物化特性和抗氧化能力與水解度有關(guān)，目前對(duì)螺旋藻多肽生產(chǎn)工藝的優(yōu)化也多以提高水解度為目標(biāo)。但水解度與螺旋藻肽的起泡性、乳化性、抗氧化能力之間并不是單純的線性關(guān)系，螺旋藻肽生產(chǎn)過程中單純追求高水解度并不科學(xué)，而應(yīng)控制一個(gè)合適的水解度，使產(chǎn)品具有更高抗氧化能力與更好的物化特性。

本文以螺旋藻干粉為原料制備不同水解度的螺旋藻肽，并對(duì)其起泡性、乳化性與抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定，以探明水解度對(duì)起泡性、乳化性與抗氧化能力的影響，為螺旋藻肽生產(chǎn)中最佳水解度的控制提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

螺旋藻粉（100 g）山東省濱州天健生物科技有限公司，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為59.875%；堿性蛋白酶（2×105U/mL） 南寧東恒華道生物科教有限責(zé)任公司；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH） Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

JA1003電子天平上海恒平科技儀器有限公司；pHS-3C型數(shù)字酸度計(jì)上海雷磁儀器廠；79-1磁力攪拌器國(guó)華電器有限公司；THZ-C恒溫振蕩器太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；TGL-16B小型臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；UV2800型紫外可見分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋國(guó)華電器有限公司；QL-901振蕩器海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子調(diào)溫萬用電爐龍口市電爐制造廠；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；R-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海一科儀器有限公司；JT-8000Y噴霧干燥機(jī)常州博銳特干燥設(shè)備有限公司。

1.2樣品制備

參考劉士偉等［6］的方法并稍有改動(dòng)：采用純凈水將螺旋藻粉配制成10%的懸浮液，調(diào)pH8.0，加入堿性蛋白酶，加酶量4300 U/g螺旋藻，于55℃水解240 min，每40 min取樣一次并測(cè)定水解度。水解完成后，加熱至85℃保溫20 min進(jìn)行滅酶，然后5000 r/min離心15 min，收集上清液，采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮后，再于進(jìn)口溫度200℃、出口溫度70℃的條件下進(jìn)行噴霧干燥獲得螺旋藻肽干粉。

1.3水解度的測(cè)定

水解度（degree of hydrolysis，DH）可用水解后生成的ɑ-氨基氮的量占總含氮量的百分比表示［7］。如下式：

水解度（%）=水解后生成的α-氨基態(tài)氮的量/樣品的總含氮量×100

水解后生成α-氨基態(tài)氮的量可用茚三酮法測(cè)定，樣品總含氮量用凱氏定氮法（參照國(guó)標(biāo)GB/T 23530-2009）進(jìn)行測(cè)定。

1.4乳化性的測(cè)定

參考Klompong［8］的測(cè)定方法，并稍有改動(dòng)，配制1%的上述螺旋藻肽干粉溶液，用移液管取30 mL與10 mL植物油混勻，并調(diào)節(jié)pH分別為3、5、6、7、9，然后乳化1 min，制成乳化液，分別在0 min和10 min時(shí)用微量移液器吸取底部的乳狀液100 μL，加入10 mL 0.1%的SDS溶液并混勻，以0.1%的SDS作空白對(duì)照，測(cè)定其在500 nm處的吸光度A0和A10。A0即為乳化性（EA），乳化穩(wěn)定性（ES）用下式計(jì)算：

1.5起泡性及其穩(wěn)定性的測(cè)定

參考劉紅梅等［9］的方法，準(zhǔn)確稱取經(jīng)噴霧干燥得到的螺旋藻肽干粉0.1 g，溶解于2 mL去離子水中，用玻璃棒攪拌均勻，靜置10 min后，倒入10 mL量筒中，用力上下振蕩1 min，快速記錄此時(shí)泡沫體積并記為H0，靜置10 min后，記錄下此時(shí)泡沫體積H1。H0用來評(píng)價(jià)樣品的起泡能力，H1/H0來表示樣品泡沫體積的穩(wěn)定性。

1.6抗氧化能力的測(cè)定

1.6.1DPPH自由基清除能力采用Yama［10］的方法并稍有改動(dòng)：取2 mL一定濃度（0.5～2.5 mg/mL）的螺旋藻肽溶液添加至2 mL 0.2 mmol/L的DPPH的95%乙醇溶液中，混合振蕩后，在室溫下放置30 min，于517 nm處測(cè)定吸光值。清除DPPH自由基的能力為SA。

式中，空白對(duì)照—95%乙醇+蒸餾水；A1—DPPH溶液+螺旋藻肽溶液測(cè)得的吸光值；A2—95%乙醇+螺旋藻肽溶液測(cè)得的吸光值；A3—DPPH溶液+蒸餾水測(cè)得的吸光值。

1.6.2羥基自由基清除能力參考吳瓊英［11］的方法：取一定濃度的樣品2 mL（0.5～2.0 mg/mL），依次加入2 mL硫酸亞鐵（6 mmol/L），2 mL H2O2（6 mmol/L），混合靜置10 min，再加入2 mL水楊酸（6 mmol/L）混勻，靜置30 min后，在510 nm處測(cè)吸光值為Ai，當(dāng)用雙蒸水代替水楊酸時(shí)測(cè)得的吸光值為Aj，空白對(duì)照組以雙蒸水代替樣品測(cè)得的吸光值為A0，則酶解物對(duì)羥基自由基的清除率（%）表示為：

1.6.3還原力采用Osawa［12］的方法：取一定濃度的樣品1 mL（0.5～2.5 mg/mL），加入0.1 mol/L的磷酸緩沖液2.5 mL和1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，充分混合以后，在50℃下保溫20 min，隨后加入10%的三氯乙酸2.5 mL，經(jīng)充分混合后，以3000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入蒸餾水2.5 mL以及0.1%FeCl32.5 mL，然后在700 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行比色，吸光度越大說明還原力越強(qiáng)，空白對(duì)照以蒸餾水代替離心后的上清液。

1.7數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用WPS Office 2015、Origin 75軟件分析。

2　結(jié)果與分析

2.1酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

螺旋藻蛋白酶解過程中水解度隨時(shí)間的變化規(guī)律如圖1所示。由圖1可知隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，螺旋藻肽的水解度逐漸增大，這與李雪等［13］用堿性蛋白酶水解草魚魚肉蛋白得到的規(guī)律相似。其主要原因是酶解初期酶與底物接觸的機(jī)會(huì)大，反應(yīng)速率快；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，底物濃度降低，酶活力也有一定的損失，導(dǎo)致水解反應(yīng)速率降低。不同水解度的酶解產(chǎn)物可以通過控制酶解時(shí)間來獲得，所制備的酶解時(shí)間分別40、80、160、240 min的螺旋藻肽樣品，其水解度分別為6.80%、9.47%、12.57%、16.40%。

2.2水解度對(duì)螺旋藻肽乳化性的影響

圖1　DH隨時(shí)間的變化Fig.1　Effect of hydrolysis time on DH

水解度對(duì)螺旋藻肽乳化性（EA）和乳化穩(wěn)定性（ES）的影響如圖2所示。在pH3～9范圍內(nèi)，螺旋藻肽在低水解度時(shí)具有較好的乳化性和乳化穩(wěn)定性，但隨著螺旋藻粉水解度的增大，螺旋藻肽的乳化性與乳化穩(wěn)定性均顯著降低，這種規(guī)律同時(shí)存在于鮭魚肌肉蛋白酶解物中［14］。其主要原因是蛋白質(zhì)酶解為小分子肽后，溶液黏度與表面張力降低，不利于乳化性及乳化穩(wěn)定性。此外，由圖2還可以看出，在pH7，一定水解度時(shí)，螺旋藻肽的乳化性最小，乳化穩(wěn)定性最強(qiáng)，這與螺旋藻肽的等電點(diǎn)在pH7附近有關(guān)，這種現(xiàn)象也見于燕麥膠酶解物［15］。

圖2　水解度對(duì)螺旋藻肽乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響Fig.2　Effect of DH on emulsifying activity and emulsifying stability of Spirulina protein hydrolysates

2.3水解度對(duì)螺旋藻肽起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響

水解度對(duì)螺旋藻肽起泡性（FC）及泡沫穩(wěn)定性（FS）的影響如圖3所示。提高螺旋藻的水解度，螺旋藻肽起泡性增大，并在水解度為12.57%時(shí)達(dá)到最大值，此后，再提高水解度，螺旋藻肽的起泡性反而降低；由圖2可以發(fā)現(xiàn)泡沫穩(wěn)定性隨著螺旋藻水解度的提高一直在降低。這與大豆肽溶液的起泡性與泡沫穩(wěn)定性隨水解度變化的規(guī)律類似［16］。其原因是隨著水解度的提高，螺旋藻肽的分子量降低，溶液的黏度與表面張力發(fā)生變化，從而影響其起泡性與泡沫穩(wěn)定性。

圖3　水解度對(duì)螺旋藻肽起泡性及泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.3　Effect of DH on foaming activity and foaming stability of Spirulina protein hydrolysates

2.4抗氧化能力的測(cè)定

圖4　水解度對(duì)螺旋藻肽DPPH自由基清除能力的影響Fig.4　Effect of DH on DPPH radical scavenging ability of Spirulina protein hydrolysates

2.4.1水解度對(duì)螺旋藻肽DPPH自由基清除能力的影響DPPH自由基清除能力是表征天然抗氧化劑體外抗氧化活性的重要指標(biāo)，在517 nm處有最大吸光度，其顏色變化及在517 nm的吸光度與抗氧化劑的自由基清除能力存在線性關(guān)系。水解度對(duì)螺旋藻肽DPPH自由基清除能力的影響如圖4所示，增大螺旋藻粉的水解度，可以提高螺旋藻肽的DPPH自由基清除能力，并在水解度為12.57%時(shí)達(dá)到最大；但水解度過高時(shí)，DPPH自由基清除能力反而下降。這與付中民等報(bào)道的蜂王漿蛋白酶解物對(duì)DPPH自由基清除能力的規(guī)律類似，但蜂王漿蛋白酶解物的DPPH自由基清除能力在水解度為4.18%時(shí)最大［17］。

2.4.2水解度對(duì)螺旋藻肽羥基自由基清除能力的影響羥基自由基是目前已知的活性最強(qiáng)的活性氧自由基，可與DNA、蛋白質(zhì)等生物分子發(fā)生反應(yīng)，造成細(xì)胞損傷。水解度對(duì)螺旋藻肽羥基自由基清除能力的影響如圖5所示，螺旋藻肽的羥基自由基清除能力隨水解度的增大先減小、后增大，并在水解度為12.57%時(shí)達(dá)到最大，此后，再增大水解度，其羥基自由基的清除能力反而明顯下降。這與You等報(bào)道的泥鰍蛋白水解物的羥基自由基清除能力隨水解度的變化規(guī)律是一致的，但泥鰍蛋白水解物的羥基自由基清除能力在水解度為23%時(shí)最大［18］。

圖5　水解度對(duì)螺旋藻肽羥基自由基清除能力的影響Fig.5　Effect of DH on hydroxyl radical scavenging ability of Spirulina protein hydrolysates

圖6　水解度對(duì)螺旋藻肽還原力的影響Fig.6　Effect of DH on reducing power of Spirulina protein hydrolysates

2.4.3水解度對(duì)螺旋藻肽還原力的影響還原力是指抗氧化劑提供電子的能力，是評(píng)價(jià)抗氧化劑體外抗氧化能力的一個(gè)重要指標(biāo)。水解度對(duì)螺旋藻肽還原力的影響如圖6所示，當(dāng)螺旋藻粉的水解度較低時(shí)，螺旋藻肽的還原力隨著水解度的增大可顯著提高，并在水解度為12.57%時(shí)達(dá)到最大，此后，再提高水解度，還原力反而下降。這與Rossawan等報(bào)道的鰹魚魚籽酶解物的還原力與水解度的關(guān)系具有相同的規(guī)律，即還原力先隨著水解度的增大而增大，達(dá)到最大值后，再提高水解度，還原力反而降低，但鰹魚魚籽酶解物的還原力是在水解度為5%時(shí)最大［19］，這說明生產(chǎn)抗氧化性肽時(shí)，應(yīng)根據(jù)蛋白質(zhì)原料的種類，控制不同的水解度，以獲得最大還原力。

3　結(jié)論

水解度對(duì)螺旋藻肽的乳化性、起泡性以及抗氧化能力有重要影響。水解度較小時(shí)，螺旋藻肽具有較強(qiáng)的乳化性與乳化穩(wěn)定性，但隨著水解度的增大，其乳化性和乳化穩(wěn)定性均逐漸降低。增大水解度可以改善螺旋藻肽的起泡性，水解度為12.57%時(shí)起泡性最大，水解度過高，起泡性反而降低，但泡沫穩(wěn)定性與起泡性的變化規(guī)律不同，它隨著水解度的增大逐漸減小。增大水解度可提高螺旋藻肽的抗氧化能力，水解度為12.57%時(shí)，其DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力與還原力最大，水解度過高時(shí)，抗氧化能力反而下降。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)螺旋藻粉酶解工藝的研究多以提高水解度為目標(biāo)，但是并未充分考慮水解度對(duì)螺旋藻肽物化性質(zhì)與抗氧化能力等生理活性的影響，這樣是不科學(xué)的。因此在水解過程中，應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)目的控制一個(gè)最佳水解度，并不是水解度越高越好。本研究初步研究了水解度對(duì)螺旋藻肽物化性質(zhì)及抗氧化能力的影響，但是并沒有對(duì)如何根據(jù)產(chǎn)品要求準(zhǔn)確控制水解度進(jìn)行研究，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以對(duì)此進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

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Effect of degree of hydrolysis on emulsification，foaming capacity and antioxidant activity of Spirulina peptides

MA Yan-fang1，LI Yu-yang1，LIU Jin-long1，ZHENG Ming-gang2，SUN Zhong-tao1，*
（1.College of Life Science，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China；2.Key Lab of Marine Bioactive Substance and Modern Analytical Technique，Qingdao 266000，China）

The effect of the degree of hydrolysis（DH）on the emulsification，foaming capacity and antioxidant activity of Spirulina peptides was investigated.The DH of the hydrolysate increased during the process of hydrolysis.In the process of hydrolysis，the foaming activity，DPPH radical scavenging ability，and reducing power of Spirulina peptides first increased then decreased with the increase of the DH，the hydroxyl radical scavenging ability first decreased then increased，when reached maximum then decreased，however the foaming stability，the emulsification，emulsifying stability decreased with the increase of the DH.This showed that the DH was not the higher the better in the production of Spirulina peptides，and the best DH must be determined according to the need of the products to get a better physicochemical properties and antioxidant abilities.

Spirulina peptide；degree of hydrolysis；emulsifying activity；foaming activity；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0196-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.031

2015－08－03

馬艷芳（1989-），女，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程與酶工程，E-mail：ffang0625@126.com。

孫中濤（1973-），男，博士，副教授，研究方向：發(fā)酵工程與酶工程，E-mail：zhtsun@sdau.edu.cn。

國(guó)家海洋局海洋生物活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助（MBSMAT-2014-05）。