曾麗萍，王心詩(shī)，吳素蕊，樊　建，趙天瑞，*（.昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院，云南昆明650500；.中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南昆明6503）

云南銅色牛肝菌多糖分離純化及抗氧化活性研究

曾麗萍1，王心詩(shī)1，吳素蕊2，樊建1，趙天瑞1，*
（1.昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院，云南昆明650500；2.中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南昆明650223）

通過(guò)對(duì)銅色牛肝菌多糖進(jìn)行分離純化和活性分析，為野生銅色牛肝菌的進(jìn)一步推廣和應(yīng)用提供理論依據(jù)。本研究采用熱水浸提法提取的粗多糖為原料，并利用DEAE-52纖維素柱層析和SephadexG-100柱層析對(duì)所獲得的粗多糖進(jìn)行純化，得到兩種單一多糖PB-1A、PB-2A，比旋光度和紫外掃描方法鑒定多糖的純度。通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)體系研究，比較銅色牛肝菌粗多糖及純化后的多糖PB-1A、PB-2A對(duì)羥基自由基、DPPH自由基的清除活性以及總還原能力。結(jié)果表明：銅色牛肝菌多純化糖前后的對(duì)羥基自由基、DPPH自由基的清除活性以及總還原能力呈現(xiàn)一定效量關(guān)系，且均為PB-2A＞PB-1A＞銅色牛肝菌粗多糖。

云南銅色牛肝菌，多糖，熱水浸提法，分離純化，抗氧化

銅色牛肝菌（Boletus aereus Fr.ex Bull）又名黑牛肝菌、煤色牛肝菌，是一種食藥兩用的野生真菌［1］，具有“低脂肪、低熱量、高蛋白”的特點(diǎn)，廣泛分布在我國(guó)的云南、四川、貴州等地區(qū)［2］。

近來(lái)，許多研究者對(duì)牛肝菌多糖的活性進(jìn)行了研究，為牛肝菌的開(kāi)發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。趙云霞［3］通過(guò)抗氧化實(shí)驗(yàn)證明黑牛肝菌多糖對(duì)急性酒精損傷小鼠的心臟和脾臟有一定的保護(hù)作用；楊立紅［4］利用熱水浸提的野生食用牛肝菌多糖的研究表明純化后的多糖總抗氧化性高于粗多糖；黃俊麗［5］對(duì)松茸、黑牛肝菌、雙孢白蘑菇三種食用菌研究表明黑牛肝菌的還原力最強(qiáng)。在野生牛肝菌市場(chǎng)中，銅色牛肝菌數(shù)量相對(duì)較大，商品價(jià)值高，有降血壓、血脂、血糖及抗氧化等功效，具有較強(qiáng)的開(kāi)發(fā)潛力和更廣的市場(chǎng)前景［6］。

本文采用熱水浸提法對(duì)云南野生銅色牛肝菌中的多糖進(jìn)行提取，利用DEAE-52纖維素層析和SephadexG-100凝膠層析進(jìn)行分級(jí)純化，并通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)研究，考查了粗多糖及純化后多糖的抗氧化活性，以期為進(jìn)一步研究其構(gòu)效關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也為云南地區(qū)銅色牛肝菌多糖的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)及指導(dǎo)意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

野生銅色牛肝菌樣品購(gòu)自于云南省易門縣；DEAE-52纖維素柱層析填料北京索萊寶科技有限公司；SephadexG-100柱層析填料北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純。

Alpha 1-2冷凍干燥機(jī)北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；AL204分析電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司；UV-1800PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上海美普達(dá)儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市科析儀器有限公司；LXJ-Ⅱ飛鴿大容量離心機(jī)

上海安亭科學(xué)儀器廠；OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海愛(ài)朗儀器有限公司；WZZ-2A自動(dòng)數(shù)顯旋光儀上海精賢光電科技有限公司；BSZ-100自動(dòng)部分收集器重慶杰恒蠕動(dòng)泵有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)流程新鮮銅色牛肝菌樣品→冷凍干燥后粉碎（過(guò)60目篩）→熱水浸提粗多糖溶液→Sevag法除蛋白→硫酸蒽酮法測(cè)多糖含量→精制多糖（透析袋截流分子量7000 u、蒸餾水48 h、冷凍干燥備用）→離子交換柱層析（苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)）→凝膠過(guò)濾（苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)）→純度鑒定→抗氧化活性分析。

1.2.2銅色牛肝菌粗多糖的提取參照王心詩(shī)［7］對(duì)銅色牛肝菌熱水浸提的最佳提取工藝。本實(shí)驗(yàn)將新鮮的野生銅色牛肝菌于冷凍干燥機(jī)中凍干后粉碎至60目備用。準(zhǔn)確稱取適量的樣品，在料液比1∶40 g/mL、水浴溫度49℃、浸提時(shí)間3.6 h的條件下浸提，反復(fù)浸提2次，過(guò)濾，合并濾液，濃縮，得到多糖水提物。

1.2.3分離純化及純度驗(yàn)證

1.2.3.1DEAE-52纖維素柱層析稱取25 mg已脫出蛋白的牛肝菌粗多糖溶于5 mL蒸餾水，進(jìn)行DEAE-52纖維素層析柱（2.6 cm×60 cm）純化粗多糖，以5000 r/min離心10 min，取上清液上樣，依次用蒸餾水、0.3、0.5 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速控制為1 mL/min，分管收集，每管5 mL，取1 mL利用苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)［8］，直至檢測(cè)不到糖組分的流出。收集合并主峰的洗脫液繪制洗脫曲線。將超純水洗脫部分濃縮后透析，冷凍干燥，備用。

1.2.3.2SephadexG-100柱層析稱取20 mg DEAE-52分離后的多糖組分，溶于5 mL蒸餾水進(jìn)行SephadexG-100凝膠層析柱（1.6 cm×80 cm）純化粗多糖，上樣，用蒸餾水進(jìn)行洗脫，流速控制為0.5 mL/min，分管收集，每管4 mL，取1 mL利用苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)，直至檢測(cè)不到糖組分的流出，收集合并主峰的洗脫液，繪制洗脫曲線。收集相應(yīng)組分凍干備用，進(jìn)行進(jìn)一步研究。

1.2.3.3比旋光度測(cè)定參照閆景坤［9］方法并略改。在20℃589 nm鈉光下測(cè)定30%、60%、80%濃度乙醇沉淀物的旋光度值。

1.2.3.4紫外分光度法［10］將純化后的多糖配制成1 mol/L溶液，在190～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外光譜掃描，以蒸餾水作空白。

1.2.4銅色牛肝菌多糖的抗氧化活性研究

綠原酸是咖啡生豆的主要成分，咖啡生豆經(jīng)烘焙后，綠原酸含量明顯降低。這是由于綠原酸是由奎寧酸和肉桂酸(或咖啡酸、阿魏酸、香豆酸)形成的內(nèi)酯，其性質(zhì)不穩(wěn)定，在整個(gè)烘焙加熱過(guò)程中，綠原酸酯鍵斷裂，生成一系列非揮發(fā)性的內(nèi)酯和揮發(fā)性的酚類(如兒茶酚，愈創(chuàng)木酚等)[12]，使得綠原酸含量急劇下降。

1.2.4.1羥基自由基清除能力參照Smirnoff等［11］方法并略作改動(dòng)，測(cè)定銅色牛肝菌多糖對(duì)羥基自由基清除活性。分別吸取1 mL不同濃度的銅色牛肝菌多糖溶液于10 mL離心管中，加入1 mL 9.0 mmol/L FeSO4溶液和1 mL 9.0 mmol/L H2O2溶液，搖勻、靜置10 min，加入1 mL 9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，充分混勻，于37℃恒溫水浴鍋中保溫30 min，以3000 r/min離心15 min，吸取上層清液于比色皿中，在510 nm處測(cè)定其吸光值。每個(gè)樣品做三組平行，以蒸餾水調(diào)零。羥基自由基清除率的計(jì)算公式如下：

羥自由基清除率（%）=［A0-（Ax-AX0）］/A0×100

式中：Ax：樣品組的吸光值；A0：空白對(duì)照組；AX0：樣品對(duì)照組吸光值。

1.2.4.2DPPH自由基清除能力參照李波等［12］方法并略作改動(dòng)，測(cè)定銅色牛肝菌多糖對(duì)DPPH自由基清除活性。分別吸取1 mL不同濃度的多糖溶液，加入2 mL 0.05 mmol/L的DPPH-甲醇溶液，充分混合，并在暗處反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定其吸光值。每個(gè)樣品進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn)，DPPH自由基清除率的計(jì)算公式如下：

DPPH清除率（%）=［A0-Ax）］/A0×100

式中：Ax：樣品組的吸光值；A0：空白對(duì)照組的吸光值。

1.2.5數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)使用Oringe 8.5軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異性分析使用SPSS 19.0軟件，其結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（，n=3）。

2　結(jié)果與分析

2.1銅色牛肝菌多糖的分離純化

2.1.1DEAE-52纖維素柱層析將已脫除蛋白多糖經(jīng)過(guò)蒸餾水、0.3、0.5 mol/L NaCl溶液依次洗脫，洗脫曲線如圖1所示。經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析后得到三個(gè)洗脫峰分別命名為PB-1（管號(hào)10～22）、PB-2（管號(hào)110～132）、PB-3（管號(hào)209～225）。其中，PB-1與PB-2的峰面積相對(duì)較大，含量較多，收集相應(yīng)部分的洗脫液，透析后冷凍干燥，用于進(jìn)一步純化。

圖1　銅色牛肝菌多糖的DEAE-52柱層析洗脫曲線Fig.1　Elution profile of crude polysaccharides extracted from B.aereus on DEAE-52 column

2.1.2SephadexG-100凝膠柱層析通過(guò)SephadexG-100凝膠柱層析對(duì)PB-1、PB-2進(jìn)一步純化，繪制洗脫曲線如圖2所示。PB-1、PB-2經(jīng)過(guò)SephadexG-100分離后仍為單一對(duì)稱峰，說(shuō)明二者在分子量組成上是均一的。將其分別命名為PB-1A（管號(hào)8～21）和PB-2A（管號(hào)109～122），收集相應(yīng)的洗脫液、濃縮，凍干，并用于純度鑒定，進(jìn)行抗氧化性研究。

圖2　PB-1、PB-2經(jīng)SephadexG-100的水洗脫曲線Fig.2　The eluted curve with water of PB-1and PB-2 on SephadexG-100

2.2純度驗(yàn)證

2.2.1比旋光度采用比旋光度法對(duì)PB-1A、PB-2A分別進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果如表1所示。在三種乙醇濃度下，PB-1A、PB-2A的比旋光度基本相同，表明兩者為相對(duì)均一多糖，其比旋光度分別為+42.33°、+31.67°。

表1　不同濃度乙醇沉淀銅色牛肝菌多糖的比旋光度Table 1　Specificrotator power of polysaccharides of Boletus aereus precipitated with several concentration ethanol

2.2.2紫外掃描圖將經(jīng)SephadexG-100分離純化后的多糖進(jìn)行紫外掃描，其掃描結(jié)果如圖3所示。銅色牛肝菌多糖中的PB-1A、PB-2A在260、280 nm波長(zhǎng)處都沒(méi)有明顯的特征吸收峰，表明樣品中均不含有核酸和蛋白質(zhì)，在620 nm處無(wú)吸收峰則表明均不含色素類物質(zhì)。

2.3銅色牛肝菌粗多糖及純化后的PB-1A、PB-2A多糖的抗氧化活性比較

2.3.1羥基自由基清除能力羥基自由基作為活性氧中最活潑的自由基，其毒性也最大，它幾乎能與活細(xì)胞中任何分子快速發(fā)生反應(yīng)［14］。由圖4可知，PB-1A、PB-2A和銅色牛肝菌粗多糖的羥基自由基清除活性隨著多糖的濃度增加而逐步增強(qiáng)。其中，PB-1A、PB-2A和銅色牛肝菌粗多糖的IC50值分別為0.96、0.67、3.29 mg/mL。經(jīng)方差分析可知，三種多糖的羥基自由基清除率具有顯著差異（p＜0.05），在同等濃度下，羥基自由基清除能力順序?yàn)椋篜B-2A＞PB-1A＞銅色牛肝菌粗多糖。

圖4　銅色牛肝菌多糖羥基自由基清除活性Fig.4　Hydroxyl radical scavenging capacity of polysaccharide from Boletus aereus

2.3.2DPPH自由基清除能力通過(guò)DPPH·乙醇溶液在波長(zhǎng)517 nm處有紫色團(tuán)的強(qiáng)吸收峰，當(dāng)存在自由基清除劑時(shí)，吸收峰減弱或消失，因而可以通過(guò)測(cè)定吸收減弱程度來(lái)評(píng)價(jià)樣品清除自由基的能力［15］。由圖5可知，PB-1A、PB-2A和銅色牛肝菌粗多糖的DPPH自由清除活性隨著多糖的濃度增加而逐步增強(qiáng)。其中，PB-1A、PB-2A和銅色牛肝菌粗多糖的IC50值分別為0.34、0.14、0.60 mg/mL。經(jīng)方差分析可知，三種多糖的DPPH自由基清除率具有顯著差異（p＜0.05），在同等濃度下，DPPH自由基清除能力順序?yàn)椋篜B-2A＞PB-1A＞銅色牛肝菌粗多糖。

圖5　銅色牛肝菌多糖DPPH自由基清除活性Fig.5　DPPH scavenging capacity of polysaccharide from Boletus aereus

2.3.3還原力抗氧化劑的還原力與其抗氧化性活性之間有著密切的關(guān)系，即可以通過(guò)測(cè)定其還原力的強(qiáng)度來(lái)說(shuō)明其抗氧化活性［16］。由圖6可知，PB-1A、PB-2A和銅色牛肝菌粗多糖的還原能力隨著多糖的濃度增加而逐步增強(qiáng)，經(jīng)方差分析可知，三種多糖的還原力具有顯著差異（p＜0.05），在同等濃度下，還原能力順序?yàn)椋篜B-2A＞PB-1A＞銅色牛肝菌粗多糖。

圖6　銅色牛肝菌多糖還原能力Fig.6　Reducing power of polysaccharide from Boletus aereus

3　結(jié)論

通過(guò)DEAE-52離子交換和ScphadexG-l00凝膠過(guò)濾將水提的銅色牛肝菌多糖活性組分進(jìn)行分級(jí)純化，得到兩種較純的單一多糖PB-1A、PB-2A。比較銅色牛肝菌粗多糖、PB-1A及PB-2A的自由基清除能力和還原力，其抗氧化能力為PB-2A＞PB-1A＞銅色牛肝菌粗多糖。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探討純化方法及抗氧化作用，確定了酸性純多糖PB-2A的抗氧化作用明顯優(yōu)于其他兩種。

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Purification and antioxidant activity of polysaccharide from Boletus aereus in Yunnan

ZENG Li-ping1，WANG Xin-shi1，WU Su-rui2，F(xiàn)AN Jian1，ZHAO Tian-rui1，*
（1.Yunnan Institute of Food Safety，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China；2.Kunming Edible Fungi Institute of All China Federation of Supply of Marketing Cooperative，Kunming 650223，China）

The purification and activity analysis of Boletus aereus polysaccharides can provide a theoretical basis for the further application and popularization of B.aereus.In the present work，crude polysaccharides of Bronze Boletus was extracted by hot water and then successively purified with DEAE-52 ion exchange column and SephadexG-100 gel permeadun column.Two polysaccharides，named PB-1A and PB-2A，were obtained after purification.The purity of obtained polysaccharide was determined by specific rotation method and UV spectral scanning.The total reducing power，hydroxyl free radical and DPPH free radical scavenging activity of crude polysaccharides，PB-1A and PB-2A were determined by in vitro antioxidant evaluation system.The results demonstrated that the total reducing power，hydroxyl free radical and DPPH free radical scavenging activity of B.aereus polysaccharides before and after purification showed a dose-dependent manner，with activities being PB-2A＞PB-1A＞crude polysaccharides of B.aereus.

Boletus aereus of Yunnan；polysaccharide；extraction with hot water；separation and purification；antioxidant

TS201.1

A

1002-0306（2016）04-0151-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.021

2015－07－27

曾麗萍（1990-），女，在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工，E-mail：825767453@qq.com。

趙天瑞（1964-），男，大學(xué)本科，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工，E-mail：food363@163.com。

國(guó)家科技支撐科技課題（2013BAD16B01）。