馬　晨，李建國，程　景（.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心，海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，農(nóng)業(yè)部熱作產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室，海南?？?70；.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心，黑龍江哈爾濱50090）

沙門氏菌在鮮切蔬菜中生長行為及其預測模型構(gòu)建

馬晨1，李建國1，程景2
（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院分析測試中心，海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，農(nóng)業(yè)部熱作產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室，海南?？?71101；2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心，黑龍江哈爾濱150090）

為揭示沙門氏菌在鮮食蔬菜或調(diào)味蔬菜中的生長情況，以蒜苗、香菜、西紅柿、黃瓜和小蔥為實驗對象，點植接種兩株沙門氏菌混合菌液（Salmonella enteritidis ATCC 13076和S.newport ATCC 6962），研究不同接種劑量下沙門氏菌在鮮切蔬菜中生長情況，考察不同溫度下沙門氏菌在鮮切黃瓜中的動態(tài)生長情況，并構(gòu)建生長模型。結(jié)果表明：4℃下，沙門氏菌在所試鮮切蔬菜中均不生長。28℃，高接種劑量下（2.0 log CFU/g和3.0 log CFU/g），沙門氏菌在各種蔬菜中的生長勢（δ）在4.25～5.84 log CFU/g之間，表明其在各種蔬菜中生長良好（菌落數(shù)量＞7.0 log CFU/g）。1.0 log CFU/g接種劑量下，除了黃瓜外，沙門氏菌在其他蔬菜中生長良好（菌落數(shù)量約5.0 log CFU/g）。微量接種劑量0.1 log CFU/g，小蔥和番茄中沙門氏菌長勢尚好（δ＞0.5 log CFU/g），其他蔬菜中沙門氏菌不生長（δ＜0.5 log CFU/g）。采用Baranyi模型對實測數(shù)據(jù)進行擬合，結(jié)果顯示：7、15、20和25℃下沙門氏菌在鮮切黃瓜中的最大比生長速率（μmax）分別為0.026、0.11、0.14和0.29 h-1；7℃和15℃時，遲滯時間分別為24.33 h和9.44 h，20℃和25℃時不經(jīng)歷遲滯期，直接進入對數(shù)生長期。采用次級模型Ratkowsky方程描述最大生長速率和儲藏溫度的關(guān)系，模型可靠性較好。所以，蔬菜品種、接種劑量和儲藏溫度影響沙門氏菌在鮮切蔬菜中的生長。

沙門氏菌，鮮切蔬菜，調(diào)味蔬菜，黃瓜，模型構(gòu)建

沙門氏菌屬是最常見的食源性致病菌之一，其危害范圍大，可引起各類農(nóng)產(chǎn)品污染。據(jù)估計，美國每年源于沙門氏菌屬細菌感染的病例約140萬［1］。我國每年發(fā)生的細菌性食物中毒事件中，由沙門氏菌引起的食物中毒也屢居首位［2］。所以，關(guān)注農(nóng)產(chǎn)品上沙門氏菌污染情況顯得十分重要。除了畜禽等動物性產(chǎn)品，近年來，歐美國家不斷爆發(fā)新鮮果蔬被沙門氏菌污染事件，并逐年增長［3-5］。生菜、黃瓜、番茄、瓜類、菠菜、豆芽和果蔬沙拉等都曾分離出沙門氏菌［4-5］。為了控制沙門氏菌污染事件的發(fā)生，大量學者研究了不同沙門氏菌血清型在各類蔬菜上的存活和生長情況，并開發(fā)了多種沙門氏菌防控措施［5-7］。因而，果蔬中致病菌的研究成為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全領(lǐng)域的研究熱點之一。

由于我國食品消費方式與歐美國家相差較大，大多蔬菜均經(jīng)過熱加工處理后才食用，所以致病菌污染問題一直未受到重視［7］。但是，隨著人們飲食觀念的轉(zhuǎn)變，蔬菜沙拉、生食蔬菜等逐漸受到人們的喜愛。另外，調(diào)味蔬菜如香菜、小蔥和蒜苗等是涼拌菜和各類熟菜的必要搭配，一般不經(jīng)過處理，清洗切碎后直接食用。目前，我國關(guān)于新鮮蔬菜上致病菌爆發(fā)事件的報道較少，但是研究生食和調(diào)味蔬菜上致病菌的生長情況，將為農(nóng)產(chǎn)品微生物定量風險評估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也是保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要方面。

本實驗選取鮮食蔬菜和調(diào)味蔬菜蒜苗、香菜、西紅柿、黃瓜和小蔥為實驗對象，研究沙門氏菌在幾類鮮切蔬菜中的生長情況，研究不同溫度下沙門氏菌在鮮切黃瓜中的生長情況，并構(gòu)建生長模型。本研究將為蔬菜中沙門氏菌的污染防控提供科學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蒜苗、香菜、西紅柿、黃瓜和小蔥均購于?？谑修r(nóng)貿(mào)市場，運回實驗室后立即實驗或者放置冰箱4℃不超過12 h；沙門氏菌Salmonella enteritidis ATCC 13076，S.newport（ATCC 6962；西紅柿爆發(fā)分離菌株）均購自美國模式培養(yǎng)物保藏中心（American type culture collection，ATCC）。

HVE-50型自動滅菌鍋日本Hirayama；SJ-CJ-1FD型超凈工作臺蘇潔凈化；BHC-1300IIB2型蘇州金凈生物安全柜蘇州金凈；PYX-250S型生化培養(yǎng)箱廣東韶關(guān)科力實驗儀器有限公司；BagMixer 400拍打式勻質(zhì)器法國INTERSCIENCE公司。

1.2樣品處理及接種方法

1.2.1蔬菜樣品處理新鮮蔬菜去掉受損葉片，自來水洗凈瀝干。在無菌室用滅菌刀具將其切成2 cm× 2 cm×2 cm立方體或長條，置于200 mg/kg次氯酸鈉溶液10 min，無菌水漂洗4次，取出后置于無菌超凈工作臺中自然晾干。稱取10 g樣品于無菌樣品袋中，備用。

1.2.2接種液制備及樣品接種菌種凍干培養(yǎng)物劃線接種于大豆酪蛋白瓊脂（TSA）固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落接種于胰酪胨大豆肉湯（TSB）液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24 h。4℃，4000×g離心10 min，棄上清，用0.1%蛋白胨水懸浮，按上述條件離心2次。等體積混合兩種菌株懸浮液，稀釋菌液濃度至8.0 log CFU/mL左右。梯度稀釋制成稀釋度為1.0、2.0、3.0和4.0 log CFU/mL菌液，待用。

取1 mL接種液，用50 μL移液槍分20次均勻點植接種在樣品中，置于生物安全柜中2 h自然晾干，使接種液中的菌體充分附著在樣品上［8］。不同鮮切蔬菜中樣品最終接種量大約為0.1、1.0、2.0和3.0 log CFU/g，儲藏溫度為4℃和28℃。研究不同溫度條件下鮮切黃瓜生長情況的實驗中，沙門氏菌最終接種量為3.0 log CFU/g沙門氏菌，儲藏溫度為7、15、20和25℃。

1.3沙門氏菌計數(shù)方法和應用模型

1.3.1沙門氏菌計數(shù)不同鮮切蔬菜中沙門氏菌生長情況的實驗中，4℃儲存6 d后計數(shù)，28℃儲存2 d后計數(shù)。不同溫度下鮮切黃瓜中沙門氏菌生長情況實驗中，儲藏7 d，7℃每天取樣，15和20℃每12 h取樣，25℃第1 d每4 h取樣，后期每12 h取樣。定時取樣，加入90 mL無菌BPW緩沖蛋白胨水，勻質(zhì)拍打2 min后，無菌生理鹽水梯度稀釋，選擇合適的梯度稀釋液0.1 mL涂布亞硫酸鉍瓊脂（BS）和木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD），37℃培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計平板上沙門氏菌數(shù)量，以log CFU/g為單位［8］。

1.3.2應用模型應用ComBase數(shù)據(jù)庫的在線軟件DMFit version 2015（ComBase online http：//browser. combase.cc/DMFit.aspx）擬合沙門氏菌在不同溫度下鮮切黃瓜中的生長情況。應用Baranyi模型（初級模型）［8］，該模型表述如下：

式中：Y0，Ymax，Y（t）分別表示初始菌數(shù)、最大菌數(shù)和t時間菌數(shù)，單位為log CFU/g。μmax表示比生長速率（h-1），λ表示遲滯時間（h），q0表示初始時細胞的生理狀態(tài)。

采用次級模型Ratkowsky square-root描述μ與儲藏溫度的關(guān)系［9］，模型表述如下：

式中：μmax表示比生長速率（h-1），T表示實測溫度，T0表示微生物生長的理論最低溫度，℃。

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

生長勢（δ）計算方法為沙門氏菌終濃度（4℃第2 d和28℃第6 d）與初始濃度差值，均以log CFU/g為單位。當δ＞0.5 log CFU/g時，認為食品基質(zhì)可以支持致病菌生長；δ＜0.5 log CFU/g時，認為食品基質(zhì)不支持致病菌的生長［6］。以上數(shù)據(jù)應用DMFit軟件數(shù)據(jù)擬合，Origin 8.0軟件作圖和分析。次級模型采用IPMP version 2013軟件進行擬合。

每種蔬菜做兩份樣品三個重復。數(shù)據(jù)顯著性分析采用基于Tukey檢驗的單因素方差分析（ANOVA）（p≤0.05判斷為差異顯著，p＞0.05判斷為差異不顯著，由Origin 8.0分析所得）。

采用均方根誤差（Root Mean Square Error，RMSE）、準確因子（Accuracy factor，Af）和偏差因子（Bias factor，Bf）對預測值和實測值進行分析檢驗，以評價建立的動力學模型的可靠性。RMSE越小，表示模型預測值的離散程度越小。偏差因子（Bf）表示模型的結(jié)構(gòu)偏差（Structural deviations），即低估預測或高估預測的程度，一般0.90＜Bf＜1.05，模型為最好；0.70＜Bf＜0.90 或1.06＜Bf＜1.15，模型為可接受；Bf＜0.70或Bf＞1.15模型不可接受。偏差因子不能表示參數(shù)估計的平均準確性，因此常結(jié)合準確因子（Af）來對模型進行數(shù)學檢驗，Af值越大表示平均值準確性越低，而Af值等于1表示預測值與觀測值之間完全吻合。RMSE、準確因子和偏差因子表達式如下：

式中，Nobs表示沙門氏菌數(shù)量實測值，Npred表示應用模型預測得到的沙門氏菌相應數(shù)量，n是實驗次數(shù)。

2　結(jié)果與討論

2.1沙門氏菌在鮮切蔬菜中生長情況

4℃儲藏6 d后，沙門氏菌在各類鮮切蔬菜中的數(shù)量與初始量相當（圖1a），表明此溫度下沙門氏菌不生長。與本文相似，其他報道證明，4～5℃條件下沙門氏菌在蘋果、芒果、西瓜、卷心菜、生菜等鮮切果蔬中生長也受到抑制［10-12］。圖1b表示28℃儲存2 d后，不同接種劑量下，沙門氏菌在5種鮮切蔬菜中的生長情況。結(jié)果顯示，隨著沙門氏菌接種劑量增大，每種蔬菜中沙門氏菌的最終數(shù)量基本呈上升趨勢（同初始量相比）。高接種劑量下（2.0 log CFU/g和3.0 log CFU/g），各種蔬菜中沙門氏菌最終數(shù)量均超過7.0 log CFU/g。1.0 log CFU/g接種劑量下，黃瓜中沙門氏菌幾乎沒有生長，其他蔬菜中最終沙門氏菌數(shù)量在5.0 log CFU/g左右。微量接種劑量0.1 log CFU/g下，小蔥和番茄中沙門氏菌長勢尚好，其他蔬菜中沙門氏菌生長較差。所以，蔬菜品種和接種劑量影響沙門氏菌在鮮切蔬菜中的生長行為。

圖1　沙門氏菌在不同鮮切蔬菜中生長情況（4℃和28℃）Fig.1　Behaviour of Salmonella sp.in different fresh-cut vegetables（4℃and 28℃）

除了番茄外（pH4.2～4.5），其他蔬菜pH均大于6.0，均在沙門氏菌生長的最適范圍（pH6.2～7.2）［6］。28℃，沙門氏菌在各種鮮切蔬菜中的生長勢（growth potential，δ）如表1所示。SantAna等報道［6］，當δ＞0.5 log CFU/g時，認為食品基質(zhì)可以支持致病菌的生長；δ＜0.5 log CFU/g時，認為食品基質(zhì)不支持致病菌的生長。表1結(jié)果顯示，1.0、2.0和3.0 log CFU/g接種劑量下（1.0 log CFU/g時黃瓜除外），沙門氏菌在各種蔬菜中的生長勢在3.39～5.84 log CFU/g之間，表明各種蔬菜均是沙門氏菌生長的良好基質(zhì)。微量接種劑量下（0.1 log CFU/g），沙門氏菌在小蔥和番茄中生長勢較高，可支持沙門氏菌生長，其他三種蔬菜不支持沙門氏菌生長（δ＜0.5 log CFU/g）。沙門氏菌在5種蔬菜中的生長勢隨著接種劑量的增加而增加，在最高接種劑量3.0 log CFU/g時，稍有下降。差異顯著性分析表明，同種蔬菜不同接種劑量下的沙門氏菌生長勢存在顯著差異（p＜0.05），相同接種劑量下不同蔬菜間的沙門氏菌生長勢也存在明顯差異（p＜0.05）。

沙門氏菌在黃瓜和番茄上的生長情況研究較多，特別是沙門氏菌與西紅柿相互作用的分子機制已揭示。Pan等報道［13］，25～35℃條件下，番茄中沙門氏菌數(shù)量約增長5～6 log CFU/g（初始接種劑量為2.0 log CFU/g）。10、20和30℃下，沙門氏菌可在黃瓜中生長，數(shù)量約增長1.6～1.8 log CFU/g（20和30℃）［14］。Campbell等［15］報道了由香菜引起的沙門氏菌爆發(fā)事件，常溫下Thompson血清型菌株在切碎香菜中生長迅速，26℃下數(shù)量約增長3～4 log CFU/g。另外，生蔥中也曾分離出鼠傷寒沙門氏菌和紐波特沙門氏菌［16］。目前還沒有蒜苗中沙門氏菌的研究。本實驗得到的結(jié)果與以上報道基本相似。

表1　沙門氏菌在鮮切蔬菜中的生長勢（28℃）Table 1　Growth potential of Salmonella sp.in five fresh-cut vegetables（28℃）

2.2不同溫度下沙門氏菌在鮮切黃瓜中的生長情況黃瓜是深受人們喜愛的蔬菜，常用來涼拌或生食。因而，黃瓜上的微生物質(zhì)量安全值得關(guān)注。沙門氏菌在7、15、20和25℃條件下的生長曲線如圖2所示（接種劑量3.0 log CFU/g）。7℃下，沙門氏菌在鮮切黃瓜中生長緩慢，經(jīng)過較長的遲滯期。其他溫度下，沙門氏菌數(shù)量經(jīng)過對數(shù)生長期，并逐漸到達穩(wěn)定期。采用Baranyi和Robert模型擬合不同溫度下沙門氏菌在鮮切黃瓜中的生長參數(shù)，結(jié)果如表2所示?；貧w系數(shù)（R2）在0.93～0.98，說明此模型對實驗數(shù)據(jù)的擬合度較好。比生長速率（μmax）隨著溫度的增加而增加。從25℃到7℃，μmax分別為0.29、0.14、0.11和0.026 h-1。隨著儲藏溫度的升高，沙門氏菌的生長遲滯期逐漸降低，7℃和15℃時，遲滯時間（λ）分別為24.33 h和9.44 h，20℃和25℃時，沙門氏菌生長不經(jīng)歷遲滯期，數(shù)量直接升高。隨著儲藏溫度的升高，沙門氏菌最大菌落數(shù)（Nmax）也隨之增大（見表2）。所以，儲藏溫度影響沙門氏菌在鮮切蔬菜中的生長行為。降低儲藏溫度是降低細菌污染和蔬菜保鮮的有效方式。

表2　不同溫度下沙門氏菌在鮮切黃瓜中生長參數(shù)的擬合結(jié)果Table 2　Growth parameters of Salmonella in cucumber stored at different temperatures

采用次級模型Ratkowsky square-root模型描述μmax與儲藏溫度的關(guān)系。Ratkowsky模型的均方根誤差（RMSE）為0.068。不同溫度下，沙門氏菌在鮮切黃瓜中生長觀測值的偏差因子和準確因子如表3所示。本實驗的研究結(jié)果表明，各組Bf值都在0.90～1.05之間，本實驗的模型屬于最好類型。Af在1.01～1.22之間，接近于1，說明預測值和實測值吻合性較好。所以，建立的生長預測模型能較好地預測7～25℃下沙門氏菌在鮮切黃瓜上的生長狀況。

圖2　不同溫度下沙門氏菌在鮮切黃瓜中生長趨勢Fig.2　Growth of Samonella on cucumber at different temputure

表3　不同溫度下沙門氏菌在黃瓜中生長預測值的偏差因子和準確因子Table 3　Mathematical validations of secondary model of Salmonella grown on cucumber

本文得到的結(jié)果與文獻［8］中沙門氏菌在即食生菜上生長參數(shù)的研究結(jié)果相似。文獻［8］中，7、15、20 和25℃下，三株沙門氏菌在生菜中的平均比生長速率分別為0.06、0.12、0.16和0.31 h-1。遲滯時間分別為26.7、5.9、4.5和1.9 h。本文得到的沙門氏菌在黃瓜中的最大比生長速率和遲滯時間與此報道相似。與羅嬋等的報道相比［10］，相同溫度下沙門氏菌在鮮切生菜和卷心菜中的生長參數(shù)均低于本文得到的相關(guān)參數(shù)。多種因素共同影響沙門氏菌在蔬菜中的生長情況，比如菌株血清型、接種劑量、蔬菜品種、蔬菜基質(zhì)中背景微生物數(shù)量，蔬菜切割面大小等［11］。所以，本實驗的結(jié)果與此文獻的差異可能由多種因素引起，蔬菜品種和沙門氏菌菌株血清型可能是主要原因。

3　結(jié)論

本研究不同接種劑量下沙門氏菌在鮮切蔬菜中生長情況，4℃下，沙門氏菌均不生長。28℃，沙門氏菌在各種蔬菜中生長良好。微量接種劑量0.1 log CFU/g下，小蔥和番茄中沙門氏菌長勢尚好（δ＞0.5 log CFU/g）。選用Baranyi模型為初級模型，擬合鮮切黃瓜中沙門氏菌在7、15、20和25℃的生長參數(shù)（相關(guān)系數(shù)R2≥0.93）。采用次級模型Ratkowsky方程描述最大生長速率和儲藏溫度的關(guān)系，通過均方根誤差、準確因子和偏差因子對模型進行可靠性評價，該模型的可靠性較好。本結(jié)果將為鮮食蔬菜上微生物定量風險評估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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Behaviour of Salmonella sp.on fresh-cut vegetables and predictive models for growth

MA Chen1，LI Jian-guo1，CHENG Jing2
（1.Hainan Provincial Key Laboratory of Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables，Ministry of Agriculture Laboratory of Quality&Safety Risk Assessment for Tropical Products，Analysis and Testing Center Chinese Academy of Tropical Agriculture Science，Haikou 571101，China；2.Quality Inspection and Test Center for Agricultural Products of Heilongjiang Province，Harbin 150090，China）

In order to investigate the behaviour of Salmonella in raw-eaten vegetables or seasoned vegetables，a cocktail of two serovars（Salmonella enteritidis ATCC 13076 and S.newport ATCC 6962）were spot inoculated into fresh-cut vegetables（garlic sprout，cilantro，tomato，cucumber and shallot）with four inoculum levels（0.1，1.0，2.0 and 3.0 log CFU/g）.Growth kinetics of Salmonella in fresh-cut cucumber at different temperatures were also studied and predictive models were used for fitting the growth data.Results indicated that no obvious growth of Salmonella was observed in all the tested vegetables at 4℃for 6 days.At 28℃，growth potential（δ）of Salmonella in all tested vegetables were between 3.39 and 5.28 at the high inoculum levels of 2.0 and 3.0 log CFU/g，indicating good growth of Salmonella in all vegetables（maximum populations＞7.0 log CFU/g）.At 1.0 log CFU/g inoculum levels，Salmonella grew well in all tested vegetables with maximum populations of about 5.0 log CFU/g，except in cucumber at the low inoculum levels of 0.1 log CFU/g，Salmonella grew only in tomato and shallot（δ＞0.5 log CFU/g），and no obvious growth was observed in other three vegetables（δ＜0.5 log CFU/g）.Growth curves for each culture condition in cucumber were built separately by fitting data to the Baranyi model.The results indicated that specific growth rate（μmax）of Salmonella in fresh-cut cucumber were 0.026，0.11，0.14 and 0.29 h-1at 7，15，20 and 25℃respectively and lag time was 24.33 h and 9.44 h at7℃and 15℃.However，there was no lag time at 20℃ and 25℃.The Ratkowsky square-root model was used to describe maximum growth rate as a function of storage temperature and the mathematical models were validated.Thus，vegetable kinds，inoculum dose and storage temperature all had an impact on the behaviour of Salmonella in fresh-cut vegetables.

Salmonella；fresh-cut vegetables；seasoned vegetable；cucumber；predictive model

2015-07-17

馬晨（1986-），女，博士，研究方向：食品和環(huán)境微生物，E-mail：mc19860112@163.com。

中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院院本級基本科研業(yè)務(wù)費專項資金（1630052014010）；海南省自然科學基金（20153163）；蔬菜產(chǎn)品未知危害因子識別與已知危害因子安全性評估（GJFP2015001）。

TS201.3

A

1002-0306（2016）04-0123-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.04.015