榮芳悅，張 宇，趙 宏，王宇亮，秦永麗，叢晶男（黑龍江省高校生物藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江佳木斯154007）

基于響應(yīng)面法的閃式提取樺褐孔菌多糖工藝優(yōu)化

榮芳悅，張 宇*，趙 宏，王宇亮，秦永麗，叢晶男
（黑龍江省高校生物藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江佳木斯154007）

利用響應(yīng)面法優(yōu)化樺褐孔菌多糖的閃式提取工藝。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以樺褐孔菌多糖的提取率為響應(yīng)值，以料液比、提取時(shí)間、提取電壓為主要考察因素，采用響應(yīng)面法優(yōu)化閃式提取樺褐孔菌多糖的最佳工藝參數(shù)。結(jié)果表明，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化得到料液比為1∶23，提取時(shí)間為86 s，提取電壓為150 V時(shí)，樺褐孔菌多糖的提取率最高，可達(dá)到8.52%。結(jié)論：閃式提取法適用于樺褐孔菌多糖的提取，該工藝具有方便、快速和高效的優(yōu)點(diǎn)。且經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化所得的最佳提取條件準(zhǔn)確可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

樺褐孔菌，多糖，閃式提取，響應(yīng)面法

樺褐孔菌［Inonotus obliquus（Fr.）Pilat］是一種食藥兩用型的真菌［1］，屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褐菌目、多孔菌科、褐臥孔菌屬，其主要分布在北緯45°～50°［2］，如北美、芬蘭、波蘭、俄羅斯、中國的黑龍江和吉林、日本等國家和地區(qū)［3］。樺褐孔菌是白樺樹、銀樺、赤楊等的樹干或樹皮下形成的不育的木腐菌［4］，外表呈黑灰色，有不規(guī)則的溝痕及深裂，質(zhì)硬且脆［5］。從16世紀(jì)開始，俄羅斯、波蘭、芬蘭等國家的民間就開始食用樺褐孔菌，用于防治多種疾?。?］。樺褐孔菌在俄羅斯以及東歐等地被當(dāng)作一種民間用藥，已被用于消化系統(tǒng)疾病，胃癌、結(jié)腸癌和肝癌，心血管疾病，糖尿病和病毒性疾病的治療［7］。據(jù)報(bào)道，樺褐孔菌中含有多種具有生物活性的有效成分，如多糖、三萜類化合物、樺褐孔菌醇、樺褐孔菌素、木脂素、黑色素等［8-10］，而其中，樺褐孔菌多糖作為樺褐孔菌重要的活性成分之一，因其具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤及降血糖［11-13］等多種生物活性而備受關(guān)注。

目前，真菌多糖的提取方法主要有熱水浸提法、酸提法、堿提法、酶提法、超聲波輔助提取法和微波輔助提取法［14］。其中，樺褐孔菌多糖的提取多采用傳統(tǒng)的熱水浸提法。近年來，閃式提取法已被廣泛應(yīng)用于植物以及微生物多糖的提取，如沙棘多糖［15］、香菇多糖［16］等。閃式提取法是依靠高速機(jī)械剪切力和超

動分子滲濾技術(shù)，在室溫及溶劑存在下數(shù)秒鐘內(nèi)把物料破碎至細(xì)微顆粒，并使有效成分迅速達(dá)到組織內(nèi)外平衡，以達(dá)到提取之目的。且閃式提取法具有快速、高效，操作簡便、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)［17-18］。

因此，本文采用閃式提取法提取樺褐孔菌多糖，并用響應(yīng)面分析法對閃式提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為樺褐孔菌多糖的提取尋找更加快速高效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樺褐孔菌子實(shí)體 黑龍江省高校生物藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；乙醇 分析純，山東利爾康消毒科技股份有限公司；雙蒸水 實(shí)驗(yàn)室自制。

FDU-1200型冷凍干燥機(jī) 上海愛朗儀器有限公司；KQ-5200型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FA2004N型電子分析天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；DL-5-B低速大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；HH-2電熱恒溫水浴鍋 蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司；JHBE-50S閃式提取器 北京金鼎科技發(fā)展有限公司；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；XFB-400小型中藥粉碎機(jī) 吉首市中誠制藥機(jī)械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樺褐孔菌多糖的提取 樺褐孔菌子實(shí)體經(jīng)過機(jī)械粉碎后，用體積分?jǐn)?shù)為88%的乙醇溶液在80℃條件下超聲2 h，離心（5000 r/min，15 min）后去除上清液，沉淀在60℃干燥12 h，得到脫脂的樺褐孔菌粉。取脫脂處理的樺褐孔菌粉50 g置于閃式提取器的提取罐內(nèi)，以水作為溶劑，在一定的料液比和一定的提取電壓下，用閃式提取器提取一定的時(shí)間后，提取液離心（5000 r/min，15 min）去掉沉淀，上清液減壓濃縮后加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，靜置24 h，次日經(jīng)過離心（5000 r/min，15 min）后收集沉淀，冷凍干燥，即得樺褐孔菌多糖。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 選擇對多糖提取影響較大的三個(gè)因素液料比、提取時(shí)間和提取電壓，每個(gè)因素選取五個(gè)水平，分別考察這三個(gè)因素對樺褐孔菌多糖提取率的影響。

1.2.2.1 料液比對提取率的影響 稱取經(jīng)過處理的樺褐孔菌粉50 g（5份）置于提取罐中，每份料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，提取時(shí)間80 s、提取電壓140 V，按1.2.1項(xiàng)下方法閃式提取多糖，分別計(jì)算樺褐孔菌多糖的提取率。

1.2.2.2 提取時(shí)間對提取率的影響 稱取經(jīng)過處理的樺褐孔菌粉50 g（5份）置于提取罐中，料液比為1∶20，提取電壓140 V，提取時(shí)間分別為50、60、70、80、90 s，按1.2.1項(xiàng)下方法閃式提取多糖，分別計(jì)算樺褐孔菌多糖的提取率。

1.2.2.3 提取電壓對提取率的影響 稱取經(jīng)過處理的樺褐孔菌粉50g（5份）置于提取罐中，料液比為1∶20，提取時(shí)間80 s，提取電壓分別為120、130、140、150、160 V，按1.2.1項(xiàng)下方法閃式提取多糖，分別計(jì)算樺褐孔菌多糖的提取率。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Behnken模型的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)，以料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取電壓（C）三個(gè)因素設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析因素及水平（見表1），對樺褐孔菌多糖的閃式提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平Tabie 1 Table of factors and levels of response surface experiments

1.2.4 樺褐孔菌多糖提取率的計(jì)算

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對提取率的影響 閃式提取中，隨著原料藥逐漸破碎，原料藥中被提取的物質(zhì)分子暴露于溶劑環(huán)境中并迅速轉(zhuǎn)移至溶劑中，在提取時(shí)間與提取電壓一定的條件下，溶劑體積越大，則被提取的物質(zhì)分子與之接觸越充分，提取率就越大，并在所用溶劑達(dá)到一定體積時(shí)趨于平衡。在本實(shí)驗(yàn)中，樺褐孔菌多糖的提取率隨料液比的增大而增加，在料液比為1∶15時(shí)增加明顯，且在料液比為1∶20時(shí)提取率最大，隨后趨于平緩。因此，為減少后期濃縮時(shí)的工作量，選擇液料比為1∶20（見圖1）。

圖1 料液比對提取率的影響（n=5）Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate（n=5）

2.1.2 提取時(shí)間對提取率的影響 閃式提取中，在料液比與提取電壓一定的條件下，提取時(shí)間越長原料藥的破碎程度越高，且隨著提取時(shí)間的延長被提取的物質(zhì)分子從原料藥向溶劑中的轉(zhuǎn)移率越高并逐漸達(dá)到平衡。在本實(shí)驗(yàn)中，隨著提取時(shí)間的延長，樺褐孔菌多糖的提取率不斷增加，提取率在70 s左右增加較為明顯，80 s時(shí)達(dá)到最大。因此，選擇提取時(shí)間為80 s（見圖2）。

2.1.3 提取電壓對提取率的影響 閃式提取中，提取電壓越大刀頭轉(zhuǎn)速越大，破碎和攪拌作用越強(qiáng)，在料液比與提取時(shí)間一定的條件下，提取率隨著提取電壓的增大而增大并逐漸達(dá)到平衡，在提取電機(jī)電壓為150 V時(shí)多糖的提取率最大（見圖3）。

圖3 提取電壓對提取率的影響（n=5）Fig.3 Effect of extraction voltage on the extraction rate（n=5）

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方案分別進(jìn)行了17組實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.2.2.1 方差分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析，得到多元二次響應(yīng)面回歸模型：Y=+8.27+0.74A+0.64B+0.38C+0.12AB+0.33AC+0.41BC-0.93A2-0.70B2-1.06C2運(yùn)用軟件對模型進(jìn)行方差分析，考察模型的可靠性，結(jié)果見表3。

由表3可知，模型顯著性檢驗(yàn)p＜0.05，表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失擬項(xiàng)用來表示所用模型與實(shí)驗(yàn)擬合的程度，即二者差異的程度。本模型失擬項(xiàng)p值為0.1056＞0.05，說明此模型具有可行性。校正決定系數(shù)R2為0.9994，說明模型響應(yīng)值的變化有99.94%來自所選因變量，且該模型只有0.06%的變異，能由該模型解釋，進(jìn)一步說明模型擬合優(yōu)度較好。其自變量一次項(xiàng)A，B，C，二次項(xiàng)AB，AC，BC，A2，B2，C2均極顯著（p＜0.01）。

2.2.2.2 三維響應(yīng)曲面圖分析 作響應(yīng)值Y與各因素構(gòu)成的三維空間響應(yīng)面圖，以反映料液比、提取時(shí)間、提取電壓3個(gè)關(guān)鍵因子及其交互作用對樺褐孔菌多糖提取率的影響（見圖4～圖6）。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和結(jié)果Table2 Table of design and results of response surface experiments

表3 回歸統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Table3 Table of results of regression analysis

圖4～圖6為響應(yīng)面值Y與A、B、C構(gòu)成的三維空間響應(yīng)面圖，可更直觀的反應(yīng)各因素間的交互作用對樺褐孔菌多糖提取率的影響。通過觀察曲面的傾斜度確定兩個(gè)因素交互作用對響應(yīng)值的影響程度，傾斜度越高則說明兩者交互作用越顯著。因此，由圖4可以看出料液比對樺褐孔菌多糖提取率影響較為顯著，表現(xiàn)為曲面最陡，依次為提取時(shí)間、提取電壓，表現(xiàn)為曲面較陡、較平滑。最后經(jīng)典型性分析可知，樺褐孔菌多糖閃式提取的最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶22.52，提取時(shí)間為86.13 s，提取電壓為153.76 V，預(yù)測樺褐孔菌多糖的提取率達(dá)到8.73%。

圖4 料液比和提取時(shí)間對樺褐孔菌多糖提取率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio and extraction time on the extraction rate

圖5 料液比和提取電壓對樺褐孔菌多糖提取率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio and extraction voltage on the extraction rate

圖6 提取時(shí)間和提取電壓對樺褐孔菌多糖提取率的影響Fig.6 Effect of extraction time and extraction voltage on the extraction rate

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：為確保實(shí)驗(yàn)的可行性，將最優(yōu)提取工藝參數(shù)調(diào)整為：料液比1∶23，提取時(shí)間為86 s，提取電壓為150 V，在此條件下閃式提取樺褐孔菌多糖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此條件下樺褐孔菌多糖提取率為8.52%，與預(yù)測值8.73%的相對誤差為2.46%。說明該方程模擬效果很好，響應(yīng)面法優(yōu)化所得的提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化閃式提取樺褐孔菌多糖的提取工藝，得到最佳提取工藝為料液比1∶23，提取時(shí)間為86 s，提取電壓為150 V，此條件下樺褐孔菌多糖提取率為8.52%，證明閃式提取法適用于樺褐孔菌多糖的提取，閃式提取法在將樺褐孔菌原料藥粉碎的同時(shí)，通過浸漬、攪拌作用使多糖分子與溶劑充分接觸，最大限度地實(shí)現(xiàn)多糖分子從物料向溶劑中的轉(zhuǎn)移，且彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法耗時(shí)長、有效成分受熱易被破壞的缺點(diǎn)，極大地縮短了實(shí)驗(yàn)研究的時(shí)間與成本，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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Optimization of homogenate extraction of polysaccharides from Inonotus obliquus based on response surface methodology

RONG Fang-yue，ZHANG Yu*，ZHAO Hong，WANG Yu-liang，QIN Yong-li，CONG Jing-nan
（Key Laboratory of Biological Medicine Preparations，Institute of Pharmacy，Jiamusi University，Jiamusi 154007，China）

Used the response surface methodology to optimize the homogenate extraction of polysaccharide from Inonotus obliquus.To optimize the optimum process parameters of the homogenate extraction of polysaccharide from Inonotus obliquus using response surface methodology which based on the single factor test that used extraction rate as response value and used solid-liquid ratio，extraction time and extraction voltage as the main study factors.The results indicated that the optimum condition was achieved when solid-liquid ratio was 1∶23，extraction time was 86 s，and extraction voltage was 150 V.The extraction rate was the highest，which could reach 8.52%.Conclusion：The homogenate extraction was suitable for extraction of polysaccharide from Inonotus obliquus.The process had the advantages of convenient，fast and efficient.The optimal conditions based on response surface methodology were accurate.

Inonotus obliquus；polysaccharide；homogenate extraction；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2016）08-0286-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.051

2015－09－10

榮芳悅（1991-），女，碩士研究生，研究方向：天然藥物活性成分篩選及新藥開發(fā)，E-mail：975760808@qq.com。

*通訊作者：張宇（1964-），女，教授，研究方向：天然藥物活性成分篩選及新藥開發(fā)，E-mail：zhangyu_1964@163.com。

黑龍江省教育廳項(xiàng)目（12541818）；佳木斯大學(xué)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金（CXTD-2013-05）；青年創(chuàng)新人才基金（22Zq201501）。