李圣陶，龔吉軍，吳 敏，唐 靜（1.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南長沙1000；2.北海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，廣西北海536000；3.稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室，湖南長沙1000；.廈門出入境檢驗檢疫局科學研究院，福建廈門361026）

基于HiCapt Benzo固相萃取前處理的HPLC-FLD法檢測油茶籽油中苯并（a）芘

李圣陶1，2，龔吉軍1，3，*，吳 敏4，唐 靜1，3
（1.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南長沙410004；2.北海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，廣西北海536000；3.稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室，湖南長沙410004；4.廈門出入境檢驗檢疫局科學研究院，福建廈門361026）

為了建立一種基于HiCapt Benzo固相萃取快速前處理的，更靈敏、準確的高效液相色譜-熒光檢測法，以用于油茶籽油中苯并（a）芘的檢測。油茶籽油樣品以正己烷溶解后，用HiCapt Benzo專用固相萃取柱凈化。檢測條件為：LC-PAHs專用色譜柱；50%乙腈-50%水為流動相，流速1.0 mL/min；熒光檢測器；外標法定量。研究結(jié)果表明，苯并（a）芘標準曲線在0.1～200 ng/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系好（R2=0.9993）；檢測限很低（0.0213～0.0246 μg/kg）。該法用于4個油茶籽油樣品加標檢測，回收率為93.06%～104.52%，相對標準偏差（RSD）為2.12%～3.98%。本文所建固相萃取-高效液相色譜（帶熒光檢測器）法前處理簡單，結(jié)果準確可靠，是油茶籽油苯并（a）芘高效檢測的適宜方法。

油茶籽油，苯并（a）芘，液相色譜，固相萃取，檢測

采用傳統(tǒng)方法制備的油茶籽油，因為制油過程中需經(jīng)過高溫焙炒，其中可能含有一定量的苯并（a）芘［B（a）P］。B（a）P是多環(huán)芳烴（PAHs）類化合物的典型代表，具有強烈的致癌性［1-3］。

目前測定食用植物油中B（a）P含量的國家標準方法有3種，包括熒光分光光度法（GB/T5009.27-2003）、目測比色法（GB/T5009.27-2003）和反相高效液相色譜法（GB/T22509-2008）。從操作步驟、耗時、毒害性等方面來看，3種方法均存在操作復(fù)雜、溶劑毒性大、費時、準確性差的問題［4］。

油茶籽油基體復(fù)雜，干擾因素多，且其B（a）P含量較低難以直接測定，通常需對樣品進行凈化和預(yù)濃縮處理，使之達到色譜分析的要求［5］。SPE前處理凈化技術(shù)，具有溶劑使用量少、操作簡便快速、選擇性高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，常與HPLC聯(lián)用以定量檢測食品中B（a）P［6-10］。史海良［11］采用SPE-HPLC-FLD檢測方便面中的B（a）P，具有良好的靈敏度和精密度。Yang等［12］采用SPE-HPLC法檢測了幾種食用油（不含茶油）和油脂產(chǎn)品中的B（a）P，也取得了滿意的效果。油茶籽油與其他食用油的成分有差異，與食品類的差異更大，將SPE-HPLC-FLD法用于油茶籽油中B（a）P的檢測，其參數(shù)亟待探明，但迄今為止，還未見有關(guān)研究報道。

本文以HiCapt Benzo專用固相萃取柱對油茶籽油進行前處理，采用LC-PAHs專用液相色譜柱，旨在建立一種簡便、高效，且能精確定量檢測油茶籽油中B（a）P的HPLC-FLD法，以期為油茶籽油生產(chǎn)與市場監(jiān)管中B（a）P的高效檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

壓榨油茶籽毛油、浸提油茶籽毛油、油茶籽脫酸油 在實驗室自制；1～10號品牌市售油茶籽油 購于沃爾瑪超市；B（a）P標準品 Dr.Ehrensterfer公司；正己烷、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮 Tedia公司，均為色譜純（AR）。

Agilent 1200高效液相色譜儀 配熒光檢測器（FLD），美國安捷倫公司；LC-PAHs色譜柱（25 cm×4.6 mm ID，Supelcosil TM 5 μm） 美國Supeleo；固相萃取裝置（Large Volume Sample） 美國Supeleo；Vortex-Genie 2漩渦混合器 美國Scientific Industries；TurboVapò LV氮氣吹掃裝置 美國Biotage；TDL-80-2B離心機 上海安亭科學儀器廠；HiCapt Benzo固相萃取柱 維泰克科技（武漢）有限公司；C18柱、堿性氧化鋁柱 博納艾杰爾科技；硅膠柱、弗羅里柱 德國Simon Aldrich。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液制備 用甲醇將l mL的B（a）P標液稀釋成1 mg/L的標準儲備液，用密封帶密封，貯存于4℃冰箱中待用。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 提取 稱取0.5 g油茶籽油樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，取3 mL正己烷溶解，渦旋1 min混均，加入2 mL超純水，再渦旋1 min，4000 r/min離心3 min，取上層溶液2 mL，待凈化。

1.2.2.2 凈化 采用12孔真空固相萃取裝置進行樣品的凈化。包括活化、上樣、淋洗和洗脫4個步驟?；罨涸诠滔噍腿≈幸来渭尤? mL丙酮、2 mL正己烷進行活化；上樣：以1.2.2.1中的提取液上樣，上樣量2 mL，流速1 mL/min；淋洗：待上樣液完全流出后，用3 mL乙酸乙酯與正己烷的混合液［1∶4（v/v）］淋洗，淋洗液棄去，將小柱抽干；洗脫：用3 mL丙酮洗脫，流速2.0 mL/min，收集洗脫液，先于50℃下用氮吹干，再加0.5 mL甲醇渦旋溶解，定容至1 mL，裝入進樣瓶，待分析。

1.2.3 儀器條件 檢測儀器：LC-FLD（Agilent 1200）；色譜柱：LC-PAHs專用液相色譜柱（25 cm×4.6 mm ID，SupelcosilTM 5 μm）；進樣量10 μL；柱溫30℃；流動相：50%乙腈-50%水，流速：1.0 mL/min。

檢測器：熒光檢測器，熒光條件參考國家標準《GB/T 24893-2010動植物油脂多環(huán)芳烴的測定》，時間29.20 min，激發(fā)波長（Ex）270 nm，發(fā)射波長（Em）324 nm。

1.2.4 B（a）P標準曲線繪制 使用標準貯備液依次稀釋制備0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、50、100、200 ng/mL 10個不同濃度的B（a）P甲醇標準液，采用1.2.3的儀器條件上機，以樣品的保留時間定性，以積分面積與含量比值定量，建立線性回歸方程，確定相關(guān)系數(shù)及檢出限。

1.2.5 B（a）P固相萃取柱的選擇 分別用C18柱、硅膠柱、弗羅里硅土柱、堿性氧化鋁柱以及HiCapt Benzo固相萃取柱吸附0.5 mL濃度為10 μg/L的B（a）P甲醇標準溶液，重復(fù)3次，采用與1.2.2中相同的方法用丙酮洗脫固相萃取柱、濃縮定容后，上機分析，以回收率反映不同固相萃取柱對B（a）P的吸附效果。

在1.2.2.1中，提取茶籽油中B（a）P用了3 mL正己烷進行液液萃取，在1.2.2.2中凈化上樣時用了2 mL收集的萃取液，所以修正后實際回收率的計算公式為：

回收率（%）=（W1×3/2-W0×3/2）/Z×100

其中：W1為加標樣品測定值，μg/kg；W0為空白樣品測定值，μg/kg；Z為加標量，μg/kg。

1.2.6 固相萃取洗脫劑的選擇 分別用甲醇、乙腈、丙酮和二氯甲烷作為洗脫溶劑，以B（a）P回收率為考察指標，比較在同樣的洗脫溶劑體積下，不同洗脫劑對B（a）P的洗脫效果。

1.2.7 固相萃取洗脫劑最佳用量的確定 為考察B（a）P合適的洗脫溶劑量，在2 mL（10 μg/L）B（a）P標準工作液上樣過柱后，以5 mL優(yōu)選的洗脫劑進行洗脫，每次加1 mL，分5次進行。在控制洗脫速度為1 mL/min的情況下，比較使用1、2、3、4、5 mL洗脫劑進行洗脫時B（a）P的回收率，以確定優(yōu)選洗脫劑的最佳用量（mL）。

1.2.8 不同精煉程度油茶籽油B（a）P加標回收率測定和市售樣品的檢測 取0.50 g自制壓榨油茶籽毛油、浸提油茶籽毛油、油茶籽脫酸油和某一品牌油茶籽油樣品各6份，置于25 mL聚丙烯離心管中，在其中3份油茶籽油樣品中加入500 μL（10 μg/L）B（a）P標

準工作液，振蕩混勻，另外3份作為空白對照。經(jīng)前處理后上機檢測。

同時，選擇10種不同品牌市售油茶籽油樣品，對其B（a）P含量進行檢測，每個樣品重復(fù)測定3次。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 B（a）P標準曲線繪制

B（a）P標準曲線見圖1。由圖1可見，在0.1～200 ng/mL范圍內(nèi)，B（a）P標準曲線的回歸方程為y=3.2051x+4.7649，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993，檢出限為0.0213～0.0246 μg/L，明顯低于湯富斌等［13］所建方法的檢出限（0.2 μg/kg），說明該方法對B（a）P檢測的靈敏度高。10 μg/L的B（a）P標樣的液相色譜圖見圖1，B（a）P單標檢測色譜圖見圖2。

圖1 苯并（a）芘標準曲線Fig.1 The standard calibration curve of B（a）P standard

圖2 苯并（a）芘單標檢測色譜圖Fig.2 Chromatogram of B（a）P standard

2.2 固相萃取柱的選擇

表1 比較不同固相柱的平均回收率（n=3）Table1 Recoveries of B（a）P of different SPE column（n=3）

分別采用C18柱、硅膠柱（Silica）、弗羅里硅土柱（Florisil）、堿性Al2O3柱以及HiCapt Benzo專用固相萃取柱對B（a）P進行吸附，其回收率測定結(jié)果見表1。結(jié)果表明，5種固相萃取柱對B（a）P吸附的回收率均存在顯著差異（p＜0.05），說明不同固相萃取柱對B（a）P吸附作用有明顯差異。其中HiCapt Benzo苯并芘固相萃取柱的回收率最高，達到了92.28%，C18柱的回收率次之，為88.45%，F(xiàn)lorisil柱和Silica柱的回收率則分別為85.64%和82.78%，而堿性氧化鋁柱的回收率最低，僅為53.58%。可見，最佳固相萃取柱為HiCapt Benzo。

2.3 固相萃取洗脫劑的選擇

同樣洗脫劑體積，不同洗脫劑對B（a）P的洗脫效果見圖3。由圖3可見，采用丙酮和二氯甲烷作為洗脫劑的回收率要顯著高于以甲醇和乙腈作為洗脫劑的回收率（p＜0.05），表明丙酮和二氯甲烷對B（a）P的洗脫能力較強，但二氯甲烷洗脫劑的基質(zhì)干擾對檢測結(jié)果影響較大，所以最終選擇丙酮作為洗脫劑。

圖3 不同洗脫劑的回收率Fig.3 Recoveries of B（a）P with different elution solvents

2.4 固相萃取洗脫劑最佳用量的確定

不同體積丙酮洗脫B（a）P的回收率見表2。由表2中可見，用3～5 mL丙酮洗脫，與用1～2 mL丙酮洗脫相比，其回收率存在極顯著差異（p＜0.01），用3 mL丙酮洗脫的平均回收率明顯高于用1～2 mL丙酮洗脫的回收率。而用4～5 mL丙酮洗脫的回收率與3 mL丙酮洗脫的回收率相比，差異不顯著（p＞0.05），因此，從節(jié)省溶劑和減少環(huán)境污染的角度來考慮，丙酮的最佳用量為3 mL。

表2 不同體積丙酮洗脫苯并（a）芘的回收率（n=3）Table2 Recoveries of B（a）P with different volume of C3H6O cleaning（n=3）

2.5 不同精煉程度油茶籽油B（a）P加標回收率測定和市售樣品的檢測

2.5.1 不同精煉程度油茶籽油B（a）P加標回收率測

定 不同精煉程度的油茶籽油樣品加標回收率測定結(jié)果見表3。壓榨油茶籽毛油、浸提油茶籽毛油、油茶籽脫酸油和某市售商品油樣品的加標回收率分別為104.52%、93.06%、98.12%、96.27%。而黃翠莉等［4］用反相高效液相色譜法測定油茶籽油中B（a）P的含量，其平均回收率為93.8%，低于本文所建方法的部分測定結(jié)果。油茶籽油樣品中B（a）P加標量為10 μg/kg時，除了市售某品牌油茶籽油外，其加標回收率明顯高于Brockmann氧化鋁活度測定法（GB/T22509-2008）采用相同加標量時的實驗室間比對結(jié)果（8.840± 0.498）μg/kg［14］，說明本文所建B（a）P檢測方法的精密度高于國標方法，提示本文所建方法具有很高的實用價值。

表3 不同精煉程度油樣B（a）P加標回收率（n=3）Table3 Recoveries of B（a）P in different extent refining COASO（n=3）

2.5.2 對10種市售油茶籽油中B（a）P含量的檢測 為了進一步檢驗本文所建立B（a）P檢測方法的可靠性，對10種不同品牌油茶籽油中B（a）P含量進行了檢測，并同時采用國標方法（GB/T 22509-2008）進行了檢測，對比結(jié)果見表4。8號油樣采用兩種方法均未檢出B（a）P。采用本文所建方法，其他油脂檢出值在0.9464～6.0185 μg/kg，其中6號樣的檢出量最高，達到6.0185 μg/kg，其次為2號樣，檢出量為5.3638 μg/kg。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，兩種檢測方法的檢出結(jié)果并無顯著差異（p＞0.05），說明本文所建方法可靠，但從檢出結(jié)果的標準差來看，采用國標方法均高于本文所建方法，說明本文所建方法的檢測穩(wěn)定性稍好。檢測結(jié)果表明，所選的市售10種品牌油茶籽油除8號可能含量極低而無法檢出外，其他均含有一定量的B（a）P，但均未超出國家標準（＜10 μg/kg），同時也證明，本文所建方法可用于市售產(chǎn)品的檢測。

表4 市售10種品牌油茶籽油B（a）P檢測結(jié)果（n=3）Table4 The contents of B（a）P in 10 brands of COASO（n=3）

3 結(jié)論

采用HiCapt Benzo固相萃取柱，以3 mL丙酮為洗脫劑，流速為1 mL/min，對油茶籽油進行凈化前處理，其對B（a）P萃取的回收率達到92.28%，顯著高于其他所測固相萃取柱。

將SPE前處理技術(shù)與HPLC-FLD結(jié)合，本文建立了一種油茶籽油B（a）P的高效檢測方法，在0.1～200 ng/mL范圍內(nèi)，其檢出限為0.0213～0.0246 μg/kg，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.9993，相對標準偏差（RSD）為2.12%～3.98%，加標回收率為93.06%～104.52%，與現(xiàn)行國標方法（GB/T 22509-2008）相比，其前處理步驟簡化、加標回收率更高，具有很高的實用價值。

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A detection method over benzo（a）pyrene in Camellia oleifera Abel seed oil by HPLC-FLD based on HiCapt Benzo solid-phase extraction pretreatment

LI Sheng-tao1，2，GONG Ji-jun1，3，*，WU Min4，TANG Jing1，3
（1.College of Food Science and Engineering，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China；2.Quality Inspection Center of Agricultural Products of Beihai City，Beihai 536000，China；3.National Engineering Laboratory for Rice and Byproducts Processing，Changsha 410004，China；4.Institute，Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen 361026，China）

This study was aimed to establish a highly efficient method of high-performance liquid chromatography with fluorescence detection（HPLC-FLD）based on HiCapt Benzo solid-phase extraction time-saving pretreatment for benzo（a）pyrene［B（a）P］detection in Camellia oleifera Abel seed oil（COASO）.Samples of COASO were dissolved in hexane，and purified by HiCapt Benzo solid phase extraction（SPE）column.The detection conditions were as followings：LC-PAHs chromatographic column，50% acetonitrile-50%pure water as mobile phase，flow rate 1.0 mL/min，fluorescence detector，quantification by external standard method.The results showed that standard calibration curve was linear over the concentration range of 0.1～200 ng/mL，with the regression efficiency （R2）of 0.9993.Furthermore，the detection limit was 0.0213～0.0246 μg/kg.A recovery range of 93.06%～104.52% and a relative standard deviation（RSD）range of 2.12%～3.98%was exhibited when the method was employed to detect four samples of COASO added with［B（a）P］standand.It was suggested that this detection method of SPE-HPLC-FLD established in the study was a suitable one for［B（a）P］detection in COASO，for its obvious advantages，such as simpler pretreatment，more sensitive and more efficient.

Camellia oleifera Abel seed oil（COASO）；B（a）P；high-performance liquid chromatography；solid phase extraction；detection

TS227

A

1002-0306（2016）08-0077-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.08.007

2015－08－19

李圣陶（1986-），男，碩士研究生，研究方向：食品質(zhì)量與安全，E-mail：349065553@qq.com。

*通訊作者：龔吉軍（1972-），男，博士，教授，研究方向：食品質(zhì)量與安全，食品天然保鮮劑，E-mail：jijungong2007@163.com。

湖南省科技計劃項目（2014NK3054）；糧油深加工與品質(zhì)控制湖南省2011協(xié)同創(chuàng)新中心開放課題（湘教通［2013］448號）；中南林業(yè)科技大學“十二五”專業(yè)綜合改革試點項目（2013-6）；國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2012IK192）。