程志發(fā)，馬 燮，毛華劍（四川理工學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，四川 自貢 643033）

研究與開(kāi)發(fā)

超聲輔助異丙醇/（NH4）2SO4雙水相體系提取金銀花中總黃酮

程志發(fā)，馬 燮，毛華劍
（四川理工學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，四川 自貢 643033）

采用異丙醇/硫酸銨/水構(gòu)建雙水相體系，研究在超聲波作用下操作條件對(duì)金銀花中總黃酮萃取效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金銀花總黃酮主要分布在上相，雙水相體系的組成（異丙醇與硫酸銨的濃度）對(duì)萃取效果的影響較大。當(dāng)異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%時(shí)，常溫下超聲處理20min，分配系數(shù)為29.4，總黃酮的萃取率為94.8%。

金銀花；雙水相；總黃酮；超聲輔助

金銀花是忍冬科忍冬屬植物，性甘寒，氣味芳香，具有清熱解毒，抗菌消炎的功效，研究表明，從金銀花即葉中提取得到的黃酮類(lèi)化合物具有抗菌、抗氧化、降壓、降血脂等活性，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景［1-2］。雙水相萃?。ˋTPS）是通過(guò)溶質(zhì)在兩水相間分配系數(shù)的差異而進(jìn)行萃取的技術(shù)，因其操作條件溫和，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的分離純化中，并取得了良好的效果［3-5］。雙水相萃取技術(shù)與其他技術(shù)的集成也成為雙水相技術(shù)的一個(gè)重要發(fā)展方向。研究表明，在萃取過(guò)程中引入超聲技術(shù)，利用超聲振蕩產(chǎn)生的空化效應(yīng)等多重效應(yīng)，可以加速目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑，促進(jìn)提取過(guò)程的進(jìn)行［6］。胡松青等［7］研究了超聲波對(duì)聚乙二醇（PEG）/磷酸鹽雙水相系統(tǒng)組成及牛血清蛋白（BSA）在其中分配的變化規(guī)律，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲波作用增大了分配系數(shù)。本文將超聲輔助異丙醇/（NH4）2SO4雙水相萃取用于從金銀花中提取總黃酮，研究各因素對(duì)提取效果的影響，為相關(guān)的開(kāi)發(fā)研究工作提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器

金銀花（外購(gòu)），80℃烘干，粉碎，過(guò)0.175mm篩備用。對(duì)照品蘆?。ㄍ赓?gòu)），異丙醇、硫酸銨、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室自制去離子水。

UV-1100 PC 型紫外分光光度計(jì)，SC-3612低速離心機(jī)，SM-5200DTD型超聲波清洗機(jī)，CP114型電子天平，烘箱等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1總黃酮含量的測(cè)定方法

總黃酮含量的測(cè)定方法參考文獻(xiàn)［8］，以蘆丁為對(duì)照品，采用分光光度法，在510nm處進(jìn)行測(cè)定。

稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品13.60mg，轉(zhuǎn)移并定容至50mL容量瓶中，即得濃度為0.272mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液置于25mL的比色管中，用無(wú)水乙醇稀釋至10.0mL，加入1.0mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的亞硝酸鈉溶液，靜置6min，加入1.0mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10 %的硝酸鋁溶液，靜置6min，加入4.0mL的10% 氫氧化鈉溶液，定容至刻度。靜置10min，于510nm處測(cè)吸光度。以吸光度Y為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度X為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得過(guò)原點(diǎn)線性回歸方程為：Y=10.408X，R2=0.9984。

1.2.2超聲波輔助雙水相萃取提取金銀花中總黃酮

雙水相體系總質(zhì)量設(shè)計(jì)為40g，于 50mL具塞試管中，加入一定量的異丙醇和硫酸銨，不足部分以水補(bǔ)充，然后將一定量的金銀花粉末加入雙水相體系中，混勻，靜置10min，放進(jìn)超聲波清洗機(jī)中，在一定的功率、溫度下，超聲處理一定時(shí)間，過(guò)濾，濾液靜置分層，待體系分相完全，讀取上下相體積，分別取上、下相溶液按1.2.1中方法分析總黃酮含量，分配系數(shù)K按式（1）計(jì)算，提取率Y按式（2）計(jì)算。

式中：Vt和Vb分別代表上相和下相的體積，L；Ct和Cb分別代表總黃酮在上相和下相的濃度，g·L-1。

2　結(jié)果與討論

2.1雙水相體系組成（異丙醇/硫酸銨含量）對(duì)總黃酮萃取效果的影響

［9］，當(dāng)異丙醇含量固定20%時(shí)，硫酸銨的含量要高于15%才能形成雙水相，而且異丙醇含量越高，形成雙水相時(shí)對(duì)鹽的濃度要求越低，同時(shí)，當(dāng)異丙醇含量為20%，硫酸銨濃度超過(guò)33%就會(huì)有鹽析出，且異丙醇濃度越高，析出鹽時(shí)對(duì)應(yīng)的硫酸銨濃度越低，因此，實(shí)驗(yàn)主要考察異丙醇質(zhì)量分率固定在20%、25%、30%的條件下，硫酸銨用量對(duì)體系分配系數(shù)及總黃酮萃取率的影響。

雙水相體系總質(zhì)量設(shè)計(jì)為40g，于具塞試管中加入一定量的異丙醇使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定，改變硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，靜置10min，超聲處理15min，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

圖1　硫酸銨用量對(duì)分配系數(shù)的影響

圖2　硫酸銨用量對(duì)萃取率的影響

雙水相的形成是（NH4）2SO4與異丙醇爭(zhēng)奪水分子的過(guò)程，由圖1和圖2可知，隨著硫酸銨用量的增加，下相對(duì)水的締合能力增強(qiáng)，下相的體積增加，因此，硫酸銨用量的改變可影響到上相的極性，從而影響到總黃酮的分配。隨著硫酸銨用量增加，分配系數(shù)和總黃酮提取率均增加，但當(dāng)（NH4）2SO4用量增大到一定程度后，下相開(kāi)始有少量鹽析出，且異丙醇濃度越高，析出鹽時(shí)硫酸銨的濃度越低。從圖1和圖2中還可以看出，隨著異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮在富含異丙醇的上相中有較大的分配系數(shù)，當(dāng)異丙醇濃度為30%，硫酸銨含量超過(guò)22.5%以后，分配系數(shù)變化不大，且硫酸銨含量超過(guò)30%以后，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)下相中開(kāi)始有少量鹽析出。由圖1和圖2可知，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，異丙醇濃度為30%，硫酸銨濃度為25%時(shí)，總黃酮萃取率達(dá)到93.8%，分配系數(shù)為27.9。

2.2超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響

雙水相體系總質(zhì)量設(shè)計(jì)為40g，異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%的條件下，靜置10min，攪拌使其分相，放進(jìn)超聲波清洗機(jī)中，改變時(shí)間分別為15、20、25、30、35min，超聲提取，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　超聲時(shí)間對(duì)金銀花中總黃酮萃取效果的影響

從圖3中可看出，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，萃取時(shí)間對(duì)萃取率的影響不大，分配系數(shù)K在20min處達(dá)到最大值29.4，萃取率R為94.8%。

3　結(jié)論

將超聲提取與雙水相分離技術(shù)集成，用于提取金銀花中的總黃酮，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金銀花總黃酮主要分配在上相，異丙醇與硫酸銨的濃度對(duì)萃取效果的影響較大。當(dāng)異丙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%時(shí)，室溫下超聲處理20min，分配系數(shù)為29.4，總黃酮的萃取率為94.8%。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 武雪芬，白雁.金銀花葉藥用成分的提取及抑菌試驗(yàn)研究［J］.中成藥，2001，23（6）：448-449.

［2］ 胡志軍，沈玲玲，王南溪，等.大孔吸附樹(shù)脂分離純化金銀花中黃酮類(lèi)物質(zhì)的研究［J］.離子交換與吸附，2011，27（3）：229-237.

［3］ 周春暉，李俊.β-環(huán)糊精輔助提取金銀花中總黃酮的工藝研究［J］.中成藥，2010，32（10）：1796-1799.

［4］ 許靈君，歐陽(yáng)玉祝，吳道宏，等.雙水相體系協(xié)同超聲提取法分離金銀花總黃酮［J］.食品與發(fā)酵科技，2010，46（6）：93-96.

［5］ Liu Yu，Han Juan， Wang Yun， et al. Selective separation of flavones and sugars from honeysuckle by alcohol/salt aquerous two-phase system and optimization of extraction process［J］.separation and purification technology， 2013（118）：776-783.

［6］ 銀永忠，龍進(jìn)國(guó).響應(yīng)面法優(yōu)化黃柏總黃酮的雙水相超聲提取工藝［J］.食品與發(fā)酵科技，2011，47（6）：65-69.

［7］ 胡松青，趙瑋.超聲波對(duì)PEG/磷酸鹽雙水相系統(tǒng)組成及BSA分配的影響［J］.應(yīng)用聲學(xué)，2010，29（3）：236-240.

［8］ 袁珂， 薛月芹，樓爐煥.竹葉總黃酮不同提取方法的比較研究［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2007，27（6）：109-112.

［9］ 王赟.水溶性小分子醇-鹽雙水相體系的構(gòu)建及分相/分離機(jī)制和應(yīng)用研究［D］.鎮(zhèn)江：江蘇大學(xué)，2010.

Extraction of Total Flavonoids from Honeysuckle with Isopropano/ Ammonium Sulfate Aqueous Two-phase System by Ultrasonic-assisted

CHENG Zhi-fa， MA Xie， MAO Hua-jian （College of Materials and Chemical Engineering， Sichuan University of Science and Engineering， Zigong 643000， China）

Aqueous two-phase system was constructed with alcohols / ammonium sulfate / water. The extraction operating conditions of total flavonoids from honeysuckle by ultrasonic-assisted were investigated. The experiments results showed that the total flavnoids mostly accumulated in the top phase.It was found that the concentration of isopropanol and ammonium sulfate had greater effect on aqueous two-phase extraction. The appropriate conditions were as followed： the quality percentage of isopropanol was 30% and the quality percentage of ammonium sulfate was 25%， ultrasonic treat time was 20 min. Under these conditions， the distribution coefficient K was 29.4 and the extraction ratio was 94.8%，

honeysuckle； aqueous two-phase system； total flavonoids； ultrasonic-assited

O 623.54

A

1671-9905（2016）08-0001-03

精細(xì)化工助劑及表面活性劑四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（2013JXZ01）；四川省教育廳資助項(xiàng)目（11ZA119）

通訊聯(lián)系人：馬燮，E-mail：maxie@suse.edu.cn

2016-05-25