張榮生，石國宗，張慧蘭，孫 麗（廈門藍(lán)灣科技有限公司，福建廈門361027）

DEAE-瓊脂凝膠微球的制備及在R-PE和C-PC提取分離中的應(yīng)用

張榮生，石國宗，張慧蘭，孫 麗*
（廈門藍(lán)灣科技有限公司，福建廈門361027）

為了降低天然大分子功能蛋白的分離純化成本，以瓊脂為原料自制弱陰離子交換層析介質(zhì)DEAE-瓊脂凝膠微球。將DEAE-瓊脂凝膠微球應(yīng)用于壇紫菜R-藻紅蛋白（R-PE）和螺旋藻C-藻藍(lán)蛋白（C-PC）的提取分離，最佳洗脫條件為：層析柱規(guī)格h=35.0 cm，φ=1.0 cm，V=27.5 mL；流速v=0.33 mL/min；洗脫緩沖液為0.01 mol/L磷酸鹽溶液（含有0.05～0.5 mol/L NaCl溶液）；0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（含0.1 mol/L NaCl）洗脫出純度為5.0的壇紫菜R-PE；0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（含0.2 mol/L NaCl）洗脫出純度為4.4的螺旋藻C-PC。自制層析介質(zhì)成本低廉、耗能少、可大量制備、分離效果好，可用于壇紫菜R-PE、螺旋藻C-PC的產(chǎn)業(yè)化制備。

DEAE-瓊脂凝膠微球，壇紫菜R-PE，螺旋藻C-PC，產(chǎn)業(yè)化

藻紅蛋白（Phycoerythrin，PE）、藻藍(lán)蛋白（Phycocyanin，PC）主要存在于藍(lán)藻、紅藻、隱藻和少數(shù)一些甲藻中，與別藻藍(lán)蛋白（Allophycocyanin，APC）一起構(gòu)成棒狀的藻膽體，將捕獲的光能傳遞給葉綠素a［1］；作為儲存蛋白，使藻類在氮源缺乏的季節(jié)維持生存［2］。PE和PC用途極為廣泛，可應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、腫瘤光動(dòng)力治療、食品和化妝品的添加劑［3］等方面。用作分子探針和光敏劑的PE、PC，純度分別要求A565/ A280＞4.0、A620/A280＞4.0，即試劑級純度，其制備方法為：將原料預(yù)處理得到的粗蛋白，通過羥基磷灰石（HA）、GE公司的DEAE-Sepharose、Sephadex系列凝膠、預(yù)裝陰離子色譜柱或Bio-Rad公司的Bio-gel系列凝膠配合使用得到試劑級純度藻膽蛋白。王璐［4］使用Sepharose CL-4B、Sephadex G-150和DEAE-Sepharose FF從多管藻中提取得到A567/A280＞5.0的R-PE和A617/ A280約為3.0的R-PC；GA Basaca-Loya等［5］將紅藻Rhodosorus marinus粗提液用分子篩凝膠Sephadex G-25和陰離子色譜預(yù)裝柱HiPrep 16/10 Q XL（0.75 cm×10 cm）分離得到A545/A280=4.8的B-PE；Anamika Patel等［6］將螺旋藻、席藻屬海藻和鞘絲藻屬海藻的粗蛋白分級鹽析，之后過DEAE-Sepharose CL-6B弱陰離子交換層析柱，分別得到A620/A280純度為4.42、4.43和4.59的藻藍(lán)蛋白。這些層析介質(zhì)十分昂貴，僅限于實(shí)驗(yàn)室研究。因此，制備出高效、經(jīng)濟(jì)、易于放大的柱層析介質(zhì)對于規(guī)模化生產(chǎn)高純度的藻膽蛋白來說是首要的任務(wù)。

本文以食品工業(yè)中廉價(jià)的瓊脂為原料，參考譚天偉等［7］的方法制備瓊脂凝膠微球，再在微球的活性羥基上鍵合DEAE基團(tuán)，改造成弱陰離子交換介質(zhì)，優(yōu)化洗脫條件，最終分別從壇紫菜和螺旋藻中提取得到試劑級純度的R-PE和C-PC，以期降低R-PE、CPC的純化成本，有利于規(guī)模化制備壇紫菜R-PE和螺旋藻C-PC。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

瓊脂 購于北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；紫菜 購于廈門生鮮超市；螺旋藻 購于云南惠爾生物科技有限公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純試劑。

E100型光學(xué)顯微鏡 尼康映像儀器（中國）有限公司；mastersizer2000粒度分析儀 英國Malvern公司；CLF-20C型粉碎機(jī) 浙江省溫嶺市創(chuàng)力藥材器械廠；CP512型電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；TDL-5-A型離心機(jī) 廈門鑫海盛世生物科技有限公司；KQ-250DB型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；多種規(guī)格的層析柱 上海華美儀器廠；BT00-100M型蠕動(dòng)泵 常州科健蠕動(dòng)泵廠；UV-1800型紫外可見分光光度計(jì) 上海奧析科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DEAE基團(tuán)的鍵合與DEAE-瓊脂凝膠微球離子交換容量測定 參考王國祥等［8］的方法，取40 mL本公司自制的6%交聯(lián)瓊脂微球用大量蒸餾水洗滌，真空抽濾至液面與膠面平齊，移入500 mL燒瓶中，加入80 mL 1.5 mol/L的DEAE-HCl，另取80 mL 2.0 mol/L NaOH溶液置于500 mL燒杯中。密封后放入水浴鍋中60℃預(yù)熱，10 min后將燒杯中的NaOH倒入燒瓶中，封口，開動(dòng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，開始反應(yīng)。反應(yīng)1 h后，取出燒瓶，用水冷卻。DEAE-瓊脂微球在布氏漏斗中用蒸餾水洗滌，取少量微球觀察微觀形態(tài)，檢測粒徑分布，測定離子交換容量，備用。

1.2.2 壇紫菜R-PE和螺旋藻C-PC的提取分離

1.2.2.1 細(xì)胞破碎 稱取50 g干燥的壇紫菜，用粉碎機(jī)反復(fù)粉碎6次，每次1 min至顆粒無法減小為止，浸泡于1000 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，依次采用-20℃，4℃反復(fù)凍融3次，超聲波破碎20 min，玻璃棒攪拌5 min，常溫下5000 r/min離心10 min后得上層液，上層液紫黑色深、不透光，用毛細(xì)管可觀察到澄清的紫色溶液，證明已離心完全。4℃保存。

稱取5 g螺旋藻粉，按上述方法破碎細(xì)胞，得到深藍(lán)色浸出液，4℃保存。

1.2.2.2 分級鹽析 取200 mL壇紫菜提取液加硫酸銨至30%飽和度，4℃放置5 h，常溫下離心（5000 r/min，10 min），收集紫黑色沉淀，再于上清加硫酸銨至50%飽和度，4℃過夜，常溫離心（5000 r/min，10 min），得到深紫紅色蛋白沉淀。將其復(fù)溶于水，以0.005 mol/L磷酸鹽緩沖液為透析液、用10 ku透析袋透析。

取200 mL螺旋藻提取液按上述方法梯度鹽析，可得深藍(lán)黑色蛋白溶液。

1.2.2.3 HA柱層析 將50%飽和度鹽析得到的蛋白溶于適量0.005 mol/L磷酸鹽緩沖液，取約1/10體積的樣品透析脫鹽（透析液均為0.005 mol/L磷酸鹽緩沖液），用1 mol/L BaCl2取樣檢驗(yàn)直至無沉淀為止。待上樣。HA按陳小強(qiáng)等［1］的方法制備。

在室溫條件下，濕法裝填HA柱（2.6 cm×30.0 cm，V=159.2 mL），0.001 mol/L磷酸鹽緩沖液平衡過夜，取40 mL透析后的樣品上柱，進(jìn)行梯度洗脫，按順序使用0.001～0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，流速4.0 mL/min，每個(gè)梯度若無樣品洗脫下來或洗脫至流出液顏色很淡時(shí)則換下一梯度。收集各梯度洗脫液200 mL/瓶。選取純度相對較高的組分再過一次HA柱（1.6 cm×30.0 cm，V=60.3 mL），緩沖液梯度同上，流速調(diào)整為2 mL/min，收集40 mL一管，透析，4℃保存。

1.2.2.4 DEAE-瓊脂凝膠柱層析 將保存于20%乙醇溶液中的DEAE-瓊脂凝膠微球用純化水濾洗至無醇味后，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液充分溶脹，輕輕攪拌成糊狀，裝柱（φ=1.0 cm，h=35.0 cm，V=27.5 mL），注意避免凝膠柱中出現(xiàn)氣泡、裂紋或斷層；將純度較高的藻膽蛋白溶液沿著層析柱內(nèi)壁倒入凝膠柱膠面上，保持膠面平整；依次用含有0.05～0.5 mol/L NaCl 的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，流速0.33 mL/min，收集10 mL/管，測定各管吸光值，選取純度較高的組分測量220～700 nm范圍吸收光譜。透析脫鹽，凍干保存。按以下經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算R-PE、C-PC在溶液中的濃度（mg/mL）［9-10］：

2 結(jié)果與分析

2.1 DEAE-瓊脂凝膠微球的理化性質(zhì)

圖1 DEAE-瓊脂凝膠微球的微觀形態(tài)（400×）Fig.1 The microscopic morphology of DEAE-agar gel microspheres（400×）

制備完成的DEAE-瓊脂凝膠微球?yàn)槿榘咨z狀，離子交換容量為0.060 mmol/mL，達(dá)到商品化的同類介質(zhì)的0.375～0.545倍。取少量DEAE-瓊脂凝膠微球在光學(xué)顯微鏡下觀察微觀形態(tài)。如圖1所示，DEAE-瓊脂凝膠微球延續(xù)了瓊脂凝膠微球的剛性結(jié)構(gòu)，保持規(guī)則的圓球狀，粒徑較為均一，分散性好、不黏連，微球之間有一定大小的空隙。這些特點(diǎn)可以防止微球形狀不規(guī)則和小粒徑微球造成的層析柱堵塞，保證洗脫過程的流暢。

進(jìn)一步使用mastersizer 2000粒度分析儀檢測DEAE-瓊脂凝膠微球的粒徑分布，結(jié)果如圖2所示，DEAE-瓊脂凝膠微球的粒徑多數(shù)分布在20～70 μm，平均粒徑為42.3 μm。

圖2 DEAE-瓊脂凝膠微球粒徑分布Fig.2 The porrticle size distribution of DEAE-agar gel microspheres

在適當(dāng)增加凝膠用量、提高層析柱高徑比的條件下，DEAE-瓊脂凝膠微球能夠滿足分離藻膽蛋白的要求，而原料成本僅為DEAE-Sepharose FF的5%左右，性價(jià)比高，擺脫了原料成本的限制，可以大量制備DEAE-瓊脂凝膠微球應(yīng)用于天然產(chǎn)物提純技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化。

2.2 R-PE和C-PC的分離純化

本文使用自制的HA和DEAE-瓊脂凝膠微球提取分離壇紫菜R-PE和螺旋藻C-PC。HA具有獨(dú)特的分離機(jī)理，是唯一直接用于蛋白質(zhì)和核酸純化的無機(jī)層析填料，高度耐堿，生物安全性最高，不影響蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)。用于壇紫菜R-PE、螺旋藻C-PC的分離時(shí)，因兩者等電點(diǎn)＜7.0，在pH=7.0的磷酸鹽緩沖液中帶負(fù)電，它的自由羧基與HA的構(gòu)晶離子Ca2+以金屬螯合方式結(jié)合，不與HA結(jié)合的雜質(zhì)分子首先被除去；之后由磷酸鹽緩沖液濃度梯度洗脫，用特定濃度的磷酸根交換出螯合在HA上的R-PE、C-PC，與R-PE、C-PC等電點(diǎn)不同的雜蛋白被先一步洗脫除去或截留在柱頂端。

壇紫菜R-PE、螺旋藻C-PC與DEAE-瓊脂凝膠微球的結(jié)合力取決于彼此間相反電荷基團(tuán)的庫侖力，這種作用力與平衡和洗脫溶液的pH及離子濃度有關(guān)，pH決定了DEAE-瓊脂凝膠微球和R-PE、C-PC的電離程度，而洗脫液中帶負(fù)電荷的離子則與R-PE、C-PC競爭DEAE-瓊脂凝膠微球上帶正電荷的DEAE基團(tuán)。通過調(diào)整平衡緩沖液和洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度可以使R-PE、C-PC在DEAE-瓊脂凝膠微球上實(shí)現(xiàn)吸附和解吸，本文使用含有0.01 mol/L磷酸鹽的不同濃度的NaCl溶液作為平衡和洗脫緩沖液，有良好的分辨率且保持R-PE、C-PC的穩(wěn)定。

通過嘗試使用各種不同規(guī)格的層析柱、流速、洗脫溶液，找到較為快速且分辨率高的層析方法來分離壇紫菜R-PE和螺旋藻C-PC。

2.2.1 R-PE的洗脫曲線與吸收光譜 經(jīng)細(xì)胞破碎、分級鹽析得到的壇紫菜藻膽蛋白溶液呈深紫紅色，A565/A280=1.08，為食品級純度。上樣于2.6 cm×30 cm HA柱，用0.001～0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液洗脫，流速為4.0 mL/min，洗脫效率高。得到洗脫曲線如圖3所示。

圖3 壇紫菜藻膽蛋白第一次HA柱層析洗脫曲線Fig.3 The HA column chromatography elution curve of the porphyra haitanensis phycobiliprotein for the first time

峰1的組分為紅色；峰2的組分以藍(lán)色為主，同時(shí)帶一點(diǎn)淺紅，在620 nm處有特征吸收峰；層析柱頂端截留藍(lán)綠色雜質(zhì)。之后洗脫出的樣品均為藍(lán)色或淺藍(lán)色，不含R-PE，故不再收集。峰1樣品在565、498、280 nm處有吸收峰，A565/A280=1.47～2.91，取純度最高的組分（A565/A280=2.91）透析，然后過1.6 cm×30 cm HA柱，洗脫曲線如圖4所示。

圖4 壇紫菜R-PE第二次HA柱層析洗脫曲線Fig.4 The HA column chromatography elution curve of the porphyra haitanensis R-PE for the second time

這根HA柱隨著洗脫緩沖液的濃度上升，有3個(gè)橘紅色帶先后被洗脫下來。純度最高的組分集中在峰1、峰2，A565/A280可達(dá)4.125、4.128；而峰3雖然也含有R-PE，但是同時(shí)也存在較多雜蛋白，造成純度A565/A280最高僅為1.133。故舍棄峰3，將前兩個(gè)峰純度最高的組分透析。HA小柱可進(jìn)一步將R-PE樣品中的雜蛋白除去，之后繼續(xù)使用HA柱難以提高R-PE純度，因此將樣品上樣于DEAE-瓊脂凝膠層析柱，洗脫曲線如圖5所示。

洗脫處峰1所用的緩沖液為0.01 mol/L磷酸鹽溶液+0.1 mol/L NaCl溶液，該組分的兩個(gè)特征吸收峰的比值A(chǔ)565/A280大部分均為4.0以上，即達(dá)到試劑級純度，最高可達(dá)5.0，提純效果顯著，可媲美商品化的DEAE-Sepharose FF的分離效果。忽略其他試劑級純度的樣品，計(jì)算A565/A280=5.0的樣品濃度CR-PE=0.123×0.151-0.068×0.004+0.015×0.003=0.018 mg/mL，體積為10 mL，則mR-PE=0.18 mg；初始過柱樣品為50 g壇紫菜粗提液的1/10，則得率為0.036‰。壇紫菜R-PE （A565/A280=5.0）在210～700 nm的吸收光譜如圖6所示。

圖5 壇紫菜R-PE的DEAE-瓊脂凝膠層析洗脫曲線Fig.5 The DEAE-agar gel column chromatography elution curve of the porphyra haitanensis R-PE

圖6 壇紫菜R-PE吸收光譜Fig.6 The absorption spectra of the porphyra haitanensis R-PE

所得樣品在280、565 nm分別有蛋白質(zhì)、藻紅蛋白色素的特征吸收峰，在540 nm左右有一吸收肩，是典型的兩峰一肩型R-PE吸收光譜。

先后三次柱層析純化壇紫菜R-PE的過程和結(jié)果總結(jié)見表1。

2.2.2 C-PC的洗脫曲線與吸收光譜 經(jīng)預(yù)處理得到的螺旋藻藻膽蛋白溶液呈深藍(lán)色，A620/A280=0.81。上樣于2.6 cm×30 cm HA柱，用濃度逐漸增加的磷酸鹽緩沖液洗脫，得到洗脫曲線如圖7所示。

峰1的組分為藍(lán)黑色；峰2的組分為亮藍(lán)色，在620 nm處有特征吸收峰；層析柱頂端截留黃綠色雜質(zhì)。之后洗脫出的樣品均為淺藍(lán)色，在650 nm處有特征吸收峰，為別藻藍(lán)蛋白，不收集。峰1樣品純度A620/ A280僅為0.1左右，含有極多的雜蛋白，在HA上的吸附力極弱，被0.001 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌干凈，從而很好地初步純化了螺旋藻C-PC。峰2各組分的A620/ A280=0.91～2.54，取純度最高的組分過1.6 cm×30 cm HA柱，洗脫曲線如圖8所示。

圖7 螺旋藻藻膽蛋白第一次HA柱層析洗脫曲線Fig.7 The HA column chromatography elution curve of the spirulina phycobiliprotein for the first time

圖8 螺旋藻C-PC第二次HA柱層析洗脫曲線Fig.8 The HA column chromatography elution curve of the spirulina phycobiliprotein for the second time

第二次HA柱層析有兩個(gè)洗脫峰，均為藍(lán)色樣品。峰1的各組分A620/A280=1.43～2.94；峰2 C-PC的A620/ A280最高可達(dá)3.84，且濃度較高，是本次上柱樣品的主要成分；此后只殘留少量樣品，洗脫液的濃度和純度很低，不再收集。HA小柱可進(jìn)一步將C-PC樣品中的雜蛋白除去，之后繼續(xù)使用HA柱收效甚微，因此將樣品上樣于DEAE-瓊脂凝膠層析柱，洗脫曲線如圖9。

表1 多級柱層析分離壇紫菜R-PETable1 The multistage column chromatography separation of R-PE

洗脫出峰2的溶液為0.01 mol/L磷酸鹽溶液+0.2 mol/L NaCl溶液，該組分的兩個(gè)特征吸收峰的比值A(chǔ)620/A280最高可達(dá)4.4，與經(jīng)過HA柱層析的樣品相比，跨過了試劑級純度的門檻。計(jì)算該管樣品CCPC=（0.684-0.474×0.08）/5.34=0.121 mg/mL，體積為10 mL，故mC-PC=1.21 mg，初始過柱樣品為5 g螺旋藻粗提液的1/10，則得率為2.42‰。螺旋藻C-PC（A620/A280=4.4）在220～700 nm的吸收光譜如圖10所示。

圖9 螺旋藻C-PC的DEAE-瓊脂凝膠層析洗脫曲線Fig.9 The DEAE-agar gel column chromatography elution curve of the spirulina C-PC

圖10 螺旋藻C-PC吸收光譜Fig.1 0 The absorption spectra of the spirulina C-PC

所得樣品在280、560 nm有蛋白質(zhì)、藻藍(lán)蛋白的特征吸收峰，且A620/A280＞4.0，達(dá)到試劑級純度。

將三次柱層析純化螺旋藻C-PC的過程和結(jié)果總結(jié)見表2。

3 討論

目前的國內(nèi)外文獻(xiàn)中應(yīng)用離子交換層析介質(zhì)分離藻紅蛋白的純度多在A565/A280=5.0左右，藻藍(lán)蛋白多為A620/A280=4.5左右。鄭蔚然［11］通過HA柱和DEAESepharose F.F離子交換柱層析得到純度5.3的壇紫菜R-PE；Tripathi等［12］應(yīng)用Sephacryl S300HR凝膠層析和DEAE-cellulose可得到純度5.24的PE；Jian等［13］利用Phenyl-Sepharose和DEAE-Sepharose可從條斑紫菜中提取出純度4.5的R-PE；Caroline等［14］使用強(qiáng)陰離子交換介質(zhì)Q Sepharose和分子排阻凝膠Sephacyrl S-100HR從螺旋藻中提取純度4.0的C-PC；廖曉霞等［15］先用殼聚糖和活性炭處理藻膽蛋白粗品，再用DEAESephadexA-25凝膠層析，可得純度4.3的C-PC。本文中使用的純化方法可以達(dá)到相近的分離效果。

當(dāng)前能夠?qū)E、PC純度分別提高到6.0、5.0以上的層析方案是將離子交換層析介質(zhì)和分子排阻凝膠層析聯(lián)用。Ravi Raghav Sonani等［16］經(jīng)過多級硫酸銨鹽析、先后使用排阻極限150 ku的Sephadex G-150和弱陰離子交換介質(zhì)DEAE-cellulose層析，從一種鞘絲藻屬的藻類A09DM中提取得到純度6.75的PE和純度5.53的PC；Sanjiv K Mishra等［17］同樣使用Sephadex G-150和DEAE-cellulose從海洋藍(lán)藻假魚腥藻中純化出A568/A280=6.86的C-PE；Chen等［18］使用DEAE-Sepharose 和Sephacry S-300尺寸排阻層析，從螺旋藻中提純富硒的藻藍(lán)蛋白，純度達(dá)到5.12。離子交換層析法根據(jù)不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)差異進(jìn)行分離，當(dāng)樣品達(dá)到一定等級的純度后，其中各種成分等電點(diǎn)極為相近時(shí)就難以再細(xì)分了。分子排阻層析介質(zhì)另辟蹊徑，根據(jù)不同蛋白質(zhì)的分子量差異進(jìn)行分離，可將等電點(diǎn)相近但分子量不同的幾種蛋白進(jìn)一步區(qū)分開。藻膽蛋白一般由α、β亞基構(gòu)成，有的還含有γ亞基。陳小強(qiáng)等［19］用SDS-PAGE法測定壇紫菜R-PE各亞基的相對分子質(zhì)量，α、β亞基約為18 ku，γ亞基約為35 ku，聚合體形式為（αβ）6γ，分子量約為260～270 ku；螺旋藻C-PC由α、β亞基組成，以（αβ）3、（αβ）6等多聚體形式存在［20］。藻膽蛋白的聚集體形式受到濃度、pH、溫度等因素影響，可以推測在同一種洗脫緩沖液中，濃度最高的藻膽蛋白的（αβ）單體將聚合成為六聚體，分子量240 ku左右，濃度較低的藻膽蛋白則分散成三聚體、二聚體或單體，分子量低于130 ku，所以用排阻極限150 ku的Sephadex G-150正好可以將它們分開?；诖耍狙芯肯乱徊綄⑻剿髟谥苽洵傊z微球時(shí)使用一定粒徑的致孔劑，使微球內(nèi)形成特定大小的孔徑，排阻極限在150 ku左右，與DEAE-瓊脂凝膠微球配合使用，進(jìn)一步提純試劑級藻膽蛋白。

表2 多級柱層析分離螺旋藻C-PCTable2 The multistage column chromatography separation of C-PC

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一套低成本的純化方法，其中使用的弱陰離子交換介質(zhì)DEAE-瓊脂凝膠微球離子交換容量達(dá)到商品化的同類介質(zhì)的0.375～0.545倍，而制備成本僅為同類介質(zhì)的5%左右，對兩種藻膽蛋白R-PE、C-PC的分離效果良好，純度分別為A565/A280=5.0、A620/ A280=4.4，達(dá)到試劑級純度，分離時(shí)所用的磷酸鹽緩沖液、NaCl溶液廉價(jià)環(huán)保，可用于藻膽蛋白的產(chǎn)業(yè)化制備。

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The preparation of DEAE-agar gel microspheres and its application in the separation of R-Phycoerythrin and C-Phycocyanin

ZHANG Rong-sheng，SHI Guo-zong，ZHANG Hui-lan，SUN Li*
（Xiamen Blue Bay Science&Technology Co.，Ltd.，Xiamen 361027，China）

In order to reduce the separation and purification cost of natural macromolecular functional protein，a kind of weak anion exchange chromatography medium DEAE-agar gel microsphere was made up.Applied DEAE-agar gel microsphere to the separation and purification of the porphyra haitanensis R-phycoerythrin （R-PE）and spirulina C-phycocyanin（C-PC），optimal elution conditions were as follows:chromatography column specifications was h=35.0 cm，φ=1.0 cm，V=27.5 mL，current velocity v=0.33 mL/min，elution buffer solution was 0.01 mol/L phosphate buffer solution（contain 0.05～0.5 mol/L NaCl）.0.01 mol/L phosphate buffer solution（contain 0.1 mol/L NaCl）washed porphyra haitanensis R-PE out，its purity was 5.0.0.01 mol/L phosphate buffer solution（contain 0.2 mol/L NaCl）washed spirulina C-PC out，its purity was 4.4.The DEAE-agar gel microspheres could be used in the industrial production of R-PE and C-PC because of their low cost，low energy consumption，scale preparation and excellent separation effect.

DEAE-agar gel microspheres；porphyra haitanensis R-PE；spirulina C-PC；industrialization

TS201.1

B

1002-0306（2016）02-0301-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.052

2015－07－27

張榮生（1987-），男，碩士，研究方向：生化分離工程，E-mail：zhangrs@bluebayst.com。

*通訊作者：孫麗（1972-），女，高級工程師，研究方向：生物醫(yī)藥，E-mail：sunli@bluebayst.com。

廈門市海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目（13CZP004SF27）。