郎天丹，梁 健，王成濤，2，張 嬋，2，*，劉錄祥（.北京工商大學(xué)北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京00048；2.食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京00048；.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，國家農(nóng)作物航天誘變技術(shù)改良中心，北京0008）

利用高能混合粒子場誘變選育高產(chǎn)Monacolin K、低產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌株

郎天丹1，梁 健1，王成濤1，2，張 嬋1，2，*，劉錄祥3
（1.北京工商大學(xué)北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京100048；2.食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京100048；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，國家農(nóng)作物航天誘變技術(shù)改良中心，北京100081）

利用北京正負(fù)電子對撞機直線加速器E2束流打靶產(chǎn)生高能混合粒子場，以64.3 Gy的劑量處理兩株紫色紅曲霉（Monascus Purpureus）M1和M2，經(jīng)初篩、復(fù)篩后采用HPLC法檢測誘變菌株中Monacolin K含量，并進行遺傳穩(wěn)定性實驗，從而選育高產(chǎn)Monacolin K、低產(chǎn)桔霉素的突變株。結(jié)果表明：經(jīng)混合粒子場輻照后，紫色紅曲霉M1和M2分別篩選出43株和22株正突變株，突變率分別為74.64%和56.72%，其中正突變率分別為60.56%和32.84%。突變株M1-20、M2-4發(fā)酵液中Monacolin K含量分別達(dá)到了421.69 mg/L和406.68 mg/L，較出發(fā)菌株分別提高了142.14%和101.27%，經(jīng)5次傳代培養(yǎng)后產(chǎn)Monacolin K的能力僅下降了4.21%和1.65%，并且其發(fā)酵液中桔霉素的含量均在0.01～0.04 mg/L之間，與出發(fā)菌株相比，桔霉素含量均明顯下降。高能混合粒子場可引起紫色紅曲霉菌落形態(tài)及色澤發(fā)生改變，突變率高，可獲得遺傳性能穩(wěn)定的突變株，是一種可應(yīng)用到微生物誘變育種的新方法。

紫色紅曲霉，Monacolin K，混合粒子場，菌株選育

紅曲是一種廣泛應(yīng)用于東南亞地區(qū)的傳統(tǒng)藥食同源的發(fā)酵產(chǎn)物，紅曲霉作為食用菌在中國已有上千年的歷史［1-2］。紅曲霉可產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物，主要包括紅曲色素［3-4］、Monacolin K［5-7］、γ-氨基丁酸［8-10］、麥角固醇［11］等。目前，Monacolin K已成為各國公認(rèn)的降低膽固醇的理想藥劑［12-13］，對選育高產(chǎn)Monacolin K的紅曲霉菌株就顯得尤為重要。

空間環(huán)境誘變是微生物誘變育種的新途徑［14］，空間環(huán)境由于存在宇宙線粒子、高能重離子、高真空、極度溫差和弱磁場等因素可誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生基因突變，進而影響微生物的生物學(xué)性狀和功能［15-18］。實踐證明，航天空間環(huán)境誘變微生物具有變異幅度大、頻率高、遺傳穩(wěn)定性好等特性［19-20］。但由于空間實驗投資大，技術(shù)要求高，實驗機會也十分有限，空間誘變難以大規(guī)模、持續(xù)應(yīng)用到微生物誘變育種中，所以要加強地面模擬航天空間環(huán)境誘變育種工作，這對于有效利用航天技術(shù)開展微生物誘變育種具有重要意義。近年來，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院航天育種中心等單位率先在國內(nèi)外利用北京正負(fù)離子對撞機模擬次級宇宙粒子，產(chǎn)生具有廣譜結(jié)構(gòu)、能量在200 MeV～1.2 GeV之間的混合粒子場，主要應(yīng)用于小麥、蔬菜、牧草等作物的改良上［21-22］。本研究利用北京正負(fù)離子對撞機模擬宇宙粒子組成的混合粒子場輻照處理紫色紅曲霉M1和M2來篩選高產(chǎn)Monacolin K、低產(chǎn)桔霉素的突變株，為紅曲霉的工業(yè)化生產(chǎn)提供新的理論依據(jù)，也為航天空間環(huán)境誘變技術(shù)在微生物誘變育種中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫色紅曲霉M1和M2 本實驗室保存；葡萄糖、瓊脂、甘油 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；甲醇、乙腈 賽默飛世爾科技（北京）有限公司，色譜純；Monacolin K（純度≥98%）、桔霉素（純度≥98%）

Sigma公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實驗設(shè)備廠；恒溫水浴鍋 山東華魯電熱儀器有限公司；20A型高效液相色譜儀、UV-2450型紫外可見光分光光度計 日本島津公司；PHS-3D功能型pH計 上海三信儀表廠；超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，酵母浸粉4 g，麥芽浸粉20 g，瓊脂20 g，KH2PO42 g，NaNO32 g，MgSO4·7H2O 1 g。

液體種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖30 g，豆粕粉15 g，蛋白胨10 g，甘油70 g，KH2PO42 g，NaNO32 g，MgSO4· 7H2O 1 g。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：甘油90 g，大米粉20 g，蛋白胨10 g，KH2PO42.5 g，NaNO35 g，MgSO4·7H2O 1 g，ZnSO4·7H2O 2 g。

1.3 培養(yǎng)方法

單菌落接種試管斜面后，30℃培養(yǎng)7 d，至菌絲長滿斜面，用接種環(huán)刮取適量新鮮菌絲體接種到種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)3 d，按10%（V/V）的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃、150 r/min培養(yǎng)12 d。

1.4 實驗方法

1.4.1 紅曲霉孢子懸液的制備 將紅曲霉M1和M2斜面在30℃培養(yǎng)7 d后，用10 mL 0.9%的無菌生理鹽水將紅曲霉孢子洗滌下來，倒入已滅菌裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩約5 min，顯微鏡檢查，孢子分散即可。用已滅菌的帶有濾紙的漏斗過濾除去菌絲體，制成孢子懸浮液，并調(diào)整孢子濃度至105個/mL，4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?3］。

1.4.2 紅曲霉的輻照處理 利用正負(fù)電子對撞機直線加速器E2束流打靶產(chǎn)生的混合粒子場（用CR表示）輻照處理兩株紫色紅曲霉的孢子懸液，輻照劑量為64.3 Gy。

1.4.3 誘變菌株初篩 將輻照處理的孢子懸液用0.9%的無菌生理鹽水做倍比稀釋，取10-1、10-2、10-3三個稀釋梯度的菌液100 μL涂于平板培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3 d，初步篩選出菌落形態(tài)與出發(fā)菌株有明顯差異、生長較快或較紅的單菌落，接于試管斜面保存，用于下步實驗。對照組樣品做同樣處理［24］。

1.4.4 誘變菌株復(fù)篩 種子液培養(yǎng)：用接種環(huán)刮取適量新鮮培養(yǎng)好的試管斜面，接種到種子培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)3 d。

液體發(fā)酵培養(yǎng)：按10%（V/V）的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃、150 r/min培養(yǎng)12 d，檢測Monacolin K含量。

1.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品（內(nèi)酯型）0.01 g，置于50 mL容量瓶中，加入4 mL甲醇溶液溶解，然后加20 mL 0.2 mol/L氫氧化鈉溶液，40℃超聲30 min后冷卻，用3 mol/L磷酸調(diào)節(jié)pH至6左右，加甲醇定容至刻度，即配制成濃度為200 mg/L酸型標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別稀釋成5、20、50、80、100、150 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照

1.4.6 中所述色譜條件進樣，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），Monacolin K質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

桔霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品0.001 g，置于50mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即配制成濃度為20 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再分別稀釋成0.05、0.2、2、4、8、12、16 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照1.4.7方法所述色譜條件進樣，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），桔霉素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.6 Monacolin K的檢測 發(fā)酵液的預(yù)處理：取發(fā)酵液5 mL，加入15 mL 75%的甲醇，超聲波萃取30 min，靜置過夜，然后取上清液經(jīng)0.45 μm的有機微孔濾膜過濾，檢測濾液中Monacolin K含量。

Monacolin K的檢測［25］：采用HPLC法，色譜柱：InertsilODS-3 C18（150 mm×4.6 mm×5 μm），流動相：0.1%磷酸∶甲醇=1∶3，流速1 mL/min，檢測器為紫外檢測器（PDA），檢測波長237 nm，檢測溫度30℃，進樣量10 μL。

1.4.7 桔霉素的檢測 發(fā)酵液的預(yù)處理：取紅曲霉發(fā)酵液10 mL，加入20 mL無水乙醇，超聲破碎細(xì)胞10 min，60℃水浴振蕩1 h，冷卻至室溫，3000 r/min離心15 min，然后取上清液經(jīng)0.45 μm的有機微孔濾膜過濾，濾液用來檢測桔霉素含量。

桔霉素的檢測［26］：采用HPLC法，色譜柱：YMCTriart C18（250 mm×4.6 mm×5 μm），流動相：乙腈∶水（磷酸調(diào)pH2.5）=35∶65，流速：1.2 mL/min，檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長λex=331 nm，發(fā)射波長λem= 500 nm，柱溫28℃，進樣量20 μL。

1.4.8 突變株的遺傳穩(wěn)定性實驗 將篩選得到的相對高產(chǎn)Monacolin K、低產(chǎn)桔霉素的紫色紅曲霉誘變菌株在固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代5次，檢測各誘變菌株第5代的Monacolin K含量，研究其遺傳穩(wěn)定性能，方法參見1.4.6。

1.4.9 突變株生物量的測定 干重法測定菌體生物量：取15 mL發(fā)酵液用3層紗布過濾，再用蒸餾水洗滌2～3次，擰干水分，在60℃烘箱中烘干至恒重，即為菌絲體干重［27］。

生物量（g/L）=干物質(zhì)質(zhì)量/發(fā)酵液體積

1.4.10 突變率的計算 誘變菌株突變率的計算以Monacolin K的含量為標(biāo)準(zhǔn)。將Monacolin K含量降低或提高20%以上的誘變菌株定義為突變株。正突變株即指Monacolin K含量提高20%以上的突變株。計算公式如下［28］：

突變率（%）=突變株數(shù)/總誘變株數(shù)

正突變率（%）=Monacolin K含量提高20%以上的突變株數(shù)/總誘變菌株數(shù)

負(fù)突變率（%）=Monacolin K含量降低20%以上的突變株數(shù)/總誘變菌株數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)曲線

線性回歸方程：y=32768x+31956，R2=0.9992，證明Monacolin K在5～200 mg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 誘變菌株初篩

圖1 誘變前（a）后（b）菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology before（a）and after（b）M1 mutagenesis

以紫色紅曲霉M1為例，a圖為輻照前孢子懸液（稀釋100倍）涂布平板后長出的菌落，b圖為輻照后孢子懸液（稀釋100倍）涂布平板得到的菌落。通過對比可知，經(jīng)輻照處理后菌落數(shù)明顯降低，部分菌株的菌落直徑明顯小于出發(fā)菌株，菌落色澤呈現(xiàn)橙紅色，而部分菌株各個時期的菌落直徑均大于出發(fā)菌株相應(yīng)時期的菌落直徑，其生長速度明顯快于出發(fā)菌株。因此，輻照處理后，初步篩選出菌落形態(tài)與出發(fā)菌株有明顯差異、生長較快或較紅的單菌落，接于試管斜面保存。

2.3 誘變菌株復(fù)篩

紫色紅曲霉M1初篩共得到71株誘變菌株，以Monacolin K含量為計算標(biāo)準(zhǔn)，得出紫色紅曲霉M1的突變率為74.64%，其中正向突變率為60.56%，負(fù)向突變率為14.08%，其中有12株突變株Monacolin K含量較高，與出發(fā)菌株相比提高了1倍以上，結(jié)果見圖2。紫色紅曲霉M2初篩共得到67株誘變菌株，突變率為56.72%，其中正向突變率為32.84%，負(fù)向突變率為23.88%，其中有5株突變株Monacolin K含量較高，4株與出發(fā)菌株相比提高了1倍左右，另外一株與出發(fā)菌株相比提高了2倍多，結(jié)果見圖3。

圖2 出發(fā)菌株M1與其突變株的Monacolin K產(chǎn)量Fig.2 The Monacolin K production of original strains M1 and its mutant strains

圖3 出發(fā)菌株M2與其突變株的Monacolin K產(chǎn)量Fig.3 The Monacolin K production of original strains M2 and its mutant strains

2.4 高產(chǎn)Monacolin K突變株產(chǎn)桔霉素的情況

2.4.1 桔霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線 線性回歸方程：y=3263493x+49697，R2=0.9962，桔霉素在0.05～16 mg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 突變株的桔霉素含量 將復(fù)篩得到的一些較出發(fā)菌株高產(chǎn)Monacolin K的突變株，參照1.4.7方法檢測各突變株產(chǎn)桔霉素情況，結(jié)果見表1。

由表1可見，各突變株產(chǎn)桔霉素能力相差不大，與出發(fā)菌株的桔霉素含量相比均下降了93%以上。故選擇Monacolin K含量較高、桔霉素含量相對較少的紅曲霉M1-20、M1-21、M1-23、M1-36、M1-40和M2-3、M2-4、M2-45、M2-46、M2-48突變株進行菌株的遺傳穩(wěn)定性實驗。

表1 突變株產(chǎn)Monacolin K和桔霉素的情況Table1 Mutant strains produce Monacolin K and citrinin

2.5 突變株的遺傳穩(wěn)定性實驗

為檢測突變株的遺傳穩(wěn)定性，對篩選出的10株突變株連續(xù)傳代5次，采用HPLC法檢測突變株中Monacolin K含量。由圖4和圖5可見，紅曲霉M1-20、M1-21、M1-23、M1-36、M1-40和M2-3、M2-4、M2-45、M2-46、M2-48突變株經(jīng)5次傳代培養(yǎng)后產(chǎn)Monacolin K能力分別下降了4.2%、65.1%、20.75、6.2%、80.7%和10.6%、1.65%、38.0%、33.8%、72.6%，其中M1-20和M2-4突變株遺傳性能比較穩(wěn)定，Monacolin K產(chǎn)量相對較高，故選擇該菌株作為繼續(xù)研究的菌株。

圖4 紫色紅曲霉M1突變株傳代穩(wěn)定性Fig.4 Monascus Purpureus M1 mutant subculture stability

圖5 紫色紅曲霉M2突變株傳代穩(wěn)定性Fig.5 Monascus Purpureus M2 mutant subculture stability

2.6 突變株Monacolin K產(chǎn)量及生物量的測定

將遺傳穩(wěn)定的突變株M1-20和M2-4搖瓶發(fā)酵，參照方法1.4.6和1.4.9分別測定突變株的Monacolin K產(chǎn)量和菌體生物量，出發(fā)菌株做同樣處理。如圖6和圖7所示，菌體生長基本符合S形生長曲線，菌體生物量在7 d左右達(dá)到最大值，且突變株M1-20和M2-4的生物量較出發(fā)菌株有一定提高。突變株M1-20和M2-4在4～5 d時開始積累Monacolin K，第6 d時Monacolin K積累進入對數(shù)期，速度明顯加快。Monacolin K主要在菌體生長的穩(wěn)定期積累，且突變株M1-20和M2-4的Monacolin K產(chǎn)量明顯高于出發(fā)菌株，到第13 d時Monacolin K的合成量趨于穩(wěn)定，此時部分細(xì)胞發(fā)生裂解死亡引起產(chǎn)量細(xì)微的波動。

圖6 突變株M1-20生物量及Monacolin K產(chǎn)量Fig.6 Biomass and Monacolin K yield of mutant M1-20

圖7 突變株M2-4生物量及Monacolin K產(chǎn)量Fig.7 Biomass and Monacolin K yield of mutant M2-4

3 結(jié)論

利用北京正負(fù)電子對撞機模擬宇宙粒子組成的混合粒子場輻照處理紫色紅曲霉M1和M2，通過觀察紅曲霉的菌落形態(tài)、HPLC法檢測Monacolin K和桔霉素含量、遺傳穩(wěn)定性實驗來篩選穩(wěn)定的高產(chǎn)Monacolin K，低產(chǎn)桔霉素的突變株，最終篩選出M1-20和M2-4兩株穩(wěn)定高產(chǎn)的突變株。突變株M1-20、M2-4發(fā)酵液中Monacolin K含量分別達(dá)到了421.69 mg/L和406.68 mg/L，與出發(fā)菌株相比分別提高了142.14%和101.27%，其經(jīng)5次傳代培養(yǎng)后產(chǎn)Monacolin K的性能僅下降了4.2%和1.65%，表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定性，可作為進一步研究的菌株。與傳統(tǒng)的誘變育種相比，混合粒子場誘變具有誘變作用強、誘變率高、變異幅度廣和有益變異多等優(yōu)點，可從中獲得豐富的突變株，在提高誘變效率、提高紅曲霉生產(chǎn)潛力、改良品質(zhì)方面起到理想的效果，特別是可從中獲得傳統(tǒng)育種難以獲得優(yōu)質(zhì)紅曲霉突變株。因此，高能混合粒子場已成為微生物誘變育種的新途徑。

［1］楊悅，王碩，杜欣軍，等.不同培養(yǎng)基對紫色紅曲霉發(fā)酵規(guī)律的影響［J］.食品科技，2014，39（8）：21-27.

［2］Shi Y C，Pan T M.Beneficial effects of Monascuspurpureus NTU 568-fermented products：a review［J］.Applied Microbiology &Biotechnology，2011，90（4）：1207-1217.

［3］Mapari S A.Fungal polyketideazaphilone pigments as future natural food colorants［J］.Trends in Biotechnology，2010，28（6）：300-307.

［4］張銳.紅曲霉液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素的工藝優(yōu)化［J］.生物技術(shù)通報，2015，31（2）：187-195.

［5］Endo A.Monacolin K，a new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species.［J］.Journal of Antibiotics，2000，32（8）：852-854.

［6］楊歡歡，胡中澤.紅曲菌的復(fù)合誘變及其固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2012（11）：247-251.

［7］李滔滔，李小龍，張鳳琴.高產(chǎn)洛伐他汀紅曲菌株的誘變選育［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（24）：246-248.

［8］Obata K，Ito M，Ochi R，et al.Pharmacological properties of the postsynaptic inhibition by Purkinje cell axons and the action of γ-aminobutyric acid on Deitersneurones［J］.Experimental Brain Research，1967，4（1）：43-57.

［9］何曉嬌，陳璨，周月婷，等.高產(chǎn)γ-氨基丁酸低產(chǎn)桔霉素紅曲霉（Monascusruber）突變子1047篩選與發(fā)酵特性研究［J］.微生物學(xué)雜志，2014，34（5）：38-43.

［10］張圓林，王昌祿，陳勉華，等.高產(chǎn)γ-氨基丁酸的紅曲霉菌株篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2014，32（5）：35-40.

［11］黃志兵，許楊，張泓，等.紅曲菌幾種主要次級代謝產(chǎn)物及其生物活性的研究進展［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（4）：143-148.

［12］王璐.農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化及原生質(zhì)體融合法選育紅曲菌Monacolin K高產(chǎn)株［D］.無錫：江南大學(xué)，2011.

［13］李晶，馬貴民，馮曉明，等.紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物Monacolin K的研究進展與應(yīng)用［J］.食品工程，2014（2）：9-11.

［14］胡延嶺，劉錄祥，郭會君，等.高能混合粒子場誘發(fā)的小麥矮桿突變體的SSR分析［J］.核農(nóng)學(xué)報，2008，22（4）：399-403.

［15］俞法明，嚴(yán)文潮，毛雪琴，等.利用空間誘變技術(shù)進行早秈稻新品種的改良［J］.核農(nóng)學(xué)報，2014，28（6）：949-954.

［16］董亞琳，張洪偉，代秀云.空間環(huán)境誘變育種技術(shù)及應(yīng)用［J］.農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2010，33（3）：21-23.

［17］高桐梅，衛(wèi)雙玲，李春明，等.芝麻太空誘變效應(yīng)及AFLP標(biāo)記檢測［J］.華北農(nóng)學(xué)報，2013，28（1）：227-233.

［18］黃永相，郭濤，蔡金洋，等.空間環(huán)境和60Co-γ輻照對水稻稻米品質(zhì)的誘變效應(yīng)［J］.核農(nóng)學(xué)報，2013，27（6）：709-714.

［19］趙金濤，郭新梅，裴玉賀，等.高能混合粒子場對玉米幼苗生長及抗氧化系統(tǒng)的影響［J］.核農(nóng)學(xué)報，2014，28（12）：2133-2138.

［20］張文濤，杜久元，白斌.作物空間誘變及其在遺傳育種中的應(yīng)用［J］.種子，2014，33（4）：48-52.

［21］于新玲，劉錄祥，喬利仙，等.高能混合粒子場輻照對花生胚小葉組織培養(yǎng)及植株再生的影響［J］.核農(nóng)學(xué)報，2012，26 （3）：433-438.

［22］劉錄祥，韓微波，郭會君，等.高能混合粒子場誘變小麥的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)研究［J］.核農(nóng)學(xué)報，2005，19（5）：327-331.

［23］李滔滔.高產(chǎn)洛伐他汀紅曲霉菌誘變育種及其在醬油廢水中的應(yīng)用［D］.株洲：湖南工業(yè)大學(xué)，2013.

［24］印紅，謝申義，章光明，等.利用返回式飛船選育優(yōu)良紅曲霉菌［J］.核農(nóng)學(xué)報，2004，18（4）：297-299.

［25］胡文效，魏彥鋒，蔣錫龍，等.高產(chǎn)Monacolin K紅曲霉菌種的誘變選育及液態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化［J］.食品工業(yè)科技，2013，34 （24）：296-301.

［26］黃艷，孟麗茹，許贛榮，等.高產(chǎn)色素紅曲菌的選育及搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化［J］.中國食品添加劑，2013（6）：133-139.

［27］付海平.產(chǎn)Monacolin K紅曲霉的篩選及其發(fā)酵條件的研究［D］.長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［28］邱雯雯，任雅琳，陳存社，等.常壓室溫等離子體誘變篩選高乳糖酶活力酵母的研究［J］.中國食品學(xué)報，2014，14（2）：132-137.

Using high-energy hybrid particle field mutation breeding high yield Monacolin K and low yield citrinin of Monascus strains

LANG Tian-dan1，LIANG Jian1，WANG Cheng-tao1，2，ZHANG Chan1，2，*，LIU Lu-xiang3
（1.Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives，Beijing 100048，China；2.Beijing Laboratory of Food Quality and Safety，Beijing Technology and Business University（BTBU），Beijing 100048，China；3.Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，National Center of Space Mutagenesis for Crop Improvement，Beijing 100081，China）

Using of the Beijing electron-positron collider linear accelerator E2 beam shooting produce highenergy hybrid particle field processed two Monascus Purpureus strains M1 and M2 with the dose of 64.3 Gy，after initial and second screening，using HPLC method to detect the Monacolin K content in the mutant，and genetic stability experiments，thus breeding high Monacolin K and low yield citrinin mutant.The results showed that:after hybrid particle field irradiated，Monascus Purpureus M1 and M2 obtained 43 and 22 high yield Monacolin K mutants，respectively，the mutation rate was 74.64%and 56.72%，respectively，in which the positive mutation rate was 60.56%and 32.84%，respectively.Monacolin K content of M1-20 and M2-4 mutant reached 421.69 mg/L and 406.68 mg/L，which improved 142.14%and 101.27%than the original strain，respectively，Monacolin K content of M1-20 and M2-4 mutant decreased 4.21%and 1.65%after subculture for 5 times，respectively，and citrinin content of two mutant were between 0.01 mg/L and 0.04 mg/L，which compared with the original strain，citrinin content were significantly decreased.High-energy hybrid particle field could cause colony morphology and color change of Monascus Purpureus，high mutation rate，the mutant strains of genetic stable performance could be obtained，it was a kind of new method that could be applied in the microbial mutation breeding.

Monascus Purpureus；Monacolin K；hybrid particle field；strain screening

TS201.3

A

1002-0306（2016）02-0165-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.025

2015－06－10

郎天丹（1991-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：langtiandan@163.com。

*通訊作者：張嬋（1984-），女，博士，副教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：zhangchan@th.btbu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金項目（31301411）；北京市教委（KM201410011009）；北京市科技計劃項目（Z151100001215008）。