孫新榮,　仲彩萍*,　裴建文,　孫萬倉

(1. 甘肅省定西市渭源縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,748200; 2. 天水師范學(xué)院,現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與隴東南動植物資源研究保護開發(fā)中心,天水　741001; 3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,蘭州　730070)

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半夏防御酶系對Fusariumoxysporum和Phytophthoraparasitica侵染的動態(tài)反應(yīng)

孫新榮1,仲彩萍1*,裴建文2,孫萬倉3

(1. 甘肅省定西市渭源縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,748200; 2. 天水師范學(xué)院,現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與隴東南動植物資源研究保護開發(fā)中心,天水741001; 3. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,蘭州730070)

尖孢鐮刀菌(FusariumoxysporumSchlecht)和寄生疫霉(PhytophthoraparasiticaDastur)分別為引起半夏塊莖腐爛病和疫病的病原,為探索半夏在受到這2種病原侵染時的生理生化反應(yīng),采用室內(nèi)盆栽方法,研究超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)5種寄主防御酶活性在塊莖腐爛病和疫病發(fā)生過程中的變化趨勢。結(jié)果表明,半夏在接種2種病原菌后,分別于第2天和第3天出現(xiàn)發(fā)病癥狀,第5天病情指數(shù)分別高達70.3、70.6;SOD活性都于接種后第1天達到高峰,POD活性都于接種后第3天達到高峰,CAT活性都于接種后第2天達到高峰,PAL活性分別于接種后第2天和第3天達到高峰,而PPO活性分別于接種后第3天和第4天有小幅上升。初步表明,在寄主顯癥之前或發(fā)病初期酶活性達到高峰的SOD、POD、CAT、PAL在半夏抗病生理機制中起著重要作用,在半夏抗病種質(zhì)篩選時需要重點關(guān)注。

半夏;塊莖腐爛病;疫病;防御酶

在甘肅清水縣半夏規(guī)范化種植(GAP)基地,由尖孢鐮刀菌(FusariumoxysporumSchlecht)侵染引起的塊莖腐爛病和寄生疫霉(PhytophthoraparasiticaDastur)侵染引起的葉部疫病是危害半夏生長的主要病害。一般年份塊莖腐爛病發(fā)病率為15%～30%,葉部疫病發(fā)病率高達20%以上,造成產(chǎn)量損失高達30%以上[1-2]。實驗室前期報道了塊莖腐爛病和葉部疫病病原鑒定以及藥劑防治的結(jié)果。但半夏屬藥用植物,為確保綠色中藥材生產(chǎn),應(yīng)以篩選、種植抗病品種作為有效的防治途徑。目前國內(nèi)有關(guān)半夏病害的研究報道很少,也沒有鑒定出抗性材料。因此,本試驗選用甘肅半夏主栽品種‘桃葉半夏’(感病品種)為試驗材料,比較5種寄主防御酶活性在接種后的變化動態(tài),初步探討半夏接種尖孢鐮刀菌和寄生疫霉后發(fā)病進程與酶活性變化之間的關(guān)系,旨在為半夏抗病品種選育中生理指標(biāo)的選擇提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

供試半夏:選用甘肅清水縣半夏GAP生產(chǎn)基地的主栽品種‘桃葉半夏’,3月20日種植于裝有滅菌土的花盆中,每盆36株。

供試菌種:尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)和寄生疫霉(P.parasitica)由感病植株分離獲得,經(jīng)柯赫氏法則驗證為致病菌[1-2]。

1.2方法

1.2.1接種及取樣

分別于6月1日和7月5日采用灌根法和葉部針刺法將尖孢鐮刀菌和寄生疫霉接種到定植于無菌土中的成株期健康半夏植株上。接種前每盆定植30株,每個處理接種3盆,每盆接種30株。分別于接種前和接種后1、2、3、4、5 d采集接種植株和對照植株葉片,每次取不同盆中發(fā)病程度一致的病葉10片,液氮處理后,-20 ℃冰箱保存待用。3次重復(fù)。

灌根接種法[3]:接種前將PSA上培養(yǎng)5 d的尖孢鐮刀菌菌落用無菌水配成1.0×106個/mL的孢子懸浮液,每盆接種量100 mL,以無菌水灌根作為對照。3次重復(fù)。

針刺接種法[3]:預(yù)先在胡蘿卜瓊脂(CA)平板上培養(yǎng)寄生疫霉備用。接種前將種植于滅菌土中的半夏健康植株葉片用無菌水洗凈,然后用70%乙醇擦洗組織表面,晾干后用滅菌針輕微刺傷葉子表皮。然后用6 mm滅菌打孔器在培養(yǎng)了5 d的寄生疫霉菌落邊緣打取菌絲塊,將菌絲塊反貼到葉片上,將無菌濕棉團敷在菌絲塊上,套上透光度好的白色塑料袋保濕5 d,以不接種并相同方法保濕的葉片作對照。3次重復(fù)。

1.2.2SOD、POD、PPO、CAT酶液制備與活性測定

稱取0.5 g葉片,加入0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.8),在冰浴上研磨成勻漿后定容至8 mL,12 000 r/min(4 ℃)離心20 min,上清液即為粗酶提取液,4 ℃冰柜中保存;SOD、POD活性測定參照李合生等[3]的方法;PPO活性測定參照朱廣廉等[4]的方法;CAT活性測定參照鄒琦[5]的方法。每處理3次重復(fù)。

1.2.3PAL酶液制備與活性測定

稱取0.5 g葉片,加入0.1 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),再加入0.05 mol/L的硼酸緩沖溶液50 mL(pH 8.8,含有0.005 mol/L巰基乙醇),冰浴勻漿,10 000 r/min離心15 min,上清液用于酶活性測定;PAL活性測定參照鄒芳斌等[6]的方法。每處理3次重復(fù)。

1.2.4病害調(diào)查

分別于接種后觀察發(fā)病情況并計算病情指數(shù)。病害分級標(biāo)準(zhǔn)見表1。

2　結(jié)果與分析

2.1接種后病害發(fā)生情況

2.1.1接種尖孢鐮刀菌后半夏發(fā)病情況

半夏接種尖孢鐮刀菌后第2天開始發(fā)病。此時地上部分正常,地下根系也正常,僅塊莖出現(xiàn)腐爛癥狀,腐爛部分用手捏易脫皮,且有少量糊狀物流出,并伴有臭味。發(fā)病后第2 天病情指數(shù)由12.5增加到70.3,第5天時根系部分已出現(xiàn)壞死且伴有惡臭味,地上葉片部分出現(xiàn)萎蔫(表2)。

2.1.2接種寄生疫霉后半夏發(fā)病情況

半夏葉部接種寄生疫霉后第3天開始發(fā)病。發(fā)病葉片出現(xiàn)明顯的水浸狀斑點,發(fā)病后第3天病情指數(shù)由7.5增加到70.6,部分斑病已擴大至占整葉片的1/2以上,第5天時部分葉片已出現(xiàn)萎蔫(表2)。接種一周時萎蔫倒苗。

2.2酶活性變化動態(tài)

2.2.1SOD活性變化動態(tài)

接種尖孢鐮刀菌和寄生疫霉后葉片中SOD活性迅速升高,并且在第1天達到高峰,然后開始下降,但始終高于對照(圖1)。SOD活性峰值分別為257.97 U/(g·min)和129.86 U/(g·min),最大增幅分別比對照高77.1%和59.9%。

表1　半夏塊莖腐爛病和疫病嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)Table 1　Severity scale system of Pinellia ternate after inoculated with Fusarium oxysporum and Phytophthora parasitica

表2　接種尖孢鐮刀菌和寄生疫霉后半夏發(fā)病情況Table 2　Disease index of Pinellia ternate after inoculated with Fusarium oxysporum and Phytophthora parasitica

2.2.2POD活性變化動態(tài)

接種尖孢鐮刀菌和寄生疫霉后葉片中POD活性都出現(xiàn)上升,并且在第3天達到高峰,3天后又開始下降。接種尖孢鐮刀菌比接種寄生疫霉后POD活性上升速度較快,并且上升幅度也較大,而下降速度也較快,分別于第4天和第5天接近于對照(圖2)。POD活性峰值分別為436.61 U/(g·min)和117.95 U/(g·min),最大增幅分別比對照高559.7%和197.8%。

2.2.3CAT活性變化動態(tài)

接種尖孢鐮刀菌和寄生疫霉后葉片中CAT活性呈先升高后下降趨勢,都在第2天達到高峰,峰值分別為69.28 U/(g·min)和38.95 U/(g·min),最大增幅分別比對照高52.3%和210.0%。第2天后都開始下降,接種尖孢鐮刀菌的CAT活性下降至低于對照,而接種寄生疫霉的CAT活性在第4天又略有升高,然后低于對照(圖3)。

圖1　接種尖孢鐮刀菌和寄生疫霉后半夏葉片SOD活性Fig.1　Change of SOD activity after inoculated with Fusarium oxysporum and Phytophthora parasitica in Pinellia ternate

圖2　接種尖孢鐮刀菌和寄生疫霉后半夏葉片POD活性Fig.2　Change of POD activity after inoculated with Fusarium oxysporum and Phytophthora parasitica in Pinellia ternate

圖3　接種尖孢鐮刀菌和寄生疫霉后半夏葉片CAT活性Fig.3　Change of CAT activity after inoculated with Fusarium oxysporum and Phytophthora parasitica in Pinellia ternate

2.2.4PPO活性變化動態(tài)

接種尖孢鐮刀菌前2天葉片中PPO活性無明顯變化趨勢,第3天明顯升高，第4天達到峰值；接種寄生疫霉前3天葉片中PPO活性無明顯變化，感病后期第4天出現(xiàn)突然升高(圖4)。接種尖孢鐮刀菌和寄生疫霉后第4天時病情指數(shù)分別高達40.2和35.1,此時PPO活性的升高可能是感病后的生理反應(yīng)。

圖4　接種尖孢鐮刀菌和寄生疫霉后半夏葉片PPO活性Fig.4　Change of PPO activity after inoculated with Fusarium oxysporum and Phytophthora parasitica in Pinellia ternate

2.2.5PAL活性變化動態(tài)

接種尖孢鐮刀菌和寄生疫霉后葉片中PAL活性呈先升高后下降趨勢,分別于第2天和第3天達到高峰,然后開始下降(圖5)。接種尖孢鐮刀菌比接種寄生疫霉后PAL活性上升速度快,峰值分別為790.59 U/(g·h)和190.57 U/(g·h),最大增幅分別比對照高200.0%和265.2%。

圖5　接種尖孢鐮刀菌和寄生疫霉后半夏葉片PAL活性Fig.5　Change of PAL activity after inoculated with Fusarium oxysporum and Phytophthora parasitica in Pinellia ternate

3　討論

接種尖孢鐮刀菌和寄生疫霉后半夏分別于第2天和第3天出現(xiàn)發(fā)病癥狀,并且病害隨時間延長逐漸加重,病情變化較快,第5天時病情指數(shù)分別高達70.3和70.6,而且少數(shù)葉片已出現(xiàn)萎蔫,這和大田發(fā)病情況基本一致?？赡芘c半夏植株矮小(大田栽培地上部分高6 cm左右)、葉柄纖細(xì)弱小(葉柄粗2.5 mm左右)有關(guān),一旦發(fā)病就很快出現(xiàn)倒苗。

植物體內(nèi)的SOD、POD、CAT、PPO和PAL等防御酶都與抗病性有關(guān)。SOD、POD與CAT共同組成一個防御體系,能有效清除植物體內(nèi)的自由基和過氧化物[7]。從本試驗結(jié)果看,接種尖孢鐮刀菌和寄生疫霉后SOD活性高峰都出現(xiàn)在第1天,即在發(fā)病前。CAT活性高峰都出現(xiàn)在第2天,即在發(fā)病初期。POD活性高峰都出現(xiàn)在第3天,但在接種尖孢鐮刀菌后的第2天POD活性已接近高峰,因此POD高活性也出現(xiàn)在發(fā)病初期。說明這個體系在半夏防御病原侵染中起重要作用。PAL則是苯丙烷類代謝途徑中的第一個關(guān)鍵酶,與植物抗毒素及酚類化合物的形成密切相關(guān)[8-9]。本試驗中PAL活性高峰分別出現(xiàn)在第2天和第3天,即在發(fā)病初期,也是半夏重要的防御反應(yīng)。另外,‘桃葉半夏’接種尖孢鐮刀菌和寄生疫霉2種病原后SOD、POD、CAT、PPO、PAL活性變化趨勢基本一致,對不同病原菌的反應(yīng)沒有明顯特異性。

PPO通過催化木質(zhì)素及醌類化合物形成,使細(xì)胞免受病菌的侵害[10]。房保海等在煙草上研究表明PPO活性與植物抗病性緊密相關(guān),抗感病品種早期PPO活性均升高,后期下降[11]。劉守偉等在黃瓜上研究表明抗感品種PPO活性都先升后降[12]。本試驗表明,接種2種病原菌后PPO活性在發(fā)病前期無明顯變化,發(fā)病后期突然升高的表現(xiàn)也是寄主染病后的生理變化。邵登魁等在白菜型冬油菜白粉病病程中發(fā)現(xiàn)PPO活性變化與病害侵染無明顯相關(guān)性[13]?？梢?在寄主顯癥之前或發(fā)病初期達到活性高峰的SOD、POD、CAT、PAL在半夏抗病生理機制中起著重要作用,在半夏抗病種質(zhì)篩選時需要重點關(guān)注。

本研究只是初步探討了‘桃葉半夏’接種尖孢鐮刀菌和寄生疫霉后SOD、POD、CAT、PPO、PAL活性變化動態(tài)以及發(fā)病進程與酶活性變化之間的關(guān)系,對不同地方品種防御酶活性變化規(guī)律以及外界化合物誘導(dǎo)抗性方面有待進一步深入研究。

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(責(zé)任編輯：田喆)

Dynamic responses of the defensive enzymes inPinelliaternatetoFusariumoxysporumandPhytophthoraparasitica

Sun Xinrong1,Zhong Caiping1,Pei Jianwen2,Sun Wancang3

(1. Extension Station of Agricultural Technology, Weiyuan County, Dingxi, Gansu748200, China; 2. Protection and Research Institute of Modern Agriculture and Animal and Plant Resources of Southeast Gansu, Tianshui Normal University, Tianshui741001, China; 3. College of Agronomy, Gansu Agricultural University, Lanzhou730070, China)

The activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), catalase (CAT), polyphenol oxidase (PPO) and phenylalanine ammonia-lyase (PAL) were studied in the leaves of peach-leaf typePinelliaternatainoculated withFusariumoxysporumSchlecht andPhytophthoraparasiticaDastur. The results showed that the disease index ofP.ternateinoculated withF.oxysporumandP.parasiticawere 70.3 and 70.6 on the fifth day, respectively. The peaks of SOD, POD and CAT, treated withF.oxysporumandP.parasitica, were observed on the first, third and second day, respectively. The peak of PAL inoculated withF.oxysporumandP.parasiticawere observed on the second day and the third day. The activities of PPO inoculated withF.oxysporumandP.parasiticarose slightly on the 3rd day and the 4th day, respectively. These results preliminarily showed that the activity of SOD, POD, CAT and PAL should be considered in screening varieties.

Pinelliaternate;rotten tuber;Phytophthorablight;defensive enzyme

2015-02-09

2015-04-27

天水市重大科技攻關(guān)項目(2005-18)

E-mail:zcp620727@163.com

S 435.67

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.019