張艷，李海龍，王虎平，，顧靜，馬春林，，吳紅彥，.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

阿魏酸對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響

張艷1，李海龍2，王虎平1，2，顧靜2，馬春林1，2，吳紅彥1，2
1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；
2.甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

目的 觀察阿魏酸對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響，探討其誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。方法 不同濃度阿魏酸干預(yù)體外培養(yǎng)人胃癌MGC-803細(xì)胞，作用24、48、72 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖；不同濃度（0、5、7.5、10 mg/mL）阿魏酸作用MGC-803細(xì)胞48 h，Annexin V-FITC/PI法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，RT-qPCR和Western-blot檢測(cè)Capase-3、Capase-9、Bax、Bcl-2和Xiap的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組比較，5、7.5、10、12.5 mg/mL阿魏酸作用MGC-803細(xì)胞的OD值明顯降低，阿魏酸抑瘤作用明顯，阿魏酸作用MGC-803細(xì)胞24、48、72 h的IC50分別為12.93、9.73、5.52 mg/mL；5、7.5、10 mg/mL阿魏酸作用MGC-803細(xì)胞48 h后均能誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡，5、7.5、10 mg/mL阿魏酸均能上調(diào)Capase-3、Capase-9和Bax的mRNA和蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2和Xiap的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)論 阿魏酸能有效抑制MGC-803細(xì)胞增殖，并能誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與內(nèi)源性線粒體凋亡途徑和下調(diào)Xiap的表達(dá)有關(guān)。

阿魏酸；胃癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

阿魏酸是多種中藥如川芎、當(dāng)歸、升麻、木賊、蒲公英、酸棗仁等的有效成分之一，現(xiàn)代藥理研究表明，阿魏酸具有抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、抗凝、解毒、保肝、調(diào)節(jié)免疫等功效［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸乙酯可抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖并且誘導(dǎo)凋亡［2］。然而，阿魏酸是否可抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖并且誘導(dǎo)凋亡尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬用阿魏酸干預(yù)胃癌MGC-803細(xì)胞，觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響，并探討其誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1細(xì)胞株

胃癌MGC-803細(xì)胞，北京協(xié)和腫瘤研究所。

1.2主要試劑與儀器

高糖DMED培養(yǎng)基（健順生物公司），胎牛血清（杭州四季青公司），阿魏酸（上海紫一試劑廠），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物公司），PCR擴(kuò)增試劑盒（上海柏業(yè)生物公司），一抗兔抗Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax、Xiap和GAPDH（Affinity公司），二抗（Immunoway生物公司），噻唑藍(lán)（MTT，北京索來寶科技有限公司）。CO2培養(yǎng)箱（力康公司），低溫離心機(jī)（Beckman公司），電泳儀（北京六一儀器廠），微量上樣器（上海生工生物工程有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%FBS高糖DMEM，加入青霉素100 U/mL、鏈霉素 1 mg/mL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)MGC-803細(xì)胞。每隔2 d換完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)按1∶2比例傳代。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長期胃癌細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照5×103個(gè)/mL密度接種于96孔板，每孔100 μL（另設(shè)只加PBS的空白調(diào)零孔），每組8孔，37 ℃孵育過夜。正常組加100 μL DMEM完全培養(yǎng)基，藥物組加80 μL DMEM完全培養(yǎng)基及藥物20 μL，使終體積為200 μL。藥物作用24、48、72 h后各組每孔加20 μL MTT，繼續(xù)孵育4 h，小心吸去上清液，每孔加150 μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，于酶標(biāo)儀波長490 nm處檢測(cè)各孔光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率（%）=1-（實(shí)驗(yàn)組平均值÷對(duì)照組平均值）×100%。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

不同濃度阿魏酸（0、5、7.5、10 mg/mL）作用于對(duì)數(shù)期MGC-803細(xì)胞48 h，用胰酶消化并收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞并吹打成細(xì)胞懸液，取部分細(xì)胞懸液加入Binding Buffer，再加5 μL Annexin V混勻后，加5 μL碘化丙啶混勻，室溫、避光反應(yīng)10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4RT-qPCR檢測(cè) Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2 和Bax mRNA表達(dá)

不同濃度阿魏酸（0、5、7.5、10 mg/mL）作用于對(duì)數(shù)期MGC-803細(xì)胞48 h，提取各加藥組和對(duì)照組（只加培養(yǎng)液）的總RNA，37 ℃、15 min，85 ℃、5 s反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR引物均由大連寶生物公司合成（見表1）。擴(kuò)增條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，RT-qPCR檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。PCR反應(yīng)結(jié)束后分析融解曲線，從而判定擴(kuò)增產(chǎn)物是否有非特異性擴(kuò)增；分析擴(kuò)增曲線，計(jì)算Ct值，2￣ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1　PCR引物序列

2.5Western blot檢測(cè) Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)

不同濃度阿魏酸（0、5、7.5、10 mg/mL）作用于對(duì)數(shù)生長期MGC-803細(xì)胞干預(yù)48 h，加入蛋白裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）提取總蛋白，將蛋白煮沸變性后，經(jīng)8%SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白分離，濕轉(zhuǎn)至 PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉 1.5 h，一抗（Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax和Xiap）孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，加入ECL于Bio-rad凝膠成像儀中進(jìn)行反應(yīng)，采用美國Image J2x軟件對(duì)Western blot結(jié)果進(jìn)行定量分析，灰度值以累積吸光度值表示，結(jié)果以目的蛋白與GAPDH累積吸光度的比值表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1阿魏酸對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較，5、7.5、10、12.5 mg/mL阿魏酸作用胃癌MGC-803細(xì)胞各時(shí)點(diǎn)OD值明顯降低，阿魏酸各劑量組抑瘤作用明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01），并與濃度呈正相關(guān)，見表2。阿魏酸作用胃癌MGC-803細(xì)胞24、48、72 h的IC50分別為12.93、9.73、5.52 mg/mL。

表2　各組胃癌MGC-803細(xì)胞增殖比較（±s）

表2　各組胃癌MGC-803細(xì)胞增殖比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001（下同）

組別 　n 劑量/（mg/mL） 　24 h 　48 h 　72 h OD值 　抑制率/% 　 OD值 　抑制率/% 　 OD值 　抑制率/%對(duì)照組 　6 　　0.478±0.117 　0.00±0.00 　0.701±0.135 　 0.00±0.00 　0.845±0.120 　0.00±0.00阿魏酸組 　6 　 1.25 　0.443±0.089 　7.32±1.05 　0.663±0.066 　 5.45±1.02 　0.644±0.197*　23.80±1.86 6 　 2.5 　0.445±0.098 　6.92±0.97 　0.640±0.049*　 8.75±1.45 　0.538±0.062**　36.33±2.88 6 　 5 　0.425±0.026*　11.15±1.56 　0.507±0.047**　27.68±2.14 　0.362±0.158**　57.20±3.20 6 　 7.5 　0.407±0.076*　14.86±1.48 　0.397±0.039**　43.40±2.58 　0.322±0.048**　61.89±3.24 6 　10 　0.283±0.027**　40.72±2.42 　0.341±0.131**　51.32±3.45 　0.294±0.224**　65.20±4.65 6 　12.5 　0.220±0.094**　53.96±2.96 　0.271±0.168**　61.35±3.99 　0.157±0.018**　81.42±4.76

4.2阿魏酸對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，5、7.5、10 mg/mL阿魏酸可明顯誘導(dǎo)人胃癌MGC-803細(xì)胞發(fā)生凋亡，見圖1。其細(xì)胞凋亡率分別為（22.47±3.20）%、（47.45± 8.76）%、（74.55±10.34）%，較對(duì)照組（2.50±0.42）%明顯升高。

4.3阿魏酸對(duì)胃癌 MGC-803細(xì)胞 Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax和Xiap mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，5、7.5、10 mg/mL阿魏酸可使胃癌MGC-803細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、Bax mRNA表達(dá)上調(diào)，Bcl-2和Xiap mRNA表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.001），溶解曲線分析表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好。結(jié)果見表3。

表3　各組胃癌MGC-803細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2和Xiap mRNA表達(dá)比較（±s）

表3　各組胃癌MGC-803細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2和Xiap mRNA表達(dá)比較（±s）

組別 　n 　劑量/（mg /mL） 　Caspase-3 　Caspase-9 　Bax 　Bcl-2 　Xiap對(duì)照組 　3 　1 　1 　1 　1 　1阿魏酸組 　3 　 5 　 1.569±0.629**　 1.979±0.402***　3.405±0.440***　0.765±0.081***　 0.073±0.048***3 　 7.5 　 1.752±0.649**　 2.930±0.771***　4.084±1.135***　0.512±0.064***　 0.067±0.006***3 　 10 　 2.401±1.152***　 3.375±0.880***　7.224±1.100***　0.168±0.035***　 0.051±0.002***

4.4阿魏酸對(duì)胃癌 MGC-803細(xì)胞 Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax和Xiap蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，5、7.5、10 mg/mL阿魏酸可使胃癌MGC-803細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表達(dá)不同程度上調(diào)，Bcl-2和Xiap蛋白表達(dá)不同程度下調(diào)（P＜0.05，P＜0.001）。結(jié)果見表4、圖2。

圖1　各組胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖

表4　各組胃癌MGC-803細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2和Xiap蛋白表達(dá)比較（±s）

表4　各組胃癌MGC-803細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2和Xiap蛋白表達(dá)比較（±s）

組別 　n 　劑量/（mg /mL） 　 Caspase-3 　 Caspase-9 　 Bax 　 Bcl-2 　 Xiap對(duì)照組 　3 　　0.354±0.035 　0.041±0.005 　0.365±0.034 　4.002±0.502 　0.915±0.065阿魏酸組 　3 　5 　0.561±0.056*　0.239±0.027***　3.630±0.433***　4.042±0.076 　0.576±0.091**3 　7.5 　1.452±0.154***　0.403±0.051***　4.637±0.572***　0.651±0.642***　0.236±0.036***3 　10 　2.119±0.237***　0.507±0.043***　6.125±0.363***　0.113±0.031***　0.043±0.005***

圖2　各組胃癌MGC-803細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2 和Xiap蛋白表達(dá)免疫印跡電泳圖

5 討論

細(xì)胞凋亡是一種有序的或程序性的死亡方式，受多種基因調(diào)控，是細(xì)胞核受某些特定信號(hào)刺激后進(jìn)行的正常生理反應(yīng)。細(xì)胞凋亡途徑包括線粒體凋亡途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)途徑、死亡受體途徑。細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和進(jìn)行受到精確調(diào)控，具有獨(dú)特而復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，其中，Bax和Bcl-2是Bcl-2家族的2個(gè)成員，通常以復(fù)合物的形式存在。前者為促凋亡因子，后者為抗凋亡因子，在細(xì)胞凋亡過程，促凋亡蛋白Bax可促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)變而開放，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體膜電位的下降，細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)而激活Caspase，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡?？沟蛲龅鞍譈cl-2則可拮抗Bax的上述作用而抑制細(xì)胞凋亡。Caspase-3是Caspase家族中最重要的細(xì)胞凋亡執(zhí)行者之一，在蛋白酶級(jí)聯(lián)切割過程中處于核心位置，一旦Caspase被激活就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。它可以通過死亡受體介導(dǎo)途徑與線粒體依賴途徑來誘發(fā)細(xì)胞凋亡，Caspase-9屬于上游起始Caspase，主要在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑中活化從而激活效應(yīng)Caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［3］。

Xiap充當(dāng)?shù)蛲鲆种频鞍?，并可能與通過其BIR2 和BIR3結(jié)構(gòu)域與Caspase-9的相互作用，抑制其活化并因此激活下游 Caspase-3［4］。相關(guān)研究表明，使用siRNA技術(shù)沉默Xiap基因后，可抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長，并增加細(xì)胞死亡［5］；增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素、順鉑的敏感度［6］，增加白血病細(xì)胞［7］和膀胱癌細(xì)胞［8］對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感度。慢病毒介導(dǎo)的shRNA沉默Xiap基因后在體外和體內(nèi)抑制SW1990胰腺癌細(xì)胞的增殖［9］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5、7.5、10 mg/mL阿魏酸可使MGC-803胃癌細(xì)胞 Caspase-3、Caspase-9、Bax的mRNA和蛋白表達(dá)不同程度上調(diào)，Bcl-2和 Xiap的mRNA和蛋白表達(dá)不同程度下調(diào)，表明阿魏酸可能通過 Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的改變進(jìn)而通過上述途徑導(dǎo)致線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素 C釋放，Caspase-9 和Caspase-3激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，阿魏酸誘導(dǎo)胃癌 MGC-803細(xì)胞凋亡通過線粒體途徑發(fā)揮作用。阿魏酸及其鈉鹽發(fā)揮抗腫瘤作用涉及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、化療增敏、抗血管生成等多個(gè)方面［10］，其中誘導(dǎo)凋亡是阿魏酸發(fā)揮抗腫瘤作用的重要途徑之一，而其他作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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（修回日期：2015-12-01；編輯：華強(qiáng)）

Effects of Ferulic Acid on Gastric Cancer Cell Line MGC-803 Proliferation

ZHANG Yan1，LI Hai-long2， WANG Hu-ping1，2， GU Jing2， MA Chun-lin1，2， WU Hong-yan1，2（1. Basic Medical School， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Herbs and Prescription Innovation and Transformation of Gansu Province， Key Laboratory for TCM New Products Development Engineering of Gansu Province， Lanzhou 730000， China）

Objective To explore the effects of ferulic acid on gastric cancer cell line MGC-803 proliferation； To discuss the mechanism of apoptosis induced by ferulic acid. Methods Ferulic acid with a variety of concentrations was used to treat gastric cancer cell line MGC-803 for 24， 48， 72 h； MTT experiment was used to detect the growth of gastric cancer cells. After gastric cancer cell line MGC-803 were treated with ferulic acid with a variety of concentrations （0， 5， 7.5， 10 mg/mL） for 48 h， all gastric cancer cells were collected and stained by Annexin V-FITC/PI for the detection of apoptosis by flow cytometry. RT-qPCR and Western-blot methods were used to detect mRNA and protein levels of Caspase-3， Caspase-9， Bax， Bcl-2 and Xiap. Results Compared with the control group，the OD value of cell line MGC-803 treated by ferulic acid with a variety of concentrations （5， 7.5， 10， 12.5 mg/mL）decreased significantly； the anti-tumor effect of ferulic acid was obvious； IC50of 24， 48， and 72 hours after treated by ferulic acid was 12.93， 9.73 and 5.52 mg/mL respectively. Cell lineMGC-803 treated by ferulic acid with a variety of concentrations （5， 7.5， 10 mg/mL） after 48 h could induce the apoptosis of MGC-803 cells， up-regulate mRNA and protein levels of Caspase-3， Caspase-9， and Bax， down-regulate mRNA and protein levels of Bcl-2 and Xiap. Conclusion Ferulic acid can inhibit the proliferation of MGC-803 cells effectively and induce the apoptosis of MGC-803 cells， which mechanism is related to mitochondria apoptosis pathway and the down-regulation of Xiap expression.

ferulic acid； gastric cancer； cell proliferation； cell apoptosis

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.09.017

R285.5

A

1005-5304（2016）09-0070-04

甘肅省自然科學(xué)基金（1212RJZA083）

吳紅彥，E-mail：2012964366@qq.com

2015-10-23）