李延輝　謝敏如　葉仕英　康舉齡　夏明汗.廣東省東莞市石碣醫(yī)院病理科，廣東東莞　590；.廣東省東莞市石碣醫(yī)院科教科，廣東東莞　590；.廣東省廣州市暨南大學(xué)附屬一院病理科，廣東東莞　50000

結(jié)腸癌及癌前病變中APRIL和caspase-3蛋白的表達(dá)及其作用

李延輝1謝敏如1葉仕英2康舉齡3夏明汗3
1.廣東省東莞市石碣醫(yī)院病理科，廣東東莞523290；2.廣東省東莞市石碣醫(yī)院科教科，廣東東莞523290；3.廣東省廣州市暨南大學(xué)附屬一院病理科，廣東東莞510000

目的探討結(jié)腸癌及癌前病變中增殖誘導(dǎo)配體（APRIL）和caspase-3蛋白的表達(dá)及其作用機(jī)制。方法收集2009年8月～2015年4月東莞市石碣醫(yī)院和廣州市暨南大學(xué)附屬一院病理科結(jié)腸癌切除及結(jié)腸鏡活檢標(biāo)本共190例，其中正常結(jié)腸黏膜25例，結(jié)腸腺瘤伴輕、中、重度不典型增生各25例，結(jié)腸癌40例。采用SP法免疫組化方法檢測(cè)各組黏膜中APRIL和caspase-3蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 在正常結(jié)腸黏膜、結(jié)腸腺瘤伴輕度不典型增生、伴中度不典型增生、伴重度不典型增生和結(jié)腸癌中，APRIL的表達(dá)呈逐漸增高趨勢(shì)，caspase-3的表達(dá)呈遞減趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.49、12.79，P＜0.05）。APRIL的陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)腸癌患者的組織分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及浸潤(rùn)程度有關(guān)（P＜0.05），而caspase-3的陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)腸癌患者的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）。經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，40例結(jié)腸癌中APRIL和caspase-3表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)性（r=-0.512，P＜0.05）。結(jié)論APRIL的過表達(dá)和caspase-3的表達(dá)下降可能在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，兩者表達(dá)具有一定相關(guān)性。

結(jié)腸癌；結(jié)腸癌前病變；APRIL；caspase-3

［Abstract］Objective To observe the expressions of APRIL and caspase-3 in colon carcinoma and colon precancerous lesion，and to study the role of APRIL and caspase-3.Methods 190 cases of colon cancer resection and colonoscopy biopsy specimens in General Department of Dongguan Shijie Hospital and the First Hospital of Jinan University from August 2009 to April 2015 were collected，including 25 cases of normal colon mucosa，75 cases of colon precancerous lesion and 40 cases of colon carcinoma.The immune histochemical staining was used to detect the expressions of APRIL and caspase-3 in 25 cases of normal colon mucosa，75 cases of colon precancerous lesion and 40 cases of coloncarcinoma.Results The expression of APRIL increased from normal colon mucosa，colon adenoma with mild dysplasia，with moderate dysplasia，with severe dysplasia to colon gastric carcinoma（χ2=21.49，P＜0.05）and the expression of caspase-3 decreased from normal colon mucosa，colon adenoma with mild dysplasia，with moderate dysplasia，with severe dysplasia to colon carcinoma（χ2=12.79，P＜0.05）.The positive expression of APRIL were related to tissue differentiation，lymph node metastasis and the depth of invasion.The positive expression of caspase-3 were related to TNM stage and lymph node metastasis.The expression rate of APRIL was negatively correlated with the expression rate of caspase-3（r=-0.512，P＜0.05）.Conclusion The over-expression APRIL and the lose-expression caspase-3 may play the important role in the development of colon carcinoma and it's negative relationship between APRIL and caspase-3.

［Key words］Colon carcinoma；Colon precancerous lesions；APRIL；Caspase-3

近年調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的增殖和凋亡平衡紊亂在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了十分重要的作用［1-3］。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族參與了凋亡的調(diào)控過程，其中caspase-3是caspase家族中參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵蛋白酶［4-5］。增殖誘導(dǎo)配體（APRIL）是腫瘤壞死因子（TNF）超家族的新成員，對(duì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞轉(zhuǎn)移具有重要的作用，在結(jié)腸、食管、結(jié)腸等消化道惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)高表達(dá)［6-7］。本研究采用免疫組化SP法檢測(cè)結(jié)腸癌及癌前病變中APRIL和caspase-3蛋白的表達(dá)并探討其與臨床病理因素的關(guān)系，進(jìn)一步闡明它們?cè)诮Y(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及其分子機(jī)制。

1　材料與方法

1.1一般材料

收集2009年8月～2015年4月東莞市石碣醫(yī)院和廣州市暨南大學(xué)附屬一院病理科的手術(shù)切除或結(jié)腸鏡活檢切除標(biāo)本，其中正常結(jié)腸黏膜25例，結(jié)腸腺瘤伴輕、中、重度不典型增生組織各25例，結(jié)腸癌40例。所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)診斷證實(shí)。

1.2方法

采用免疫組化SP法檢測(cè)APRIL和caspase-3的表達(dá)。caspase-3山羊抗人多克隆抗體（工作濃度1∶50）均購(gòu)自美國(guó)cell signal公司，單克隆抗體APRIL購(gòu)自Abcam公司。SP試劑盒、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒的操作程序說明進(jìn)行操作步驟。染色結(jié)果判斷：caspase-3定位于腫瘤細(xì)胞胞漿和胞膜內(nèi)，APRIL表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞漿或者胞膜，呈黃色或棕黃色顆粒狀。以每張切片的表達(dá)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞率計(jì)分之和進(jìn)行判定結(jié)果。染色強(qiáng)度：無色記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分；陽(yáng)性細(xì)胞率：≤5%計(jì)0分；6%～25%記1分；26%～50%記2分；51%～100%記3分。將兩項(xiàng)評(píng)分相加，≤1分為（-），2分為（+），3～4分為（++），5～6分為（+++）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.00統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，率的比較用χ2檢驗(yàn)或精確概率法檢驗(yàn)，兩者相關(guān)性用非參數(shù)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1APRIL和caspase-3蛋白在各種結(jié)腸黏膜病變中的表達(dá)

在正常結(jié)腸黏膜、結(jié)腸腺瘤伴輕度不典型增生、伴中度不典型增生、伴重度不典型增生和結(jié)腸癌中，APRIL的表達(dá)呈逐漸增高趨勢(shì)，caspase-3的表達(dá)呈遞減趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.49、12.79，P＜0.05）。見表1、圖1～2。

表1　APRIL和caspase-3蛋白在各種結(jié)腸黏膜病變中的表達(dá)比較（例）

圖1　caspase-3蛋白在結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)（SP，200×）

圖2　APRIL蛋白在結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)（SP，200×）

2.2結(jié)腸癌中APRIL和caspase-3的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

APRIL的陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)腸癌患者的組織分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及浸潤(rùn)程度有關(guān)（P＜0.05），組織分級(jí)高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者、浸潤(rùn)漿膜層及以外者的APRIL表達(dá)明顯高于組織分級(jí)低、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者和浸潤(rùn)黏膜層或黏膜下層者（P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分期無關(guān)（P＞0.05）。

caspase-3的陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)腸癌患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），TNM分期Ⅰ～Ⅱ級(jí)、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的caspase-3表達(dá)明顯高于TNM分期Ⅲ～Ⅳ級(jí)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤大小、組織分化及浸潤(rùn)深度無關(guān)（P＞0.05）。見表2。

表2　結(jié)腸癌中APRIL和caspase-3的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］

2.3結(jié)腸癌中APRIL和caspase-3表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，40例結(jié)腸癌中APRIL 和caspase-3表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)性（r=-0.512，P＜0.05）。

3　討論

細(xì)胞增殖與凋亡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的一對(duì)矛盾，兩者間的動(dòng)態(tài)平衡狀況與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。結(jié)直腸黏膜上皮細(xì)胞增殖和凋亡在正常生理狀況下處于相對(duì)平衡而不斷更新的狀態(tài)，以保證其結(jié)構(gòu)和功能的完整性。一旦這種平衡被打破，組織結(jié)構(gòu)即受到破壞或腫瘤形成［8-9］。因此關(guān)于腫瘤細(xì)胞的凋亡及其調(diào)節(jié)機(jī)制的研究已經(jīng)成為目前人們關(guān)注的熱點(diǎn)之一［10-11］。

APRIL基因編碼定位于染色體17p13.1，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、調(diào)節(jié)體液免疫等功能［12-13］。APRIL在正常組織中基本不表達(dá)或者弱表達(dá)，但其在結(jié)直腸癌細(xì)胞系、淋巴瘤細(xì)胞系、黑色素瘤細(xì)胞系等中表達(dá)異常增高［14-15］。毛振彪等［16］檢測(cè)了APRIL在結(jié)腸黏膜癌變過程中表達(dá)情況，結(jié)果顯示異性增生結(jié)腸黏膜組織以及結(jié)腸癌組織中能檢測(cè)到APRIL的高表達(dá)，而正常結(jié)腸黏膜組織中APRIL表達(dá)下降，提示APRIL在結(jié)腸黏膜癌變過程中呈累積和漸進(jìn)的現(xiàn)象，但其具體作用機(jī)制仍在研究初期階段。本研究結(jié)果顯示，APRIL在正常結(jié)腸黏膜、結(jié)腸腺瘤伴輕度不典型增生、伴中度不典型增生、伴重度不典型增生和結(jié)腸癌中的表達(dá)呈逐漸增高趨勢(shì)（P＜0.05）。提示APRIL在結(jié)腸癌演變過程中占據(jù)重要位置，結(jié)腸癌前病變階段就已經(jīng)存在APRIL高表達(dá)的現(xiàn)象，而在結(jié)腸癌中其表達(dá)更是進(jìn)一步增高，推測(cè)APRIL異常表達(dá)可能是結(jié)腸癌發(fā)生的早期事件，有可能成為結(jié)腸癌早期診斷的新分子學(xué)指標(biāo)。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，APRIL的陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)腸癌患者的組織分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及浸潤(rùn)程度有關(guān)（P＜0.05），說明在結(jié)腸癌的進(jìn)展過程中，隨著組織分化變差、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移以及浸潤(rùn)漿膜層，APRIL蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，提示APRIL蛋白的異常表達(dá)能促進(jìn)癌細(xì)胞的惡性分化，并提高其浸潤(rùn)和侵襲能力，利于癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)以及侵潤(rùn)漿膜層及以外。因此，檢測(cè)APRIL的表達(dá)將有助于預(yù)測(cè)結(jié)腸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，對(duì)減緩結(jié)腸癌的病情進(jìn)展具有一定的臨床指導(dǎo)意義。

Caspase家族是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵分子，其中Caspase-3是該家族中最關(guān)鍵的凋亡效應(yīng)執(zhí)行分子，其表達(dá)缺失或下降可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖和凋亡平衡的紊亂，致使細(xì)胞異常增生甚至惡性轉(zhuǎn)化［17-18］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，caspase-3在正常結(jié)腸黏膜、結(jié)腸腺瘤伴輕度不典型增生、伴中度不典型增生、伴重度不典型增生和結(jié)腸癌中的表達(dá)呈遞減趨勢(shì)（P＜0.05）。提示caspase-3表達(dá)下降與結(jié)腸癌的發(fā)生密切相關(guān)，且可能出現(xiàn)于結(jié)腸腺上皮細(xì)胞的早期異常增殖，并具有促進(jìn)其惡性轉(zhuǎn)化的作用。同時(shí)本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)caspase-3的陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)腸癌患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）。提示caspase-3表達(dá)的缺失可能促進(jìn)了結(jié)腸癌的病情進(jìn)展，且與癌組織的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可成為預(yù)測(cè)結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的參考指標(biāo)。caspase-3表達(dá)下降或缺失，致使癌細(xì)胞逃避凋亡，增生能力增強(qiáng)，癌細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲。因此深入探討Caspase-3的凋亡調(diào)控機(jī)制，將可能為人們提供新的基因治療靶點(diǎn)［19-20］。

本研究對(duì)結(jié)腸癌組織中APRIL和caspase-3表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示40例結(jié)腸癌中APRIL 和caspase-3表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)性 （r=-0.512，P＜0.05）。說明兩者不僅均參與了結(jié)腸癌的發(fā)生進(jìn)展過程，且兩者發(fā)揮的作用具有一定相關(guān)性。推測(cè)APRIL能上調(diào)X相聯(lián)系的凋亡蛋白抑制因子 （XIAP）的表達(dá)，而XIAP是caspase家族的抑制物，能降低caspase-3活性，進(jìn)而通過抑制caspase-3表達(dá)和活性而發(fā)揮抗凋亡作用，但兩者之間相互作用的具體機(jī)制仍不明確。

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Expressions of APRIL and caspase-3 in the colon precancerous lesions and colon carcinoma and the role of APRIL and caspase-3

LI Yanhui1XIE Minru1YE Shiying2KANG Juling3XIA Minghan3
1.Department of General Pathology，Shijie Hospital，Guangdong Province，Dongguan523290，China；2.Department of General Science and Education，Shijie Hospital，Guangdong Province，Dongguan523290，China；3.Department of General Pathology，the First Hospital of Ji'nan University，Guangdong Province，Guangzhou510000，China

R735.3+5

A

1673-7210（2016）05（b）-0092-04

廣東省東莞市科技計(jì)劃醫(yī)療衛(wèi)生類科研一般項(xiàng)目（201210515011082）。

李延輝（1978.12-），女，碩士，副主任醫(yī)師；研究方向：消化道腫瘤病理診斷。

2016-01-21本文編輯：趙魯楓）