王　婷　范　益南京醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，江蘇南京　210029

何首烏二苯乙烯苷對2型糖尿病大鼠骨骼肌胰島素抵抗的影響

王婷范益
南京醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，江蘇南京210029

目的 考察何首烏二苯乙烯苷（TSG）對高脂飼料聯(lián)合鏈脲菌素（STZ）誘導的2型糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂及骨骼肌胰島素抵抗的改善作用。方法 雄性SD大鼠高脂飼料喂養(yǎng)6周后，腹腔注射STZ 30 mg/kg建立2型糖尿病模型。將造模動物分為4組：模型組（DM組）、羅格列酮組（RGLT組）、TSG高劑量（100 mg/kg）組（TSG-H組）、TSG低劑量（50 mg/kg）組（TSG-L組），連續(xù)灌胃給藥4周。另取10只作為正常對照組。改善作用的評價指標包括一般狀態(tài)、體重、血糖、糖耐量試驗、血清胰島素水平、胰島素敏感/抵抗指數(shù)、骨骼肌脂質含量、脂質過氧化物水平和抗氧化酶活力等。結果 給藥期間，TSG對大鼠一般狀態(tài)和體重無明顯影響。模型大鼠出現(xiàn)明顯的高血糖、糖耐量異常和胰島素抵抗，同時骨骼肌組織中脂質水平升高，出現(xiàn)氧化應激狀態(tài)。與DM組比較，TSG-H組、TSG-L組給藥4周血糖水平明顯降低（P＜0.05），模型大鼠的葡萄糖耐量明顯改善。與DM組比較，TSG-H組、TSG-L組大鼠的胰島素敏感指數(shù)顯著升高（P＜0.01），同時胰島素抵抗指數(shù)顯著降低（P＜0.01）。TSG可劑量依賴性地顯著降低骨骼肌中三酰甘油和游離脂肪酸水平（P＜0.05），對于骨骼肌組織中的氧化應激狀態(tài)也有明顯的改善作用，降低丙二醛水平（P＜0.01），顯著升高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活力水平（P＜0.01、P＜0.05）。結論TSG對于高脂飼料聯(lián)合STZ誘導的2型糖尿病大鼠骨骼肌脂質蓄積及氧化應激具有明顯的抑制作用，進而改善胰島素抵抗及糖脂代謝紊亂。

何首烏；二苯乙烯苷；糖尿??；胰島素抵抗；骨骼肌

［Abstract］Objective To investigate the improvement of tetrahydroxy stilbene glucoside（TSG）from Polygoni Multiflori Radix on glucose and lipid metabolism disorder and insulin resistance in skeletal muscle of type 2 diabetes rats induced by high fat diet and streptozotocin（STZ）.Methods Male SD rats were administrated intraperitoneally 30 mg/kg of STZ after 6 months of high fat diet fed.Model rats were divided in 4 groups，model group（DM group），Rosiglitazone （RGLT group），TSG high dose（100 mg/kg）group（TSG-H group），TSG low dose（50 mg/kg）group（TSG-L group）.Therapeutic drugs were administrated intragastrically for 4 consecutive weeks.Another 10 rats were selected as normal control group.The improvement of TSG were evaluated by a range of indicators consisted of general state，body weight，blood glucose，glucose tolerance，serum insulin，insulin sensitivity/resistance index，the levels of lipids，lipid peroxide and antioxidant enzyme activities in skeletal muscle.Results During the period of drug delivery，TSG had no obvious effect on general state and body weight.There were significantly changes in model rats，such as hyperglycemia，impaired glucose tolerance，insulin resistance，lipid deposition and oxidative stress in skeletal muscle.Compared with DM group，TSG-H group and TSG-L group could significantly reduce blood glucose（P＜0.05）and ameliorate glucose tolerance.Compared with DM group，the insulin sensitivity index of TSG-H group and TSG-L group was increased（P＜0.01），while the insulin resistance was decreased significantly（P＜0.01）.TSG could dose-dependently reduce the levels of triglyceride and free fatty acids in skeletal muscle（P＜0.05），as well as inhibit oxidative stress involving of decrease of MDA（P＜0.01），raise the activities of superoxide dismutase and catalase（P＜0.01，P＜0.05）.Conclusion TSG can alleviate lipids accumulation and oxidative stress in skeletal muscle of type 2 diabetes rats induced by high fat diet and STZ，and then improve insulin resistance and glucose and lipid metabolism disorder.

［Key words］Polygoni Multiflori Radix；Tetrahydroxy stilbene glucoside；Diabetes mellitus；Insulin resistance；Skeletal muscle

近年來，肥胖、高血脂、高血糖等代謝性疾病發(fā)病率迅速增高，而胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是這些代謝性疾病的共同病理機制之一［1-2］。骨骼肌是一個關鍵的代謝組織，骨骼肌IR的發(fā)生是全身IR及肥胖2型糖尿病（T2DM）等發(fā)病的重要因素［3］。研究顯示，多種因素引起的骨骼肌線粒體功能障礙，一方面可以導致骨骼肌組織的脂肪沉積，另一方面可以誘發(fā)活性氧增多和氧化應激，可能是誘導IR的重要因素［4］。何首烏是常用補益中藥，其水溶性成分二苯乙烯苷（TSG）是主要活性成分，有明確的抗氧化和降血脂作用，在抗衰老和調節(jié)脂質代謝方面具有很好的應用前景［5-6］。本研究采用高脂飲食聯(lián)合鏈脲霉素建立大鼠2型糖尿病模型，考察TSG對該模型糖脂代謝紊亂及骨骼肌胰島素抵抗的改善作用，為本品在糖尿病防治方面的應用提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1受試藥物

何首烏TSG，純度＞98%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司。

1.2陽性對照藥物

羅格列酮原料藥，純度99.67%，北京高博醫(yī)藥化學技術開發(fā)有限公司。

1.3動物及飼養(yǎng)［7］

清潔級SD大鼠，雄性，6～8周齡，浙江省實驗動物中心（動物合格證編號：0018533）。鼠全價顆粒飼料及輻照滅菌高脂飼料（高脂飼料配方：20%豬油+2%膽固醇+0.5%膽酸鈉+5%蛋黃粉+基礎飼料72.5%），南京江寧青龍山動物養(yǎng)殖廠。

1.4主要儀器

BS210S電子天平（德國賽多利斯公司）；TDL80-2B臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；Bio-rad680酶標儀（美國BIO-RAD公司）；MILI-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；HH-4水浴鍋（國華電器有限公司）；IK15離心機（美國SIGMA公司）。

1.5主要試劑

鏈脲霉素（STZ），上海生工生物工程有限公司；葡萄糖（GLU）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、游離脂肪酸（FFA）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒，南京建成生物工程有限公司；胰島素檢測試劑盒［酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法］，上海依科賽生物制品有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物技術研究所。

1.6試驗方法

1.6.1模型建立方法［8］高脂飼料喂養(yǎng)6周后，60只大鼠禁食過夜，腹腔注射STZ（30 mg/kg）建立2型糖尿病模型。STZ注射72 h后，測定模型大鼠的空腹血糖，以隨機血糖≥12 mmol/L為標準，選擇造模成功大鼠，根據(jù)血糖水平隨機分組，分別給予相應藥物治療。另取10只作為正常對照組（Control組）始終喂以普通飼料。

1.6.2分組及給藥方案本研究將試驗動物分為5組，每組10只，分別為：Control組；模型組（DM組）；羅格列酮（RGLT）組：5 mg/kg；TSG高劑量組（TSG-H組）：100 mg/kg；TSG低劑量組（TSG-L組）：50 mg/kg。RGLT組、TSG-H組、TSG-L組為治療組，分別灌胃給藥4周，每天1次，Control組和DM組均給予同體積的蒸餾水。

1.6.3檢測指標［9-10］每天給藥前觀察動物一般狀況。試驗期間每周測定1次體重，并根據(jù)體重調整給藥量。分別于給藥前及給藥2、4周，動物禁食過夜，眼底靜脈叢采血，分離血清，采用試劑盒測定血糖水平。給藥第4周動物禁食12 h后，進行腹腔注射葡萄糖（2.5 g/kg）耐量試驗，采用葡萄糖試劑盒測定各組動物注射葡萄糖前及注射后0.5、1、2 h血糖值。于給藥第4周，取血清采用ELISA試劑盒測定血清胰島素（Ins）水平，并按下列公式分別計算胰島素敏感指數(shù)（ISI）和胰島素抵抗指數(shù) （IR）：ISI=1/（空腹血糖值×空腹胰島素值）；IR=空腹血糖值×空腹胰島素值/22.5。4周給藥完畢，解剖取部分新鮮骨骼肌組織，-80℃冰箱保存，用于后續(xù)分子生物學試驗。另取常規(guī)制備組織勻漿，按試劑盒說明書分別測定骨骼肌組織中TC、TG、FFA、MDA、CAT和SOD水平。

1.7統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，重復測量的計量資料采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1對一般狀態(tài)及體重的影響

在6周高脂飼料造模期間，各組大鼠毛色、排便、排尿、自發(fā)活動等一般狀況未見明顯變化。STZ造模大鼠出現(xiàn)不同程度的多飲、多尿和體重下降，各給藥組對模型動物的一般狀態(tài)和體重未見明顯影響。試驗期間各組均無動物死亡。

2.2對血糖水平的影響

與Control組比較，DM組4周給藥期間血糖水平顯著升高（P＜0.01）。與DM組比較，TSG-H組、TSG-L組給藥4周血糖水平明顯降低（P＜0.05），RGLT組給藥2周和4周血糖水平均明顯降低 （P＜0.05、P＜0.01）。見表1。

表1　TSG對高脂飼料+STZ模型大鼠血糖水平的影響（mmol/L，±s，n=10）

表1　TSG對高脂飼料+STZ模型大鼠血糖水平的影響（mmol/L，±s，n=10）

注：與Control組同時間點比較，**P＜0.01；與DM組同時間點比較，#P＜0.05，##P＜0.01；“-”表示無數(shù)據(jù)；TSG：二苯乙烯苷；STZ：鏈脲霉素；DM：模型；RGLT：羅格列酮；TSG-H：TSG高劑量；TSG-L：TSG低劑量

組別　劑量（mg/kg）　造模后　給藥2周　給藥4周Control組DM組RGLT組TSG-H組TSG-L組--1 0 100 50 5.2±0.6 15.9±2.3**15.8±2.8 15.6±2.4 15.6±2.3 5.2±0.2 16.8±2.5**13.9±2.1#14.4±2.7 14.9±2.8 5.1±0.4 16.2±3.1**11.4±2.0##12.9±2.6#13.6±1.9#

2.3對葡萄糖耐量的影響

與Control組比較，DM組大鼠腹腔注射葡萄糖后2 h內血糖水平顯著升高（P＜0.01）。與DM組比較，TSG-H組、TSG-L組大鼠腹腔注射葡萄糖后2 h內血糖水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），提示治療組大鼠葡萄糖的攝取利用能力有所改善。見圖1。

圖1　TSG對高脂飼料+STZ模型大鼠葡萄糖耐量的影響（±s，n=10）

2.4對胰島素敏感性和抵抗的影響

與Control組比較，DM組ISI顯著降低，IR顯著升高（P＜0.01），表明模型動物出現(xiàn)明顯的胰島素抵抗狀態(tài)。與DM組比較，TSG-H、TSG-L組均可以顯著升高ISI（P＜0.01），同時顯著降低IR（P＜0.01）。見表2。

表2　TSG對高脂飼料+STZ模型大鼠ISI和IR的影響（±s，n=10）

表2　TSG對高脂飼料+STZ模型大鼠ISI和IR的影響（±s，n=10）

注：與Control組比較，**P＜0.01；與DM組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；“-”表示無數(shù)據(jù)；TSG：二苯乙烯苷；STZ：鏈脲霉素；DM：模型；RGLT：羅格列酮；TSG-H：TSG高劑量；TSG-L：TSG低劑量；Ins：胰島素；ISI：胰島素敏感指數(shù)；IR：胰島素抵抗指數(shù)

組別　劑量（mg/kg）　Ins（ng/mL）　ISI　IR Control組DM組RGLT組TSG-H組TSG-L組--1 0 100 50 1.59±0.50 3.58±0.62**2.34±0.37##2.65±0.49##2.83±0.56#0.136±0.048 0.018±0.005**0.039±0.009##0.032±0.009##0.028±0.007##0.36±0.11 2.57±0.55**1.18±0.23##1.52±0.45##1.72±0.47##

2.5對骨骼肌組織中脂質水平的影響

10周試驗完畢，骨骼肌脂質水平檢測結果顯示，與Control組比較，DM組大鼠骨骼肌中TC水平部分升高（P＞0.05），而TG和FFA水平均顯著升高（P＜0.01），表明模型大鼠骨骼肌組織中出現(xiàn)明顯的脂質蓄積。與DM組比較，TSG-H組骨骼肌中TG和FFA水平均明顯降低（P＜0.05），TSG-L組FFA水平也明顯降低（P＜0.05）。與DM組比較，各受試藥物組TC水平有部分降低，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2　TSG對高脂飼料+STZ模型大鼠骨骼肌中TC、TG 和FFA水平的影響（±s，n=10）

2.6對骨骼肌組織中氧化應激的影響

與 Control組比較，DM組大鼠骨骼肌組織中MDA水平顯著升高（P＜0.01），而SOD和CAT水平顯著下降（P＜0.01），表明模型大鼠骨骼肌組織中出現(xiàn)明顯的氧化應激性改變，且抗氧化能力下降。與DM組比較，TSG-H組骨骼肌組織中MDA水平顯著降低（P＜0.01），而SOD和CAT水平明顯升高（P＜0.01、P＜0.05），TSG-L組對MDA和SOD水平也有明顯的改善作用（P＜0.05）。RGLT組骨骼肌組織中MDA、SOD和CAT水平均未見明顯改變。見圖3。

3　討論

胰島素抵抗是2型糖尿病的重要特征和病理機制。骨骼肌組織是胰島素調節(jié)外周組織葡萄糖攝取的主要部位，骨骼肌的胰島素抵抗在2型糖尿病的發(fā)病中起到始動和主要作用［11-12］。近年來，隨著對糖尿病及其并發(fā)癥研究的不斷深入，骨骼肌脂質沉積以及氧化應激在IR發(fā)生機制中的作用逐漸引起人們的重視［13-14］。

本研究中模型大鼠骨骼肌組織中可見TG和FFA水平顯著升高，這與臨床2型糖尿病患者的組織病變特征相似［15-16］。此外，模型大鼠血糖顯著升高，胰島素敏感指數(shù)顯著降低，提示該模型存在明顯的骨骼肌胰島素抵抗。TSG對于2型糖尿病大鼠模型骨骼肌組織的脂質蓄積也有明顯的抑制作用，可能與本品降低血糖、改善IR有關。

圖3　TSG對高脂飼料+STZ模型大鼠骨骼肌中MDA、SOD 和CAT水平的影響（±s，n=10）

對于高脂飼料聯(lián)合STZ大鼠模型，本研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌組織在脂質蓄積的同時，還伴有MDA增多，抗氧化酶（SOD、CAT）活力下降，表現(xiàn)為明顯的氧化應激狀態(tài)，這也可能是誘發(fā)模型出現(xiàn)IR的因素之一。已有多項體外、體內試驗提示，TSG可以清除多種自由基，顯著改善超氧自由基氧化損傷［17-18］。本研究結果顯示，TSG對于糖脂代謝紊亂所致的大鼠骨骼肌氧化應激狀態(tài)具有明顯的改善作用，提示其抗氧化作用也是改善IR以及糖脂代謝紊亂的機制之一。

綜上所述，本研究提示了TSG在調節(jié)糖脂代謝紊亂、改善胰島素抵抗方面的作用，初步闡明了其減輕骨骼肌脂質沉積以及抑制氧化應激相關的作用機制。線粒體作為細胞內脂肪酸β氧化的部位，同時也是ROS的主要來源，研究提示線粒體功能障礙也是糖尿病骨骼肌IR的重要特征［19-20］，因此TSG改善IR機制的進一步研究可以圍繞線粒體損傷相關機制開展，尤其是與脂肪酸代謝和氧化磷酸化相關的分子機制的探討，為臨床上糖尿病的治療提供新的思路。

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Effect of tetrahydroxy stilbene glucoside from Polygoni Multiflori Radix for insulin resistance in skeletal muscle of type 2 diabetes rats

WANG TingFAN Yi
School of Basic Medicine，Nanjing Medical University，Jiangsu Province，Nanjing210029，China

R587

A

1673-7210（2016）05（b）-0025-05

王婷（1984.10-），女，南京醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院2012級藥理學專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：醫(yī)院藥學。

范益（1976.5-），男，博士研究生，碩士研究生導師，主要從事藥理學研究。

2016-01-17本文編輯：張瑜杰）