趙金香，張瑞十，趙義龍2，杜國豐，馬志研，矯繼峰*（.營口理工學(xué)院，遼寧　營口　504；2.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，新疆　昌吉　8300）

新疆驢盲腸細(xì)菌多樣性分析

趙金香1，張瑞十1，趙義龍2，杜國豐1，馬志研1，矯繼峰1*
（1.營口理工學(xué)院，遼寧營口115014；2.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，新疆昌吉831100）

為探索新疆驢耐粗飼的根本原因，本試驗(yàn)選取新疆驢6頭，以16s rRNA文庫法，對(duì)新疆驢盲腸細(xì)菌進(jìn)行了系統(tǒng)的分類和鑒定。研究結(jié)果表明，新疆驢盲腸細(xì)菌資源豐富，共獲得Verrucomicrobiae，Spirochaetales，Gammaproteobacteria，Deltaproteobacteria，Bacteroidetes，Bacilli，Negativicutes，Erysipelotrichia以及Clostridia共9個(gè)綱的細(xì)菌。其中厚壁菌門的Clostridia為新疆驢盲腸優(yōu)勢(shì)細(xì)菌（約占盲腸細(xì)菌總量的83%）。對(duì)梭狀芽胞桿菌綱進(jìn)一步分類發(fā)現(xiàn)，其所有克隆全部歸屬于梭菌目 （Clostridiales），其中，Ruminococcaceae與Lachnospiraceae分別為梭菌目的兩大優(yōu)勢(shì)菌科。上述結(jié)果說明，厚壁菌門的Ruminococcaceae與Lachnospiraceae的細(xì)菌是新疆驢盲腸內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群，在新疆驢耐粗飼方面可能起重要作用。

新疆驢；盲腸；細(xì)菌；多樣性

10.16863/j.cnki.1003-6377.2016.04.004

新疆驢是新疆原始的小型地方優(yōu)良驢品種之一，2008年被列為國家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)品種，在我國家畜品種遺傳資源中占有重要的地位[1]。其耐粗飼，適應(yīng)干旱能力強(qiáng)。盡管新疆驢可役用于交通及生產(chǎn)，而且還可用于經(jīng)濟(jì)用途，如肉、乳、藥等，但目前新疆驢的養(yǎng)殖規(guī)模卻逐漸縮小[2]。

動(dòng)物及人類的腸道微生物不僅受遺傳因素影響，而且還是一個(gè)非常復(fù)雜的多種微生物共存的環(huán)境。越來越多的研究表明，腸道微生物與動(dòng)物及人類的健康密切相關(guān)[3-9]。據(jù)報(bào)道，新疆驢對(duì)秸稈飼料的干物質(zhì)采食量顯著高于青貯飼料[10]。因此，新疆驢腸道微生物種類及組成與其耐粗飼的特性一定存在著必然的聯(lián)系。

為探索新疆驢耐粗飼的根本原因，本研究采用免培養(yǎng)法對(duì)腸道細(xì)菌進(jìn)行全面系統(tǒng)的鑒定，以期找到細(xì)菌與其耐粗飼之間的相關(guān)關(guān)系，為新疆驢綜合生產(chǎn)性能的開發(fā)打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物的選擇及樣品采集

選擇3～4歲、體重（130±15）kg的6頭（雌雄各半）健康新疆驢為試驗(yàn)對(duì)象。以麥秸、玉米秸稈、稻草等量混合作為粗料，并輔以一定量的精料，飼養(yǎng)60 d后，以體外腹腔穿刺法收集盲腸液于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2腸道微生物基因組提取

采用糞便基因組提取試劑盒（購自O(shè)mega公司）對(duì)腸道微生物基因組DNA進(jìn)行提取，嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。并應(yīng)用Nanodrop1000核酸定量?jī)x（購自Thermo公司）進(jìn)行總DNA濃度測(cè)定，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3細(xì)菌16S rDNA特異性片段擴(kuò)增

PCR反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀（購自杭州博日科技）中進(jìn)行。反應(yīng)引物序列為8F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。DNA聚合酶為Phusion High-Fidelity DNA Polymerase（New England Biolabs，美國），反應(yīng)設(shè)置為35個(gè)循環(huán)。首先98℃預(yù)變性1 min，然后98℃10 s，56℃30 s，和72℃60 s，72℃8min。

PCR結(jié)束后對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段大小，然后應(yīng)用膠回收試劑盒（購自Axygen）對(duì)膠進(jìn)行回收，以及進(jìn)行DNA鏈3'端腺嘌呤A的連接反應(yīng)，連接酶是TaqDNA Polymerase（購自天跟生化科技），反應(yīng)條件為72℃30 min。反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)采用1%瓊脂糖凝膠與膠回收實(shí)驗(yàn)純化得到3'端具有polyA結(jié)構(gòu)的細(xì)菌16S rDNA。

1.4克隆文庫的構(gòu)建及檢測(cè)

將上述純化后的PCR產(chǎn)物通過T4DNA連接酶與pMD18-T vector連接后，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。通過藍(lán)白斑篩選，將白色克隆菌斑接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)平板中于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

文庫的克隆，以M13-F:5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'，M13-R:5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'為引物，通過菌體PCR鑒定插入子的正確性。插入正確的菌體，其PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RLFP）分析。分析圖譜中差異條帶于華大基因進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序所得序列通過BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對(duì)分析。應(yīng)用MEGA軟件對(duì)細(xì)菌序列進(jìn)行多重序列比對(duì)；應(yīng)用mothur軟件以97.0%相似性為標(biāo)準(zhǔn)劃分不同的操作分類單元（Operational Taxonomic Unit，OTU）[11]；應(yīng)用AnalyticRarefaction軟件繪制克隆文庫的稀釋曲線(Rarefactioncurve)，以檢驗(yàn)文庫的代表性；應(yīng)用軟件SPADE(Species Prediction And Diversity Estimation)進(jìn)行細(xì)菌多樣性指數(shù)分析；應(yīng)用Classifier軟件進(jìn)行分類分析。

2　結(jié)果與分析

2.1新疆驢腸道基因組DNA的提取及16SrDNA的擴(kuò)增

為了能夠高效提取新疆驢腸道中的微生物基因組，由于腸道內(nèi)容物與糞便結(jié)構(gòu)相似，我們選擇了糞便基因組提取試劑盒。提取的基因組DNA電泳條帶清晰。以此DNA為模板，經(jīng)細(xì)菌16S rDNA特異性引物擴(kuò)增后，在1 500 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果一致，表明成功擴(kuò)增并得到了腸道中細(xì)菌特異性片段。

2.2克隆文庫的構(gòu)建及檢測(cè)

將所得細(xì)菌16S rDNA特異性片段與T載體連接后，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，隨著細(xì)胞的繁殖而迅速擴(kuò)增。通過藍(lán)白斑篩選共得到219個(gè)陽性克隆的菌株。這些陽性克隆通過HaeIII進(jìn)行酶切RLFP分析后，排除重復(fù)酶切圖譜，將197個(gè)陽性克隆菌進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)分析，得到145個(gè)細(xì)菌克隆，分屬23個(gè)OTU（可操作單元）。

為了評(píng)估文庫構(gòu)建的可行性，我們?cè)u(píng)估了文庫的覆蓋率C（Estimated sample coverage）以及文庫的稀有度（圖1）。由于C值為0.915，表明本次樣本覆蓋了新疆驢盲腸全部細(xì)菌的91.5%；而且稀有度曲線隨著克隆數(shù)的增加具有趨向平緩的趨勢(shì)，表明本次所取樣品中，所得的細(xì)菌數(shù)量基本能夠代表驢腸道中細(xì)的真實(shí)情況。

圖1　新疆驢盲腸細(xì)菌稀有度曲線Figure 1 Rarefaction curve for Xinjiang donkey cecum bacteria OTUs of 16S rDNA gene clones

2.3細(xì)菌多樣性分析

為了探索新疆驢盲腸內(nèi)細(xì)菌的復(fù)雜程度，根據(jù)所獲得的細(xì)菌樣品，進(jìn)行了細(xì)菌多樣性指數(shù)分析（表1）。根據(jù)ACE（Abundance-based Coverage Estimator）模型預(yù)測(cè)，在95%置信區(qū)間（28.0,82.1）內(nèi)，本研究的物種豐度為40.2±12，實(shí)際研究中檢測(cè)到了24個(gè)OTUs，比預(yù)測(cè)結(jié)果偏低。根據(jù)Chao&Shen模型與MLE （maximum likelihood estimator），在95%置信區(qū)間 （1.979,2.702）(0.08633,0.29514)內(nèi)，香農(nóng)指數(shù)（Shanno Index）與辛普森指數(shù)（Simpson Index）分別為2.340±0.184與0.19074±0.05327。通常，物種多樣性越豐富，這兩個(gè)指數(shù)越大；標(biāo)準(zhǔn)誤越小，表明所得細(xì)菌樣本越能代表驢盲腸細(xì)菌總體。本研究表明，通過盲腸取樣檢測(cè)所得新疆驢盲腸細(xì)菌多樣性，基本能夠代表其盲腸總體細(xì)菌多樣性。

表1　新疆驢盲腸細(xì)菌多樣性指數(shù)分析

2.3細(xì)菌分類分析

為了探索新疆驢盲腸細(xì)菌的特性，我們對(duì)所得細(xì)菌進(jìn)行了分類分析。本研究共得到145個(gè)細(xì)菌克隆，分別分屬于疣微菌門、螺旋體門、變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門以及未界定的細(xì)菌門（表2）。其中，（圖2）厚壁菌門（Firmicutes）梭狀芽胞桿菌綱（Clostridia，82.76%）是新疆驢盲腸細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，其次是擬桿菌門（Bacteroidetes）擬桿菌綱（Bacteroidetes，5.52%）與變形菌門（Proteobacteria）δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria，4.14%）。本研究表明新疆驢盲腸細(xì)菌主要為厚壁菌門梭狀芽胞桿菌綱。

為了進(jìn)一步探索新疆驢盲腸中細(xì)菌的功能，我們對(duì)梭狀芽胞桿菌綱作了進(jìn)一步的分類（表3）。其所有克隆全部歸屬于梭菌目 （Clostridiales）。他們分別是梭菌目的真桿菌科 （Eubacteriaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）以及21個(gè)未定科的克隆。其中，瘤胃球菌科與毛螺菌科為兩個(gè)優(yōu)勢(shì)菌科（圖2）。

表2　　新疆驢盲腸細(xì)菌分類及統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表3　　新疆驢盲腸梭狀芽胞桿菌綱梭菌目的分類及統(tǒng)計(jì)結(jié)果

圖2　　新疆驢盲腸細(xì)菌結(jié)構(gòu)組成Figure2 Community structure of the cecum bacteria in Xinjiang donkey

3討論

新疆驢是一個(gè)耐粗飼的地方優(yōu)良品種，主要分布在喀什、和田、克孜勒蘇柯爾克孜自治州、巴音郭愣蒙古自治州、吐魯番、哈密等地[12]。新疆屬大陸性氣候，受高山和沙漠的影響，氣候溫暖而干旱，風(fēng)沙多，降水量少。由于生存環(huán)境惡劣，新疆驢形成了獨(dú)特的特性以適應(yīng)干旱的環(huán)境，如體格矮小、體質(zhì)結(jié)實(shí)，具有發(fā)達(dá)的盲腸，腸道內(nèi)部含有大量的微生物，是其對(duì)粗飼料進(jìn)行消化分解的主要場(chǎng)所[13]，類似于反芻動(dòng)物的瘤胃。動(dòng)物對(duì)粗飼料消化的研究，大量的報(bào)道集中于反芻動(dòng)物的瘤胃，而驢盲腸的研究報(bào)道很少。本研究通過對(duì)新疆驢盲腸微生物組成及分類的研究表明，厚壁菌門（Firmicutes）是新疆驢盲腸主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，其次是擬桿菌門（Bacteroidetes）與變形菌門（Proteobacteria）。

厚壁菌門是一大類細(xì)菌，多數(shù)為革蘭氏陽性，很多厚壁菌可以產(chǎn)生芽孢，用以抵抗脫水和極端環(huán)境。動(dòng)物腸道中的厚壁菌屬于化能營養(yǎng)型細(xì)菌，能幫助動(dòng)物從食物中獲取更多的能量[14]?；谶@一現(xiàn)實(shí)，新疆驢盲腸中之所以以厚壁菌門為主要優(yōu)勢(shì)菌，可能與其能夠從粗飼料（如秸稈飼料）中獲取更多的營養(yǎng)物質(zhì)相關(guān)。新疆氣候炎熱、干燥，新疆驢在長(zhǎng)期自然選擇過程中逐漸形成了以厚壁菌門為主的腸道優(yōu)勢(shì)菌群，以至于其充分利用這類能夠抵抗極端環(huán)境的細(xì)菌幫助消化粗纖維含量豐富的秸稈飼料，獲取更多的營養(yǎng)物質(zhì)。本研究中，厚壁菌門約占盲腸細(xì)菌總量的83%。這一結(jié)果表明，以纖維素為主要食物的新疆驢腸道中飼料提供的營養(yǎng)在轉(zhuǎn)變?yōu)閯?dòng)物可吸收營養(yǎng)的過程中，厚壁菌門細(xì)菌起著至關(guān)重要的作用。

為了進(jìn)一步確定厚壁菌門細(xì)菌在新疆驢消化粗纖維類飼料過程中的作用，本研究對(duì)該門細(xì)菌作了進(jìn)一步的分類和鑒定。經(jīng)鑒定，新疆驢盲腸中厚壁菌門細(xì)菌主要?dú)w屬于梭狀芽胞桿菌綱（Clostridia）梭菌目（Clostridiales）瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）。盡管如此，在瘤胃球菌科中，接近80%的盲腸細(xì)菌均為未定屬。另外，在毛螺菌科（Lachnospiraceae）中，也有超過90%的細(xì)菌未定屬；在梭菌目中有18%的細(xì)菌未定科。這些研究結(jié)果表明，新疆驢盲腸具有非常復(fù)雜的微生物組成，而且還有大量的細(xì)菌需要作進(jìn)一步探索和研究。這些未知功能的細(xì)菌在新疆驢對(duì)粗纖維飼料消化及吸收過程中所起的作用，尚需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究通過16S rDNA文庫法，對(duì)新疆驢盲腸細(xì)菌進(jìn)行了分類及鑒定。研究結(jié)果表明，厚壁菌門為新疆驢盲腸細(xì)菌的主要優(yōu)勢(shì)菌群。另外，本試驗(yàn)所采用的16S rDNA免培養(yǎng)法有助于對(duì)動(dòng)物腸道新細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)。

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Analysis on Cecum Bacteria Diversity in Xinjaing Donkey

ZHAO Jin-xiang1，ZHANG Rui-shi1，ZHAO Yi-long2，DU Guo-feng1，MA Zhi-yan1，JIAO Ji-feng1*
（1.Yingkou Polytechnic Institute,Yingkou Liaoning 115014，China；2.Xinjiang Production&Construction Corps Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science of Technology,Aler XinJiang 831100，China）

To explore the causes of resisting roughage feed in Xinjiang donkey,six Xinjiang donkeys are selected,and their cecum bacteria aresystematically classifies and identifies by 16s rRNA gene library.It is found that thebacteria in Xinjiang donkey is much rich and the retrieved clones belong to 9 classes in 5 phylum,namelyVerrucomicrobiae，Spirochaetales，Gammaproteobacteria，Deltaproteobacteria，Bacteroidetes，Bacilli，Negativicutes，Erysipelotrichia and Clostridia.And Clostridia(accounts for 83%in total cecum bacteria amount)is predominant bacteria in cecum of donkeys.Further study shows that the Clostridia bacteria belonged to Clostridiales,Ruminococcaceae and Lachnospiraceae are two dominant bacterias in Clostridiales. The said results indicates that Ruminococcaceae and Lachnospiraceae aree the two big dominant bacterias in the cecum and could play a key role in resisting roughage feed in Xinjiang donkey.

Xinjiang donkey;cecum;bacteria;diversity

S822

A

1003-6377（2016）04-0020-06

趙金香(1979-)，女，碩士，副教授。主要研究方向：動(dòng)物營養(yǎng)與生物化學(xué)。E-mail：zjxdky@126.com

矯繼峰(1977-)，男，博士，副教授。主要研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：jiaojf08@sohu.com

2016-05-15

2016-05-24