沈　潔,周光明,于　璐

(發(fā)光與實時分析教育部重點實驗室 西南大學化學化工學院,重慶 400715)

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沈潔,周光明*,于璐

(發(fā)光與實時分析教育部重點實驗室 西南大學化學化工學院,重慶 400715)

建立離子色譜-脈沖安培檢測法檢測桃膠中的糖類(鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖)含量的方法,采用METROSEP CARB 1(150 mm×4.0 mm)分離柱,以10 mmol/L NaOH溶液在1.0 mL/min下洗脫樣品溶液,總分析時間為22 min。鼠李糖、甘露糖線性范圍為5.0～100.0 μg/mL,阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖線性范圍為2.0～60.0 μg/mL,鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖檢出限分別為(進樣量20 μL,S/N=3)0.34、0.18、0.17、0.08、0.39 μg/mL,樣品加標回收率為92.0%～98.3%,使用樣品溶液連續(xù)進樣6次,測得5種糖RSD為2.25%～4.23%。此方法無需衍生、操作方便、方法快捷、檢測靈敏度高,適用于桃膠類糖含量的檢測。

離子色譜,脈沖安培檢測器,桃膠,多糖

桃膠(又名桃樹膠)系薔薇科植物,如桃樹、李樹、杏樹等樹木樹干受到機械損傷(如蟲咬、切傷等)或致病后分泌出來的膠質(zhì)半透明物質(zhì),經(jīng)研究表明其主要成分是多糖及其衍生物、少量蛋白質(zhì)以及雜質(zhì)等。其中多糖的主要成分為半乳糖、阿拉伯糖,另外還有少量的鼠李糖、甘露糖及葡萄糖[1]?！侗静菥V目》中有記載桃膠味苦、性平、益氣、和血、止渴,具有治療消渴的作用。近年來的研究表明,桃膠還具有清除結(jié)石,保護人體造血功能,改善免疫功能及強身健體等功效,將其運用到血淋、石淋、痢疾、腹瀉等治療中,均有良好的效果[2-4]。

目前有關(guān)于桃膠的研究多在于其理化性質(zhì),收集、加工及提取工藝上,提取工藝重在研究桃膠的主要成分:多糖,而在研究提取桃膠多糖的文章中,比較常見的檢測方法是氣相色譜、液相色譜技術(shù),毛細管電泳法[5-8]。但是由于糖類多為中性、極性和親水性化合物,進行HPLC分離或GC分離之前必須先進行衍生,生成疏水性或揮發(fā)性的化合物,而后再使用光度法或示差折光進行檢測。在衍生過程中,對于基體組成復雜的樣品,往往會由于受到各種因素的影響造成衍生反應進行不徹底或生成多種衍生物,造成檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差。此外,折光和低波長紫外檢測器對淋洗液和樣品基體非常敏感,這也限制了梯度洗脫方法的使用。本文采用離子色譜脈沖安培檢測器,利用糖類在強堿條件下呈離子狀態(tài),可以在陰離子色譜柱上被分離出來的特性進行檢測,從而實現(xiàn)對多糖含量的測定。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

樣品桃膠A、B、C分別從網(wǎng)上購自于云南麗江、浙江金華、福建寧德;實驗用水 ≥ 18.2 MΩ·cm的去離子水;葡萄糖、D(-)-阿拉伯糖、三氯乙酸成都科龍化工試劑廠;鼠李糖、D-半乳糖、D-甘露糖、陰離子交換樹脂上海晶純生化科技股份有限公司;無水乙醇、氫氧化鈉、正丁醇、三氯甲烷、氯化鈉川東化工集團有限公司,以上試劑均為分析純;0.45 μm微孔過濾膜天津市騰達過濾器件廠。

861 Advanced Compact IC離子色譜儀瑞士萬通公司(Metrohm),817 Bioscan脈沖安培檢測器,METROSEP CARB 1分離柱(150 mm×4.0 mm),Metrohm IC-Net 2.3色譜工作站。恒溫油浴鍋鞏義市予華儀器有限責任公司;超聲波清洗儀上海必能信超聲波有限公司;80-1臺式低速離心機金壇市科技儀器有限公司;隔膜真空泵天津市騰達過濾器件廠;島津UV-2450紫外分光光度計江蘇省科學器材有限公司;恒溫干燥箱上海東星建材有限公司。

1.2色譜檢測條件

分離柱:METROSEP CARB 1(150 mm×4.0 mm)陰離子交換柱,淋洗液:10.0 mmol/L NaOH溶液,流速:1.0 mL/min,進樣量:20 μL,柱溫:32 ℃,再生液:200.0 mmol/L NaOH,安培檢測器采用四電位脈沖安培法檢測,峰面積定量。

1.3桃膠多糖的分離純化

1.3.1桃膠的預處理將桃膠樣品進行干燥、碾磨成細小顆粒后,準確稱量1.0000 g的樣品,加入一定量的去離子水90 ℃水浴加熱、溶解,待充分溶解180 min后,使用60目過濾網(wǎng)過濾收集濾液[9-10]。將濾液加入三氯乙酸溶液至pH=3,靜置10 h進行脫蛋白處理后,于4000 r/min的離心機下離心10 min,收集離心后的上清液,調(diào)節(jié)pH至中性[11-12]。加入4倍的乙醇進行醇沉處理,靜置24 h后于4000 r/min的離心機下離心20 min,將得到的沉淀收集干燥后,溶解,將乙醇溶液濃縮、干燥后用去離子水溶解,合并兩溶液。用陰離子樹脂脫色處理60 min,過濾定容至100 mL后使用0.45 μm微孔濾膜過濾待測。

1.3.2桃膠水解時間選擇桃膠B樣品分別水解30、60、120、180、240 min后,按照上述方法檢測多糖含量,做峰面積柱狀圖。

1.3.3脫蛋白法使用三氯甲烷與丁醇4∶1的混合溶劑將樣品溶液置于250 mL的分液漏斗中混合搖勻、靜置5 min后,分離去變性蛋白,重復此項至溶劑與水層間不再有變性蛋白。

使用三氯乙酸溶液調(diào)節(jié)樣品溶液的pH=3,靜置10 h左右后離心,取上層清液,將收集的上層清液調(diào)節(jié)pH至中性。

將savage法對樣品B的多糖峰面積與三氯乙酸法(TCA)得到的峰面積做柱狀圖比較。

1.3.4桃膠多糖水溶液脫色陰離子樹脂預處理:將陰離子樹脂浸泡在5%的乙醇中24 h,去離子水清洗后用5%的氫氧化鈉浸泡4 h,使用去離子水將其沖洗至pH=7后在60 ℃進行烘干[13]。

脫色率的測定及計算:桃膠多糖溶液使用陰離子樹脂脫色后,測定在420 nm處有最大紫外吸收,根據(jù)脫色前與脫色后的紫外吸光度,計算脫色率。

脫色率(%)=(脫色前吸光度-脫色后吸光度)/脫色前吸光度×100

脫色劑用量:較為常用的多糖的脫色方法一般為雙氧水法,活性炭法以及樹脂法[14-16]。但是雙氧水法具有較強的氧化性,破壞多糖結(jié)構(gòu),不利于實驗分析,活性炭對于粘性較強的桃膠來說,會增加過濾步驟的困難,故選擇陰離子交換樹脂進行脫色。分別向8份20 mL的待脫色溶液中加入1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的樹脂,設定脫色時間相同均為30 min后,檢測吸光度,計算脫色率。

脫色時間:向8份20 mL的待脫色溶液中均加入5%的樹脂,分別進行10、20、30、40、50、60、70、80 min脫色處理后檢測吸光度,計算脫色率。

1.4淋洗液的濃度及流速

分別配制5.0、8.0、10.0、20.0、40.0、60.0 mmol/L的NaOH溶液作為淋洗液,選擇最佳濃度。分別使用0.5、0.8、1.0、1.2、1.5 mL/min的流速檢測標準樣品,選擇最佳流速。

1.5標準溶液的配制

稱量半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖各0.1000 g,加水溶解后分別放入100 mL容量瓶中,定容至刻度配成1000 mg/L標準溶液。

分別從1000 mg/L標準溶液中吸取0.2、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0 mL半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖溶液,取0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 mL的甘露糖、鼠李糖溶液于100 mL容量瓶中定容配成混合標準溶液。分別得到2.0、6.0、10.0、20.0、40.0、60.0 μg/mL的半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖溶液與5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、100.0 μg/mL的甘露糖、鼠李糖標準混合溶液。

2　結(jié)果與分析

2.1淋洗液濃度及流速的選擇

淋洗液濃度:實驗表明在脈沖安培檢測器使用堿性流動相洗脫樣品,保留時間洗脫順序依次為酸性糖、中性糖和氨基酸糖,即出峰順序依次為鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖[17]。淋洗液濃度低于10.0 mmol/L時除鼠李糖外,另外4種糖可以較好地分離;而高于20.0 mmol/L時,半乳糖、葡萄糖、甘露糖這些差向異構(gòu)體和位置異構(gòu)體,無法實現(xiàn)分離;當淋洗液濃度為10.0 mmol/L時,五種糖的分離效果是相對較為理想的,且保留時間適中。因此本實驗選擇淋洗液濃度為10.0 mmol/L。

淋洗液流速:實驗發(fā)現(xiàn)改變流速的大小對出峰時間以及靈敏度均有影響,當流速降低時,保留時間明顯延長,而增大流速,對糖的分離影響較大。為提高實驗效率,綜合考慮,本文選擇淋洗液流速為1.0 mL/min,此時各組分分離度、靈敏度均較好。

圖1　標準樣品色譜圖Fig.1　Chromatograms of standards注:1:鼠李糖,2:阿拉伯糖,3:半乳糖, 4:葡萄糖,5:甘露糖，流速1.0 mL/min。

2.2水解時間的優(yōu)化選擇

隨著反應時間的增加,測得桃膠樣品各組分含量隨之增加,尤其是阿拉伯糖、甘露糖效果明顯。雖然在240 min得到的阿拉伯糖含量最高,但是葡萄糖、甘露糖的含量較之前的180 min增長不明顯。故綜合考慮反應時間和反應收率,本文選擇180 min為最佳反應時間。

圖2　樣品B在不同反應時間所測得的各組分含量Fig.2　The content of each component at different reaction time for sample B

2.3脫蛋白試劑的優(yōu)化選擇

由圖3可見樣品B在經(jīng)savage法處理后得到的阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖含量明顯少于三氯乙酸法,說明savage法對于多糖的損失影響比較大。故本實驗采用三氯乙酸脫蛋白法。

2.4脫色劑用量及脫色時間的優(yōu)化選擇

由圖4可以看出脫色劑的用量在5%內(nèi)呈現(xiàn)明顯增長趨勢,說明脫色劑用量對脫色率的影響較為明顯,但是5%后呈現(xiàn)平緩趨勢的狀態(tài),故本文選擇脫色劑用量為5%。

由圖5可以明顯看到脫色時間越長,脫色效果越明顯,但是在60 min后,脫色率的變化呈現(xiàn)一個平緩的趨勢,故綜合考慮本文選擇脫色時間為60 min。

圖3　樣品B在savage法 與三氯乙酸(TCA)法脫蛋白后的糖含量Fig.3　The content of monosaccharides after taking off the protein by savage and TCA

圖4　脫色劑用量對桃膠溶液脫色率的影響Fig.4　The effect of different amount of decolorant on peach gum decoloring rate

圖5　桃膠溶液在不同時間脫色率的變化圖Fig.5　The decoloring rate variation of peach gum in different time

2.5標準曲線與檢出限

分別測定混合標準溶液,根據(jù)峰面積與標準樣品濃度,繪制標準曲線。逐漸稀釋標準樣品溶液,由S/N=3得到各檢出限如表1所示。

表1　五種單糖的標準曲線與檢出限Table 1　The results of regression equation and detection limits for five Monosaccharides

表2　樣品含量測定結(jié)果Table 2　The content of monosaccharides of peach gum for A,B and C

表3　被測化合物加標回收率結(jié)果Table 3　The result of adding standard recovery

2.6色譜圖與檢測結(jié)果

樣品A、B、C色譜圖(圖6),組分含量見表2。樣品A中檢測到了阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖以及甘露糖四種單糖成分,而沒有檢測到鼠李糖。樣品B、C均檢測到阿拉伯糖、葡萄糖以及甘露糖,樣品B的圖可以看出半乳糖的峰的趨勢,但是低于檢測限。三種樣品均沒有檢測到鼠李糖可能是由于本身桃膠中鼠李糖含量較低,在經(jīng)過前處理后其樣品含量低于檢測限。

圖6　樣品A、B、C 3種桃膠樣品的色譜圖Fig.6　The chromatograms of peach gum for A,B and C

2.7加標回收率與精密性實驗

樣品B的加標回收率與精密度見表3。樣品B桃膠樣品回收率為92.0%～98.3%。將每份加標樣品分別進樣6次,通過峰面積計算精密度為2.25%～4.23%。

3　結(jié)論

本研究采用熱水浸提法浸提、三氯乙酸脫蛋白、陰離子交換樹脂脫色對桃膠樣品進行了前處理工作,使用離子色譜-脈沖安培檢測法檢測桃膠中的多

糖成分。實驗表明,此檢測方法不需要對其進行柱前衍生,靈敏度高,準確性好,操作簡單,適用性強,具有一定的實用價值?？梢宰鳛榭焖贆z測桃膠中多糖成分的一種方法。

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Determination of the polysaccharide content in origin peach gum by ion chromatography with pulsed ampere detector

SHEN Jie,ZHOU Guang-ming*,YU Lu

(Key Laboratory on Luminescence and Real-time Analysis(Southwest University),Ministry of Education,School of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China)

The ion chromatographic method with pulsed amperometric detectorhad was developed for the determination of peach gum polysaccharide content(rhamnose,arabinose,galactose,glucose,mannose). The analytes were separated on a METROSEP CARB 1(150 mm×4.0 mm)anion exchange column with 10 mmol/L NaOH as mobile phase at the flow rate of 1.0 mL/min,and the total analysis time of 22 min. The linear range of rhamnose and mannose was 5.0 to 100.0 μg/mL,the linear range of arabinose,galactose,glucose line arrange was 2.0 to 60.0 μg/mL. The detection limits of rhamnose,arabinose,galactose,glucose and mannose(20 μL injection,S/N=3)were 0.34,0.18,0.17,0.08,0.39 μg/mL,respectively. The recovery rates ranged from 92.0% to 98.3%,and RSDs of 5 polysaccharide contents ranged from 2.25% to 4.23% after 6 consecutive injections. Therefore,the proposed determination method was derivative-free,simple,fast,effective and sensitive,which facilitates the rapid detection and effective quality control of polysaccharide contents in peach gum.

Ion chromatography;pulsed ampere detector;peach gum;polysaccharide

2015-07-15

沈潔(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：離子色譜，E-mail：shenjiefamily@sina.com。

周光明(1964-)，男，博士，教授，研究方向：拉曼光譜學、離子色譜、分子光譜與色譜聯(lián)用技術(shù)，E-mail：gmzhou@swu.edu.cn。

國家自然科學基金(21277110)資助。

TS207.3

A

1002-0306(2016)05-0298-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.051