顧　偉,徐永健

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院/應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點(diǎn)教育部實(shí)驗(yàn)室,浙江寧波 315211)

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大海馬ACE抑制肽制備及其抗氧化能力的測(cè)定

顧偉,徐永健*

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院/應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點(diǎn)教育部實(shí)驗(yàn)室,浙江寧波 315211)

為了從大海馬蛋白中制備出ACE抑制肽及分析肽的抗氧化能力,本文通過(guò)比較小分子肽與ACE間的關(guān)系對(duì)蛋白酶進(jìn)行了選擇,篩選出木瓜蛋白酶作為海馬蛋白的水解酶。然后,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對(duì)木瓜蛋白酶制備ACE抑制肽的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果為酶底比(E/S)為 5%、時(shí)間7.5 h、pH7.7、溫度59 ℃,測(cè)得其水解度為20.41%±0.12%,ACEIPs的IC50值為1.897±0.072 mg/mL。經(jīng)Sephadex G-15分離純化后,得到五個(gè)組分,其中第三個(gè)組分(PH-I3)、第4個(gè)組分(PH-I4)和第5個(gè)組分(PH-I5)的活性最好,IC50分別為0.896、0.982、0.814 mg/mL;并對(duì)這五個(gè)組分進(jìn)行了抗氧化實(shí)驗(yàn),各組分均能顯著的清除DPPH自由基、羥基自由基,具備與Fe2+的螯合能力。所以,由PH-I制備的ACE抑制肽同時(shí)具有降血壓和抗氧化的功能,在功能性食品開(kāi)發(fā)中具有重要的意義。

大海馬高分子蛋白,ACE抑制肽,抗氧化能力,木瓜蛋白酶

治療和預(yù)防高血壓是當(dāng)今研究的一個(gè)熱門(mén)的課題[1]。在高血壓的調(diào)節(jié)機(jī)制中,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)對(duì)血壓的調(diào)節(jié)起著重要的作用,所以通過(guò)抑制ACE的活性是治療高血壓的一種重要方法[2]。目前,化學(xué)合成的ACE抑制劑具有強(qiáng)效的同時(shí)也產(chǎn)生了許多副作用,因此尋找一種高效無(wú)副作用的ACE抑制劑具有重要的意義[2]。從蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中分離出的ACE抑制肽(ACEIPs)具有效果溫和、專(zhuān)一、高效和無(wú)副作用等特點(diǎn),體現(xiàn)出良好的開(kāi)發(fā)價(jià)值,如從大豆蛋白[3]、白蓮蛋白[4]、燕麥蛋白[5]等酶解液中分離出ACE抑制肽,并開(kāi)發(fā)出多種相應(yīng)的產(chǎn)品。

自由基與人體的許多疾病都密切相關(guān),現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)糖尿病、衰老和氧化應(yīng)激損傷等疾病都與自由基的氧化反應(yīng)有關(guān)。氧化應(yīng)激能夠使血管受到某種程度上的損傷,從而引起高血壓等心血管疾病。正是由于自由基與許多疾病都密切相關(guān),所以抗氧化藥物越來(lái)越多在高血壓等疾病上得到了應(yīng)用。許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)ACE抑制肽同時(shí)具有抗氧化的功能,如朱麗娟[6]發(fā)現(xiàn)玉米蛋白水解物具有抗氧化能力的同時(shí)還具有抑制ACE活性的能力;Miguel等[7]通過(guò)給自發(fā)性高血壓大鼠飼喂高含量的抗氧化劑,發(fā)現(xiàn)能夠有效的降低大鼠血壓,這證實(shí)了自由基對(duì)大鼠的血管有一定的損傷,抗氧化劑能夠降低血液中氧自由基的濃度,改善血管的結(jié)構(gòu)和功能,從而起到降低大鼠血壓的能力。

大海馬含有較高的蛋白成分,自古為食藥同源生物[8]。對(duì)大海馬蛋白成分的分析與有效成分提取,將有效提高海馬蛋白的利用價(jià)值。本研究重點(diǎn)對(duì)大海馬蛋白進(jìn)行酶解分析,并從酶解液中分離純化與抗高血壓有關(guān)的多肽類(lèi)物質(zhì),并對(duì)其進(jìn)行抗氧化方面的測(cè)定,對(duì)海馬蛋白的高效利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

海馬粉大海馬由寧波大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地提供,凍干后,用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎,通過(guò)AS200型震篩機(jī)過(guò)60目篩得到海馬粉。海馬蛋白(SP)由海馬粉經(jīng)CO2超臨界流體萃取技術(shù)脫脂后獲得。N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸(FAPGG)、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(EC:3.4.15.1)、1,1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH)Sigma公司;堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和酸性蛋白酶北京索萊寶科技有限公司;Sephadex G-15Pharmacia公司;無(wú)水乙醇、抗壞血酸、硫酸亞鐵、體積分?jǐn)?shù)30% H2O2等國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

真空冷凍干燥機(jī)美國(guó)Labconco公司;DKS-24型電熱恒溫水浴鍋嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司;UB-7型pH計(jì)丹佛儀器(北京)有限公司;BS110S型分析天平賽多利斯(北京)教學(xué)儀器公司;超濾設(shè)備上海朗極有限公司;蛋白層析儀上海滬西青浦儀器有限公司;Tecan Infinite F200/M200型多功能酶標(biāo)儀 南昌新長(zhǎng)征醫(yī)療科技發(fā)展有限公司;Spe-ed型超臨界萃取儀美國(guó)ASI公司制造。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1肽的制備

1.2.1.1海馬蛋白組分(PH-I)的制備參考Jiang等[9]方法并略加改動(dòng),先后用胰蛋白酶和堿性蛋白酶分別酶解脫脂海馬粉,酶解液過(guò)濾得上清液即為海馬蛋白酶解混合溶液;用超濾膜(MWCO為20 ku)進(jìn)行超濾,收集分子量大于20 ku的濾液,濃縮和冷凍干燥后得海馬蛋白粉,即為PH-I。

1.2.1.2酶解PH-I制備ACE抑制肽選用木瓜蛋白酶,菠蘿蛋白酶,酸性蛋白酶,復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶等5種蛋白酶對(duì)PH-I進(jìn)行再次酶解。取PH-I 0.5 g,加入25 mL蒸餾水,調(diào)節(jié)水浴鍋至每種酶所需要的最佳溫度,用0.02 mol/L HCl和0.02 mol/L NaOH溶液進(jìn)行酸堿調(diào)節(jié),底物預(yù)熱10 min,E/S為4%,酶解6 h后,沸水滅酶活10 min,終止反應(yīng)。冷卻后,以3000 r/min,離心10 min,取上清液備用并冷凍干燥得到多肽粉。取多肽粉分別配成濃度為2、1.6、1.2、0.8和0.4 mg/mL五個(gè)梯度溶液,分別用于測(cè)量ACE抑制率,求出ACE的半抑制濃度IC50。

1.2.2分析測(cè)定

1.2.2.1PH-I和SP氨基酸組成分析送檢,送檢單位:上海微譜化工技術(shù)服務(wù)有限公司。樣品經(jīng)酸水解和異硫氰酸苯酯(PITC)衍生化后,將衍生化的氨基酸衍生物通過(guò)島津高效液相色譜儀LC-20A分離檢測(cè)。

1.2.2.2PH-I中粗蛋白成分的測(cè)定參照半微量凱氏定氮法(GB/T 5009.5-2003)。

1.2.2.3水解度(DH%)測(cè)定氨基態(tài)氮測(cè)量方法參照醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法(GB/T 5009.39-2003),并稍加改進(jìn)來(lái)測(cè)定,取酶解液上清液10 mL,加入60 mL蒸餾水,先將pH調(diào)制8.20,再利用標(biāo)準(zhǔn)0.0077 mol/L的NaOH溶液進(jìn)行滴定至pH為9.20,記錄所消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH量。水解度計(jì)算公式如下:DH(%)=(h-h0)÷htot×100%=[(V2-V1)×0.0077×0.014×3]÷htot×100%,式中,DH-水解度%;h,h0-分別為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中氨基態(tài)氮含量,μg/mL;htot-脫脂海馬骨粉原料總氮μg/mL;V2,V1-分別為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組所消耗的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉的體積,mL。

1.2.2.4ACE抑制活性測(cè)定參考李瑩測(cè)定ACE抑制率方法[10]并略作修改,具體方法為:將20 μL多肽溶液和20 μL的ACE溶液(0.1 U/mL水)加入96微孔板的微孔中,但不混合,然后加入130 μL經(jīng)過(guò)預(yù)熱的底物(1.0 mmol/L FAPGG溶解于50 mmol/L Tris-HCl,pH7.5,包含0.3 mol/L NaCl)使其開(kāi)始反應(yīng)。酶標(biāo)儀溫度為37 ℃,在340 nm下每1 min記錄一次吸光值,共記錄20 min?？瞻讓?duì)照使用20 μL的緩沖液(50 mmol/L的Tris-HCl,pH7.5,包含0.3 mol/L NaCl)代替多肽溶液。以吸光值(ΔA340min-1)對(duì)時(shí)間作出曲線,計(jì)算出斜率,取6～15 min的斜率來(lái)計(jì)算。

ACE抑制率(%)=(1-ΔA抑制率/ΔA空白)×100,半抑制濃度IC50:抑制50% ACE活性時(shí)所需樣品的濃度。

1.2.3木瓜蛋白酶酶解工藝條優(yōu)化

1.2.3.1酶解工藝單因素實(shí)驗(yàn)以DH%為指標(biāo),對(duì)影響酶解效果的E/S、溫度、pH、時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。對(duì)E/S進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn):pH7.5,溫度55 ℃,酶解時(shí)間6 h,E/S分別為2%、3%、4%、5%和6%五個(gè)梯度;對(duì)時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),pH7.5,溫度55 ℃,E/S 5%,酶解時(shí)間分別為1、3、5、7和9 h共5個(gè)梯度;對(duì)pH進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),溫度55 ℃,E/S 5%,時(shí)間7 h,pH梯度分別為5.5、6.5、7.5、8.5和9.5共5個(gè)梯度;對(duì)溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),E/S 5%,時(shí)間7 h,pH7.5,溫度梯度設(shè)置為45、50、55、60和65 ℃共5個(gè)梯度。

1.2.3.2響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝E/S為4%和5%之間,DH%存在著顯著性差異(p<0.05),而5%和6%之間DH%不存在差異(p>0.05),從節(jié)約成本的角度考慮,將設(shè)定E/S為5%。對(duì)時(shí)間、pH和溫度三因素通過(guò)響應(yīng)面Box-Behnken來(lái)進(jìn)行工藝優(yōu)化,確定最優(yōu)酶解工藝,實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1　木瓜蛋白酶酶解優(yōu)化的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1　The experimental design for Response surface experimental of Papain

1.2.5PH-I分離純化產(chǎn)物的抗氧化活性分析在最佳的木瓜蛋白酶酶解PH-I制備ACE抑制肽的條件下,將得到的ACE抑制肽經(jīng)濃縮和真空冷凍干燥后,用Sephadex G-15分離純化,得到五個(gè)區(qū)間組分,采用清除DPPH自由基能力、Fe2+螯合能力和清除羥基自由基(·OH)能力3個(gè)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)ACE抑制肽的抗氧化能力,并以BHT,EDTA和維生素C作陽(yáng)性對(duì)照。DPPH自由基清除率的測(cè)定方法參照[12];亞鐵離子(Fe2+)螯合能力測(cè)定方法參照劉建華[13]和Dinis[14];清除羥基自由基(·OH)能力測(cè)定方法參照劉建華和涂勇剛[15]。

1.2.6數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)采用Microsoft Excel軟件和SAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以及圖表編輯,Design-Expert 7.0.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析。若p>0.05,則差異不顯著;若p<0.05,則差異顯著;若p<0.01,則差異極其顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1PH-I與SP氨基酸組成成分分析

SP和PH-I氨基酸組成如表2?？傮w上看,PH-I中疏水性氨基酸(74.96%)、支鏈氨基酸(13.21%)和芳香族氨基酸(4.49%)的含量都略高于SP。一般來(lái)說(shuō),蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸含量、支鏈氨基酸含量和疏水性氨基酸含量較高者,蛋白酶解物所表現(xiàn)的ACE抑制率越高[16]。此外,蛋白酶解物的ACE抑制能力與氨基酸的疏水性也呈現(xiàn)出正相關(guān)[16]。經(jīng)觀察,SP與PH-I間,疏水值大于10以上的氨基酸(Pro,Ile,Leu,Phe)在PH-I中含量要高于SP,且PH-I相比較于SP,分子量更小,更容易水解成小分子多肽。由此可知,PH-I更適于用來(lái)制備ACE抑制肽。劉佳[17]通過(guò)比較大豆蛋白與高分子量組分的大豆蛋白(HMF)疏水性氨基酸組成之間的差異,也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似結(jié)果。

表2　PH-I和SP中的氨基酸組成(%)Table 2　Amino acid compositions of PH-I and SP(%)

式中,疏水性氨基酸:纈氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、異亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)和甘氨酸(Gly),酪氨酸(Tyr);支鏈氨基酸:纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)和亮氨酸(Leu);芳香族氨基酸:酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)。

2.2制備ACEIPs最優(yōu)酶選擇結(jié)果

在體腸實(shí)驗(yàn)中，TPGS-CS/PTX膠束溶液和PTX聚氧乙烯氫化蓖麻油EL-40乙醇（1∶1）溶液相比，前者的載藥量大，主藥吸收更多。在結(jié)腸中Ka較大，而在十二指腸較小，與文獻(xiàn)報(bào)道[17]不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明，TPGS-CS/PTX膠束能提高難溶性藥物PTX的生物利用度。進(jìn)一步的吸收機(jī)制研究如黏蛋白吸附、采用香豆素作為熒光探針標(biāo)記的材料在Caco-2細(xì)胞中的攝取等實(shí)驗(yàn)也已完成，表明TPGS- CS能使攝取增加。其他機(jī)制研究正在進(jìn)行中。

據(jù)報(bào)道,ACEIPs的抑制活性主要取決于C端的氨基酸組成,當(dāng)C端為芳香族氨基酸時(shí)(如:Trp、Tyr、Phe、Pro),應(yīng)選擇酸性蛋白酶酶解,產(chǎn)物多肽對(duì)ACE酶的抑制活性較強(qiáng);而當(dāng)C端殘基上有帶正電荷的氨基酸存在時(shí)(如Lys和Arg),應(yīng)選擇木瓜蛋白酶酶解,產(chǎn)物的抑制活性將顯著增強(qiáng)[2]。N端對(duì)于抑制ACE活性也有作用,當(dāng)N端為疏水性氨基酸和支鏈氨基酸時(shí)(包括Val、Ala、Tyr),選擇菠蘿蛋白酶產(chǎn)物的抑制活性較強(qiáng)[2,18]。然而,對(duì)于多肽與ACE酶之間的構(gòu)效關(guān)系還僅僅局限于對(duì)已知降血壓肽氨基酸序列的定性分析,還有許多降血壓肽并不符合上述規(guī)律,所以選擇復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對(duì)于發(fā)現(xiàn)新型的ACEIPs具有重要的意義[19]。通過(guò)對(duì)所選擇的5種蛋白酶的酶解液ACEIPs的IC50值的方差分析發(fā)現(xiàn),除了菠蘿蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的IC50值之間沒(méi)有差異外,其它幾種酶的IC50值之間都存在顯著差異(p<0.05)。其中,木瓜蛋白酶的IC50值最小為2.028±0.110 mg/mL,所以,選擇木瓜蛋白酶作為酶解PH-I制備ACE抑制肽的酶(表3)。

表3　五種酶解液ACEIPs的IC50值Table 3　Values of IC50 of ACEIPs

注:若a,b,c,d字母不相同,表示相互間存在差異顯著(p<0.05);若字母相同,表示相互間差異不顯著(p>0.05)。

2.3木瓜蛋白酶單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)木瓜蛋白酶酶解PH-I制備ACE抑制肽進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),其結(jié)果如圖1。E/S為5%和6%之間時(shí),差異不顯著,是由于E/S為5%已經(jīng)能夠完全的將PH-I水解,所以E/S為6%時(shí)的水解度與5%不存在差異(p>0.05),從節(jié)約的角度考慮將E/S設(shè)置為5%;當(dāng)酶解時(shí)間為7 h,已經(jīng)完全將PH-I水解,所以與9 h相比,水解度差異不顯著(p>0.05)并趨于平緩;當(dāng)pH為6.5,8.5和9.5時(shí)都不是木瓜蛋白酶合適的酸堿度,抑制了酶的活力,所以與pH為7.5相比,水解度差異顯著(p<0.05);類(lèi)似的,溫度為60 ℃時(shí),是酶的合適溫度,酶解效果最好,與其他梯度間均有顯著差異(p<0.05)。因此,木瓜蛋白酶單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果為E/S 5%、酶解時(shí)間7 h、pH7.5、溫度60 ℃。

圖1　各因素對(duì)木瓜蛋白酶酶解PH-I水解度的影響Fig.1　The impact of various factors on the Papain hydrolysis degree of hydrolysis of the PH-I

2.4響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1PH-I酶解條件分析和優(yōu)化對(duì)酶解時(shí)間、pH和酶解溫度三因素通過(guò)響應(yīng)面Box-Behnken來(lái)進(jìn)行工藝優(yōu)化,確定最優(yōu)酶解工藝,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4和表5。

表4　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)表及結(jié)果Table 4　The design and results of Response surface experiments

2.4.2方差分析獲得木瓜蛋白酶的回歸方程:

表5　響應(yīng)面方差分析Table 5　Analysis the Response surface of variance

注:(a)P-value Prob>F值的大小表示模型及各因素的顯著水平;(b)P-value Prob>F值大于0.05表示模型及各因素?zé)o顯著影響,P-value Prob>F小于0.05表示模型及各因素有顯著影響,P-value Prob>F小于0.01表示模型及因素有極顯著影響。

DH(%)=-445.704+15.236A+9.615B+12.608C+0.055AB-0.02AC-0.0345 BC-0.965A2-0.518B2-0.1033C2,其中,A、B、C分別表示時(shí)間、pH和溫度。

由表5方差分析得出,該模型Prob>F(a)值小于0.01,表明本模型是極顯著的。失擬項(xiàng)表示模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值不擬合的概率,表5中木瓜蛋白酶的模型失擬項(xiàng)的Prob>F(a)值為0.0585大于0.05,模型失擬項(xiàng)不顯著,模型選擇合適,可以用此模型對(duì)PH-I蛋白進(jìn)行酶解工藝優(yōu)化。

從回歸方程及表5看,AB、AC對(duì)木瓜蛋白酶影響不顯著,A、C、A2、B2、C2對(duì)木瓜蛋白酶有極顯著影響,B、BC對(duì)木瓜蛋白酶有顯著影響?；貧w方程優(yōu)化后得:

DH(%)=-445.704+15.236A+9.615B+12.608C-0.0345 BC-0.965A2-0.518B2-0.1033C2,式中,A、B、C分別表示時(shí)間、pH和溫度。

2.4.3交互作用分析與優(yōu)化通過(guò)Design-Expert軟件求解方程,對(duì)于木瓜蛋白酶,時(shí)間和溫度對(duì)酶解效果影響均較大,其次為pH。由實(shí)驗(yàn)可知,木瓜蛋白酶酶解PH-I的最佳酶解工藝為時(shí)間7.5 h、pH7.72、溫度59 ℃,預(yù)測(cè)水解度為20.49%。

圖2　酶解溫度和pH因素之間相互作用 對(duì)木瓜蛋白酶酶解效果的影響Fig.2　The interactions among temperature and pH value in response surface experiment of Papain

2.4.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)PH-I水解度驗(yàn)證:根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化的最佳工藝條件(E/S 5%,時(shí)間7.5 h,pH7.7,溫度59 ℃),實(shí)測(cè)得水解度DH=20.41%±0.12%。略小于預(yù)測(cè)值20.49%,其誤差范圍在1%之內(nèi)。說(shuō)明PH-I木瓜蛋白酶酶解工藝優(yōu)化效果較好。

ACEIPs的IC50值的驗(yàn)證:測(cè)得ACEIPs的IC50值為1.897±0.072 mg/mL,與優(yōu)化前的ACEIPs的IC50值為2.028±0.110 mg/mL相比,有著顯著的提高(p<0.05)。

2.5PH-I分離純化后ACE抑制活性分析

選用Sephadex G-15對(duì)上述酶解液進(jìn)行分離,所得5個(gè)部分(圖3),根據(jù)分子篩的原理,這5個(gè)區(qū)間的分子量大小依次為PH-I1>PH-I2>PH-I3>PH-I4>PH-I5。

圖3　PH-I Sephadex G-15蒸餾水洗脫曲線Fig.3　The elution curve of PH-I by water on Sephadex G-15 column chromatography

分別對(duì)純化后的五個(gè)部分進(jìn)行ACE抑制活性分析(圖4),經(jīng)測(cè)定PH-I3、PH-I4和PH-I5抑制肽的活性最好,3個(gè)區(qū)間的IC50值分別為0.896,0.982和0.814 mg/mL。

表6　PH-I分離純化后各組分的抗氧化能力Table 6　The antioxidant capacity of each segment was isolated by PH-I

圖4　各組分的ACE抑制活性分析Fig.4　Elution profile with ACE inhibitory activity of PH-I on Sephadex G-15

2.6PH-I分離純化后抗氧化能力分析

分離純化后的5個(gè)組分對(duì)DPPH自由基的清除能力如表6,PH-I1、PH-I3和PH-I4對(duì)DPPH自由基的清除能力較強(qiáng),分別平均達(dá)到64.58%、55.79%和52.28%,與濃度為0.5 mg/mL的人工合成的BHT對(duì)DPPH自由基的清除能力較為接近。該能力較其他一些藥食同源的品種要強(qiáng)一些,如泰和烏骨雞活性肽的抗氧化能力,在濃度為1 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)為36.7%[15]。

分析Fe2+金屬螯合能力,PH-I5和PH-I2與亞鐵離子(Fe2+)的螯合能力分別為89.6%和 81.43%,略低于同濃度下EDTA(94.53%)的螯合能力。但比其他生物活性蛋白要高得多,玉米蛋白水解液8 mg/mL對(duì)Cu2+的金屬螯合能力僅為20%[20],泰和烏骨雞活性肽對(duì)金屬離子螯合能力在濃度為1 mg/mL時(shí),與Fe2+的螯合能力為15.4%[15]。

分離純化后的5個(gè)區(qū)間多肽對(duì)羥基自由基(·OH)的清除能力,除了PH-I2的清除率較高(36.43%)外,其它四個(gè)組分對(duì)羥基自由基的清除率為11%左右。低于一些報(bào)道[21]。這可能是由于提取原料不同及測(cè)定方法的差異等造成的。

3　結(jié)論

通過(guò)分析小分子肽與ACE酶之間的關(guān)系并結(jié)合酶解后小分子肽抑制ACE能力,篩選出木瓜蛋白酶酶解PH-I;應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化了木瓜蛋白酶的酶解工藝,優(yōu)化后ACEIPs的IC50值為1.897±0.072 mg/mL,與優(yōu)化前相比較,肽的活力有著顯著的提高,這說(shuō)明了隨著水解度的提高,釋放出更多的短肽,使得單位質(zhì)量?jī)?nèi)的短肽摩爾數(shù)增加,從而提高了肽抑制ACE的能力。酶解液經(jīng)Sephadex G-15分離純化后,得到五個(gè)組分,其中PH-I3、PH-I4和PH-I5的活性最好,IC50分別為0.896,0.982和0.814 mg/mL,具有進(jìn)一步分離純化出更高活性肽的意義。

由于自由基的氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)對(duì)血管照成一定的損傷,促進(jìn)高血壓的患病幾率,所以分析多肽的抗氧化能力具有一定的意義。通過(guò)分析可知,五個(gè)組分的多肽均表現(xiàn)出一定的抗氧化能力,但是每個(gè)組分區(qū)間對(duì)DPPH自由基、羥基自由基、Fe2+的清除率和螯合能力存在著一定的差異。PH-I1對(duì)DPPH自由基清除率為64.58%,接近0.5 mg/mL的BHT對(duì)DPPH自由基的清除率,明顯的強(qiáng)于其它4個(gè)組分對(duì)DPPH自由基的清除率;PH-I5與Fe2+的螯合能力最強(qiáng),而PH-I5的分子量最小,小分子肽更加容易暴露活性位點(diǎn),與Fe2+發(fā)生螯合作用;而PH-I2則對(duì)羥基自由基的清除率最強(qiáng);多肽在DPPH自由基、羥基自由基和Fe2+上所表現(xiàn)出的差異,是由于這三個(gè)指標(biāo)與自由基的作用機(jī)理之間的差異。所以綜合分析小分子肽對(duì)ACE的抑制能力和抗氧化能力,PH-I3、PH-I4和PH-I5適合進(jìn)一步的分離純化并進(jìn)行深入的研究,這對(duì)于功能性食品肽在高血壓方面的應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。

[1]Chobanian A V,Bakris G L,Black H R,et al. Seventh report of the joint national committee on prevention,detection,evaluation,and treatment of high blood pressure[J]. Hypertension,2003,42(6):1206-1252.

[2]李勇,丁葉,王軍波,等. 肽臨床營(yíng)養(yǎng)學(xué)[M]. 北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社,2012:56-57.

[3]張焱,范遠(yuǎn)景. 堿性蛋白酶水解大豆多肽及抑制ACE效果的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(20):6004-6006.

[4]李恒,鄭輝,薛喜文,等. 木瓜蛋白酶制備廣昌白蓮降血壓活性肽的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(10):199-204.

[5]張曉平,趙世鋒,蔣瓊,等. 酶解燕麥蛋白制備ACE抑制肽的研究[J].食品科學(xué),2009,30(11):189-193.

[6]朱麗娟,熊幼翎. 玉米蛋白水解物體外消化產(chǎn)物的抗氧化及ACE抑制活性研究[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué),2008.

[7]Marta M,María J A,Mercedes S,et al. Antihypertensive,ACE

-inhibitory and vasodilator properties of an egg white hydrolysate:Effect of a simulated intestinal digestion[J]. Food Chemistry,2006,104(1):163-168.

[8]Chen L,Wang X Y,Huang B K. The genus Hippocampus-A review on traditional medicinal uses,chemical constituents and pharmacological properties[J]. Journal of Ethnopharmacology,2015,162(2):104-111.

[9]Jiang Z Z,Xu Y J,Su Y T. Preparation process of active enzymolysis polypeptides from seahorse bone meal[J]. Food Science & Nutrition,2014,2(5):490-499.

[10]李瑩,曾曉雄. 泥鰍蛋白源ACE抑制肽的酶法制備及其降壓活性研究[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[11]洪慧,龍曉英,李力任,等. 葡聚糖微型凝膠柱測(cè)定辣椒堿柔性脂質(zhì)體包封率的條件探討[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2005,21(2):120-123.

[12]成靜,周?chē)?guó)儀,陳棟梁,等. 白蛋白多肽清除 DPPH· 測(cè)定方法的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2009,30(8):121-122.

[13]劉建華. 泰和烏骨雞活性肽抗氧化與降血壓及其補(bǔ)血作用研究[D]. 南昌:南昌大學(xué),2011.

[14]Dinis T C P,Maderia V M C,Allneida L M. Aetion of Phenolic derivatives(acetaminoPhen,salieylate,and 5-aminosalieylate)as inhibitors of membrane lipid Peroxidation and as Peroxyl radieal seavengers[J]. Archives of Biochemistry and BioPhysies. 1994,315(l):161-169.

[15]劉建華,涂勇剛,孫亞真,等. 泰和鳥(niǎo)骨雞黑色素的體外抗氧化作用[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2009,28(2):145-149.

[16]黎觀紅. 食品蛋白源血管緊張素轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化酶抑制肽的研究[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué),2005.

[17]劉佳,楊嚴(yán)俊. 大豆蛋白ACE抑制肽的研究[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué),2008.

[18]Cheung H S,Wang F L,Ondetti M A,et al. Binding of peptide substrates and inhibitors of angiotensin-converting enzyme[J]. Journal of Biological Chemistry,1980,255(2):401-407.

[19]Lee J K,Hong S,Jeon J K,et al. Purification and characterization of angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides from the rotifer,Brachionus rotundiformis[J]. Bioresorce Technology,2009,100(21):5255-5259.

[20]Zhu L J,Chen J,Tang X Y,et al. Reducing,radical scavenging,and chelation properties ofinvitrodigests of alcalase-treated zein hydrolysates[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56(8):2714-2721.

[21]Kim S Y,Je J Y,Kim S K. Purification and characterization of antioxidant peptide from hoki(Johnius belengerii)frame protein by gastrointestinal digestion[J]. Journal of Nutritional Biochemistry,2007,18(1):31-38.

Preparation ofHippocampusACE inhibitory peptide and determination of antioxidant capacity

GU Wei,XU Yong-jian*

(School of Marine Sciences,Ningbo University/Key Laboratory for Applied Marine Biotechnology of Ministry of Education,Ningbo 315211,China)

In order to preparation ACE inhibitory peptide fromHippocampusand determination antioxidant capacity,this article compare the relationship between the peptide and ACE,the Papain were selected out from 5 proteases to hydrolyse seahorse protein. On the basis of single-factor experiments,the key parameters of Papain were optimized by Response Surface Method for preparation ACE inhibitory peptides,the operating conditions were:enzyme to substrate(E/S)ratio of 5%,hydrolysis time of 7.5 h,pH of 7.7,hydrolysis temperature of 59 ℃;under this condition,the degree of hydrolysis(DH%)was 20.41%±0.12%,ACE inhibitory activity of IC50was 1.897±0.072 mg/mL. The hydrolyzate was divided into five fractions through Sephadex G-15,where component 3(PH-I3),component 4(PH-I4)and component 5(PH-I5)had good activity and the IC50of each fraction was 0.896 mg/mL,0.982 mg/mL and 0.814 mg/mL;the anti-oxidation experiments of five fractions,the components can scavenging DPPH.,hydroxyl radicals and chelating with the Fe2+significantly. Therefore,the PH-I prepared ACE inhibitory peptides both hypotensive and antioxidant functions,which had great significance in the development of functional foods.

Hippocampus;ACE inhibitory peptides;antioxidant capacity;Papain

2015-08-04

顧偉(1990-),男,碩士研究生,研究方向:食品工程,E-mail:1239156290@qq.com。

徐永健(1975-),男,博士,教授,研究方向:海洋生物資源開(kāi)發(fā)與利用,E-mail:xuyongjian@nbu.edu.cn。

中國(guó)國(guó)家自然科學(xué)基金資助(41276123)；國(guó)家星火項(xiàng)目計(jì)劃的支持(2012GA701048)。

TS218

B

1002-0306(2016)05-0201-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.031