盧忠英,陳仕學(xué),*,李彥青,姚元勇,魯?shù)劳?邢明明

(1.銅仁學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院實驗中心,貴州銅仁 554300;2.銅仁學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所,貴州銅仁 554300)

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響應(yīng)面分析法優(yōu)化纈草中黃酮類化合物的提取工藝

盧忠英1,陳仕學(xué)1,*,李彥青1,姚元勇2,魯?shù)劳?,邢明明2

(1.銅仁學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院實驗中心,貴州銅仁 554300;2.銅仁學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所,貴州銅仁 554300)

本文以產(chǎn)自貴州地區(qū)的纈草為實驗材料,以乙醇為浸提試劑,探究纈草中黃酮類化合物的提取工藝。方法:在乙醇濃度、料液比、浸提溫度和浸提時間四個單因素實驗基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面設(shè)計方法優(yōu)化提取工藝參數(shù)。結(jié)果表明:最佳提取工藝為乙醇濃度53.0%,料液比1∶29 g/mL,浸提溫度73 ℃,浸提時間2.6 h。在此條件下,實際得到的黃酮類化合物得率為2.133%,與理論提取率相比較,其RSD為3.5%。結(jié)論:響應(yīng)面法優(yōu)化的纈草中黃酮類化合物提取工藝穩(wěn)定,具有可靠性。

纈草,黃酮類化合物,響應(yīng)面分析法,得率

纈草(Valerianaofecnilis)為敗醬科纈草屬植物,主要以根莖入藥。纈草主要有效成分有揮發(fā)油、環(huán)烯醚萜類、生物堿類、黃酮類化合物[1-4]。據(jù)報道,纈草中黃酮類化合物先已發(fā)現(xiàn)7種,其具有改善微循環(huán)、抗腫瘤和抗菌等生理活性[5]?；诶i草含豐富的有效成分,生物活性多樣,具有廣闊的開發(fā)前景,可以創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟和社會效益[6-8]。黃酮類化合物是一類在植物體中廣泛存在,且具有多種生物活性的多酚類化合物。它具有明顯的抗?jié)?、抗炎、抗菌、生物抗氧化性、降低血管脆性及異常的通透性、抑制血小板聚集和血栓形成等生理活性[9-11]。本文以纈草為原材料,以乙醇為提取劑進行浸提黃酮類化合物,在單因素實驗基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法優(yōu)化實驗得出最佳提取工藝條件,為纈草的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù),從而提高纈草的綜合利用價值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

纈草采自貴州江口縣;石油醚、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉成都金山化學(xué)試劑有限公司;以上試劑均為分析純。

電熱恒溫電水浴鍋國華電器有限公司;DHG-9146型真空干燥箱上海精宏實驗設(shè)備有限公司;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限公司;FW80型萬能粉碎機北京科偉永興儀器有限公司;AR124CN型電子天平上海恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1標準曲線的繪制準確稱取蘆丁標準品10.0 mg,溶解,水浴加熱,于100 mL容量瓶定容,制成0.1 mg/mL標準溶液。再用移液管移取蘆丁標準溶液0、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL于10 mL容量瓶中,分別加入5 g/100 mL亞硝酸鈉0.4 mL,放置5 min,再加10 g/100 mL硝酸鋁0.4 mL,放置5 min,再加4 g/100 mL氫氧化鈉4 mL。定容,靜置10 min。在510 nm波長下測其吸光值,以蘆丁標準樣品質(zhì)量濃度C mg/mL為橫坐標,吸光度A為縱坐標,繪制標準曲線。得出回歸方程,由回歸方程計算纈草中黃酮類化合物得率為:Y(%)=C×V×D×100/M。上式中:Y為得率,%;C為提取液中黃酮類化合物的含量,mg/mL;V為提取液的體積,mL;D為稀釋倍數(shù);M為樣品質(zhì)量g。

1.2.2工藝流程纈草→預(yù)處理→脫脂樣品→乙醇提取黃酮→濃縮→黃酮類化合物的吸光值測定→數(shù)據(jù)整理優(yōu)化提取條件→驗證實驗。

1.2.3材料預(yù)處理將纈草置于粉碎機內(nèi)粉碎成粉末,將粉末通過100目篩子過濾后,用石油醚在回流裝置里回流脫脂2 h,抽濾,置于烘干器中40 ℃干燥10 h,干燥后得樣品備用。

1.2.4纈草中黃酮提取及含量測定準確稱取脫脂樣品干粉1.0 g置于容積100 mL 燒瓶內(nèi),按一定料液比加入乙醇水溶液在一定溫度下回流提取一定時間后,過濾。相同方法提取兩次,合并濾液,用乙醇水溶液定容。用回歸方程測定纈草總黃酮得率。

1.2.5單因素實驗設(shè)計和響應(yīng)面實驗方法稱取5份預(yù)處理后的纈草粉末各1 g,設(shè)浸提料液比為1∶20 g/mL,浸提溫度為70 ℃,浸提時間為2 h,考察乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%;對纈草中黃酮類化合物得率的影響,由此可得乙醇的最佳濃度。再以最佳乙醇濃度為浸提溶劑,繼續(xù)考察料液比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL;浸提溫度為55、60、65、70、75 ℃;浸提時間為1、1.5、2、2.5、3 h等因素對纈草中黃酮類化合物得率的影響。在上述實驗基礎(chǔ)上,為得到纈草中黃酮提取的最優(yōu)工藝條件,以乙醇濃度(X1)、料液比(X2)、浸提溫度(X3)、浸提時間(X4)為自變量設(shè)計實驗,以黃酮類化合物得率(%)為響應(yīng)值,進行響應(yīng)面分析實驗[12],實驗因素和水平設(shè)計見表1。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

單因素實驗數(shù)據(jù)用Microsoft Office Excel2007分析作圖。響應(yīng)面優(yōu)化實驗數(shù)據(jù)采用Design-ExpertV8.0進行分析處理和作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1蘆丁標準曲線的制作

由1.2.1的方法制得的標準曲線方程為:Y=0.084C-0.004(R2=0.999),二者呈良好的線性關(guān)系(見圖1)。根據(jù)標準曲線計算黃酮類化合物的得率為:Y(%)=C×V×D×100/M。

表1　Box-Behnken設(shè)計實驗因素水平及編碼Table 1　The factors,levels and codes of Box-Behnken design

圖1　標準曲線方程Fig.1　Standard cure of the rutin

2.2單因素實驗

2.2.1乙醇濃度對纈草中黃酮類化合物得率的影響如圖2所示。

圖2　乙醇濃度對黃酮類化合物得率的影響Fig.2　The effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids

由圖2可知,當(dāng)乙醇濃度在40%～50%之間時,得率明顯增加,在50%達到最大,繼續(xù)增加至60%時,得率一直降低。在60%～80%得率明顯下降(p<0.05),乙醇濃度過大時會導(dǎo)致樣品細胞內(nèi)部雜質(zhì)的溶出,而使黃酮類化合物得率略有增加?？梢?當(dāng)乙醇濃度為50%時得最高,確定最佳乙醇濃度為50%。

2.2.2料液比對纈草中黃酮類化合物得率的影響由圖3可知,當(dāng)料液比在1∶15～1∶30 g/mL時,得率持續(xù)增加;繼續(xù)增加料液比至1∶35 g/mL,黃酮類化合物得率有顯著下降趨勢[13](p<0.05)。因此,確定最佳料液比為1∶30 g/mL。

2.2.3浸提溫度對纈草中黃酮類化合物得率的影響如圖4所示。

圖3　料液比對黃酮類化合物得率的影響Fig.3　The effect of liquid ratio on the yield of flavonoids

圖4　浸提溫度對黃酮類化合物得率的影響Fig.4　The effect of extraction temperature on the yield of flavonoids

由圖4可知,當(dāng)浸提溫度在55～70 ℃時,纈草中黃酮的得率是緩緩增大的;浸提溫度超過70 ℃時,黃酮類化合物得率有所下降,分析可能是溫度過高破壞了黃酮類化合物的熱穩(wěn)定性,同時雜質(zhì)溶出的概率也有所增加所致[14]。因此,確定最佳浸提溫度可選為70 ℃。

2.2.4浸提時間對纈草中黃酮類化合物得率的影響如圖5所示。

圖5　浸提時間對黃酮類化合物得率的影響Fig.5　The effect of extraction time on the yield of flavonoids

由圖5可知,當(dāng)浸提溫度在1～2.5 h之間時,黃酮類化合物得率穩(wěn)步增長達到最大,繼續(xù)增加時間,黃酮類化合物得率明顯降低。因此,確定最佳浸提時間為2.5 h。

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化提取纈草中黃酮類化合物

2.3.1響應(yīng)面實驗結(jié)果響應(yīng)面實驗結(jié)果見表2,方差分析見表3。

表2　響應(yīng)面實驗結(jié)果Table 2　The results of the response surface

表3　回歸方程方差分析Table 3　Analysis of variance of the regression equation

表5　提取條件優(yōu)化Table 5　Optimization of extraction condition

表4　回歸方程可靠性分析Table 4　Credibility analysis of regression equation

2.3.2模型建立與方差分析利用Design-Expert.V8.0軟件對表2響應(yīng)值進行回歸擬合,以X1、X2、X3、X4為自變量對得率Y進行數(shù)據(jù)擬合建立如下多元二次回歸數(shù)學(xué)模型:

Y=2.11+0.014X1-9.167E-0.04X2+0.12X3+0.043X4-0.047X1X2+0.015X1X3+0.015X1X4-0.012X2X3-0.021X2X4-0.027X3X4-0.066X12-0.065X22-0.096X32-0.068X42

2.3.3響應(yīng)面分析為考察各交互項對黃酮類化合物得率的影響,對該模型進行降維分析。由圖6可直觀觀察各因素對響應(yīng)值的影響,比較圖(A)～圖(F)可知,X3、X4隨著量的增大,響應(yīng)面值增大;當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后,隨著因素的增大,響應(yīng)值逐漸減小;X1、X2影響響應(yīng)面曲線較平緩,即影響黃酮類化合物得率的主次因素為X3>X4>X1>X2,與方差分析結(jié)果相同。

圖6　乙醇濃度、料液比、浸提溫度、浸提時間對黃酮類化合物得率交互影響響應(yīng)面圖Fig.6　Response surface plots showing the effects of four extraction conditions on flavonoids yield

2.3.4最佳提取工藝確定通過Design-Expert.V8.0對二元回歸方程求最大值得到最佳提取工藝條件和黃酮類化合物理論最大得率。設(shè)計提取條件優(yōu)化實驗,在最優(yōu)工藝條件下進行重復(fù)實驗,計算得率,進行比較分析,實驗結(jié)果見表5。

由表5可知,在最佳提取工藝條件下重復(fù)實驗,黃酮得率為2.133%,接近理論得率2.143%,RSD值為3.5%,說明響應(yīng)面法建立的黃酮類化合物提取數(shù)學(xué)模型具有穩(wěn)定可靠性。

3　結(jié)論

本實驗采用了Design-Expert.V8.0軟件中的Box-Behnken(BBD)中心組合原理設(shè)計實驗,選用乙醇作為溶劑提取纈草中的黃酮類化合物。結(jié)果表明:最佳提取工藝為乙醇濃度53.0%,料液比1∶29 g/mL,浸提溫度73 ℃,浸提時間2.6 h。在此條件下,實際得到的黃酮類化合物得率為2.133%,與理論得率2.143%,其RSD為3.5%,充分說明了優(yōu)化的纈草中黃酮類化合物提取為工藝穩(wěn)定,具有可靠性。

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Extraction of flavonoids from valerian optimized by response surface method

LU Zhong-ying1,CHEN Shi-xue1,*,LI Yan-qing1,YAO Yuan-yong2,LU Dao-wang2,XING Ming-ming2

(1.Experimental Center of Materials and Chemical Engineering,Tongren University,Tongren 554300,China;2.Institute of Applied Chemistry,Tongren University,Tongren 554300,China)

The extraction process of flavonoid compounds originated from Valeriana ofecnilis(produced from Guizhou province)was investigated using ethanol as the extraction solvent. Method:Four factors,including concentration of Ethanol,ratio of raw material to solvent,extracting temperature and time,were optimized by response surface method. The optimum conditions were as follows:the concentration of ethanol was 53.0%;ratio of material to solvent was 1∶29 g/mL;extraction temperature was 73 ℃ and extraction time was 26 h. Under the optimum conditions,the difference of between real value of 2.133% and theoretic value in rate of extraction was about 3.5%. Conclusion:Response surface method was a reliable tool to optimize the extraction of flavonoid compounds fromValerianaofecnilis.

Valerianaofecnilis;Flavonoids;Response surface method;Yield

2015-06-25

盧忠英(1987-),女,碩士,講師,研究方向:天然藥物化學(xué)成分與新藥研發(fā),E-mail:luzhongying@126.com。

陳仕學(xué)(1976-),女,碩士，副教授,研究方向:主要從事生化分析與天然產(chǎn)物化學(xué)成分分離,E-mail:461330960@qq.com。

梵凈山特色苗藥資源保護與開發(fā)產(chǎn)學(xué)研基地(黔教合KY字[2014]233);貴州省教育廳自然科學(xué)研究項目(黔教合2013184);貴州省普通高等學(xué)校特色重點實驗室(黔發(fā)合K字[2011]005)。

TS255.1

B

1002-0306(2016)05-0196-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.030