付瑞敏,邢文會(huì),張　紅,張麗琴,陳五嶺

(1.河南教育學(xué)院,河南鄭州 450046;2.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710069)

?

擴(kuò)展青霉拮抗菌的選育及抑菌機(jī)制初探

付瑞敏1,2,邢文會(huì)1,張紅1,張麗琴1,陳五嶺2,*

(1.河南教育學(xué)院,河南鄭州 450046;2.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710069)

為選育有效抑制擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)的拮抗菌,并初步探討其抑菌機(jī)制。從蘋果表面分離到拮抗擴(kuò)展青霉的菌株BA-16,經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rRNA基因序列分析,對(duì)該菌進(jìn)行鑒定,并采用低能N+注入技術(shù)對(duì)其進(jìn)行誘變選育。采用雙酶反應(yīng)體系檢測野生株和突變株對(duì)擴(kuò)展青霉分泌磷脂酶的抑制效果以檢測突變效果并探究其抑菌機(jī)制。經(jīng)鑒定,BA-16-8該菌被鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。低能N+注入技術(shù)誘變選育出的突變株BA-16-8抑菌性能顯著提高且遺傳性能穩(wěn)定。磷脂酶活性結(jié)果顯示,相對(duì)于野生株,突變株代謝產(chǎn)物可顯著抑制病原菌所分泌的磷脂酶A的活性,且其抑制效果隨濃度的增高而增強(qiáng),故推測拮抗菌可能通過該機(jī)制起到抑制擴(kuò)展青霉的作用。本研究對(duì)于蘋果采后青霉病的生物防治具有良好應(yīng)用開發(fā)前景。

擴(kuò)展青霉,解淀粉芽胞桿菌,低能N+注入,磷脂酶A

蘋果采摘后病害的感染會(huì)造成果實(shí)腐爛嚴(yán)重,給蘋果種植業(yè)及副產(chǎn)品加工行業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其中,青霉病是蘋果采摘后致其腐爛的重要病害之一,該病的有效防治成為蘋果產(chǎn)業(yè)亟待解決的問題。研究表明,引起青霉病的主要致病菌是擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)[1]。目前控制擴(kuò)展青霉的主要方式仍是以化學(xué)殺菌劑和冷藏等物理手段為主,化學(xué)殺菌劑雖然能夠有效控制病原菌擴(kuò)展青霉的生長,但是隨著病原菌抗藥性能和人們健康環(huán)保意識(shí)的不斷增強(qiáng),化學(xué)防治方法已逐漸不被人們認(rèn)可。諸如冷藏等物理方法雖然一定程度上可以阻止病原菌的生長但容易影響水果的風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值,且處理不當(dāng)會(huì)造成凍害,此外,處理成本也相對(duì)較高。而采用拮抗性生物抑制病原菌生長從而達(dá)到水果防腐和保鮮的生物防治方法作為水果采摘后病害防治的新方法,不僅不會(huì)改變水果的營養(yǎng)和風(fēng)味,還可以消除由于化學(xué)藥劑對(duì)人體健康所造成的隱患,故近幾年已成為水果防腐保鮮的研究熱點(diǎn)。

近年來已經(jīng)有不少關(guān)于蘋果青霉病的生物防治的研究報(bào)道,采用的生物防治菌主要集中于生防酵母。Li 等人[2]研究了粘質(zhì)紅酵母防治蘋果采后灰霉病和青霉病的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)該酵母通過誘導(dǎo)蘋果中過氧化物酶和多酚氧化酶的活性和高度抑制蘋果脂質(zhì)過氧化作用從而誘導(dǎo)蘋果中防御機(jī)制依賴性酶的活化,此外,該酵母通過和病原菌的空間和營養(yǎng)競爭抑制病原菌生長。后來,人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬的一些菌株可以抑制擴(kuò)展青霉的生長。Lee[3]等人從鹽生植物根際分離出枯草芽孢桿菌S16并研究了該菌對(duì)采摘后蘋果和水蜜桃青霉病的生物防治作用,發(fā)現(xiàn)該菌可有效抑制擴(kuò)展青霉的生長。磷脂酶A作為病原性真菌的致病因子,對(duì)于真菌在植物表面的定殖和入侵有重要輔助作用,有報(bào)道說明芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物如豐原素等脂肽類產(chǎn)物可對(duì)磷脂酶A的活性產(chǎn)生影響[4]。

本實(shí)驗(yàn)室從蘋果表面分離篩選到一株對(duì)擴(kuò)展青霉具有拮抗作用的菌株BA-16,結(jié)合該菌株的形態(tài)特征、生理生化和分子系統(tǒng)發(fā)育等特征分析結(jié)果對(duì)其進(jìn)行鑒定,并采用低能N+注入技術(shù)對(duì)其進(jìn)行誘變,以期獲得可有效拮抗青霉病的菌株,為日后將其應(yīng)用于采摘后蘋果青霉病的生物防治奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

致病菌擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)陜西省微生物研究所惠贈(zèng),供試蘋果采收于陜西洛川縣。

N+離子注入機(jī)BNU-400中科院北京市輻射中心研制,N+離子能量為25 KeV,束流0.4 mA,真空度為5×10-3Pa。

1.2培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(YEB)用于拮抗菌的培養(yǎng)[5]:牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,瓊脂15～20 g,水1000 mL,pH7.4～76.

PDA(馬鈴薯培養(yǎng)基)用于病原性真菌的培養(yǎng)[5]:馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂15～20 g,蒸餾水1000 mL,pH7.2.

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基用于發(fā)酵拮抗菌胞外抗菌性脂肽蛋白[6]:葡萄糖20 g,L-谷氨酸鈉5 g,MgSO40.5 g,KCl 0.5 g,KH2PO41 g,FeSO40.15 g,MnSO45 g,CuSO40.16 mg,蒸餾水1000 mL,pH7.2.

1.3細(xì)菌的分離、篩選

從感染青霉病蘋果的果面分離菌株。用無菌水清洗蘋果健康部位,將所得液體經(jīng)過10-1～10-6的梯度稀釋,將10-4、10-5、10-6梯度稀釋液分別涂布在YEB平板上,37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取各平板上的菌株分別進(jìn)行純化,得到單克隆,將其分別編號(hào)以作進(jìn)一步研究。

采用平板對(duì)峙法[7]對(duì)分離菌株進(jìn)行拮抗能力的篩選。以擴(kuò)展青霉為指示菌,將待測菌株和病原菌接種于PDA平板上,病原菌接種于平板中央,待測菌株同病原菌間的距離為2.5 cm 28 ℃培養(yǎng)48 h觀察其生長狀況,并測量抑菌帶寬度,實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,挑取抑菌條帶寬的菌株至YEB平板上,保存?zhèn)溆谩?/p>

將初篩所得菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,搖瓶震蕩培養(yǎng)72 h(37 ℃,150 r/min)。參照韓欣宇等的方法[8]制備菌株無細(xì)胞發(fā)酵液,將所制的發(fā)酵液200 μL接入牛津杯中,采用牛津杯法[9]檢測菌株無細(xì)胞發(fā)酵液拮抗擴(kuò)展青霉的能力。28 ℃培養(yǎng)24 h后,測量記錄牛津杯周圍出現(xiàn)的抑菌圈直徑,挑選直徑最大的菌株做進(jìn)一步研究。整個(gè)實(shí)驗(yàn)以無菌水作為對(duì)照,實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

1.4菌株的形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定

將復(fù)篩所選菌株經(jīng)染色、光學(xué)顯微鏡觀察菌體個(gè)體及群體形態(tài)。參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[10]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[11]就菌株的生理生化特征進(jìn)行初步鑒定。

1.516S rRNA基因序列分析

提取菌株的總基因組DNA為模板[12],利用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGTTACCTT GTTACGAC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[12]。PCR反應(yīng)體系25 μL,熱循環(huán)參數(shù)如下:94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,循環(huán)30次,72 ℃延伸10 min。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后提交至上海生工進(jìn)行測序,測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中相關(guān)菌種的16S rRNA基因序列用BLAST程序進(jìn)行比對(duì)分析,利用MEGA4.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13]。

1.6高效拮抗菌的低能N+注入誘變選育

1.6.1樣品處理以復(fù)篩所得的菌株為出發(fā)菌株,將其轉(zhuǎn)接至新鮮斜面并培養(yǎng)24 h后,用5 mL的生理鹽水清洗斜面菌苔,并將其倒入含有玻璃珠的錐形瓶內(nèi),充分振蕩后,采用分光光度計(jì)法測量其600 nm處的光吸收值,調(diào)整菌懸液濃度至OD600=0.986,此時(shí)菌懸液濃度為108cfu/mL。用微量移液器吸取0.1 mL菌懸液將其接種于90 mm的無菌平皿中,無菌條件下涂布均勻并風(fēng)干制成菌膜[14]。

1.6.2離子注入將待處理平皿置于離子注入室,打開皿蓋,室內(nèi)抽真空,注入能量為25 KeV的低能,N+離子束,注入劑量分別為1×1015、1.5×1015、2.0×1015、2.5×1015、3.0×1015ions/cm2。

1.6.3突變株的篩選用無菌生理鹽水1 mL沖洗離子注入后的平板,將所得液體進(jìn)行梯度稀釋到10-5、10-6和10-7,分別取各稀釋的菌懸液0.1 mL將其接種于YEB平板上,37 ℃培養(yǎng)48 h,觀察所得突變株的菌落形態(tài)并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.6.4計(jì)算存活率與正變率將突變株的發(fā)酵液接種于PDA平板上,采用牛津杯法檢測各突變株抗擴(kuò)展青霉能力,規(guī)定抑菌圈直徑大于出發(fā)菌株的為正變株,參照下列公式計(jì)算存活率與正變率:

存活率(%)=誘變后的活菌數(shù)/誘變前的活菌×100

正變率(%)=正突變的菌株數(shù)/誘變后的活菌×100

1.7正變株的篩選及遺傳穩(wěn)定性檢測

選取抑菌圈直徑較大的突變株,將其轉(zhuǎn)接至YEB平板上,37 ℃培養(yǎng)24 h,作為第一代,后每隔24 h傳一代,每代均隨機(jī)選取3個(gè)克隆采用牛津杯法檢測其無細(xì)胞發(fā)酵液抗擴(kuò)展青霉的活性,進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性檢測。

1.8擴(kuò)展青霉菌絲分泌的磷脂酶的提取

將培養(yǎng)了48 h的病原菌擴(kuò)展青霉培養(yǎng)液10000 g離心10 min,去除菌絲體,所得上清液用70%的飽和硫酸銨沉淀,而后10000×g離心5 min,取沉淀,用磷脂酶A提取液溶解,透析后所得產(chǎn)物即為磷脂酶A粗品。

1.9磷脂酶活性的測定

磷脂酶活力測定參照參考文獻(xiàn)[17],具體采用雙酶體系:1,2-二亞油?；蚜字?0 μL,Tris-Hcl 125 μL,大豆氧合酶5 μL,脫氧膽酸鈉溶液50 μL,磷脂酶A粗提液10 μL。雙酶反應(yīng)的基本原理是:以1,2-二亞油?；蚜字瑸榈诹字窤的底物,反應(yīng)后生成亞油酸,亞油酸由脂氧合酶催化發(fā)生氧化反應(yīng),生成氫過氧化物,其對(duì)應(yīng)的紫外吸收光譜在234 nm有吸收峰,單位時(shí)間內(nèi)(1 h),該波長下的吸光值每增加0.1即為1個(gè)酶活力單位。

1.10拮抗菌發(fā)酵液對(duì)病原菌分泌磷脂酶A的影響

將野生型BA-16和突變株BA-16-8的發(fā)酵24 h的菌株發(fā)酵液10000×g離心10 min,取上清,用超濾管過濾后即為無細(xì)胞發(fā)酵液,將所得無細(xì)胞發(fā)酵液分別做梯度稀釋,將不同稀釋度的無細(xì)胞發(fā)酵液分別定量加入雙酶反應(yīng)體系中,各自反應(yīng)1 h,通過測定各體系在234 nm處的吸光值,以不加無細(xì)胞發(fā)酵液的磷脂酶反應(yīng)吸光值為100,通過所得值與其的比值來衡量各稀釋度無細(xì)胞發(fā)酵液作用下的磷脂酶活性。

2　結(jié)果與分析

2.1擴(kuò)展青霉拮抗菌株的分離和篩選

經(jīng)過初篩從蘋果表面分離獲得18株菌,其中酵母4株,細(xì)菌14株。通過平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn),篩選出可拮抗擴(kuò)展青霉的6株。采用牛津杯法檢測六株菌的無細(xì)胞發(fā)酵液抗擴(kuò)展青霉活性,結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明:六株菌的菌株細(xì)胞和無細(xì)胞發(fā)酵液拮抗擴(kuò)展青霉的效果表現(xiàn)出了顯著的差異。其中,BA-16的拮抗效果最強(qiáng),故將其挑選出來做后續(xù)研究。

表1　擴(kuò)展青霉拮抗菌篩選結(jié)果Table 1　The screening results of antagonistic strains against Penicillium expansum

2.2擴(kuò)展青霉拮抗菌株的形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定

菌株BA-16經(jīng)革蘭氏染色陽性,顯微鏡鏡檢為桿菌,有芽孢,有莢膜,具有運(yùn)動(dòng)性。該菌株在LB平板上形成乳白色菌落。菌落邊緣不整齊,干燥不透明,中間有凸起。生理生化結(jié)果見表2。

表2　菌株BA-16的生理生化特征Table 2　Characteristics of physiology and biochemistry of BA-16 strains

注:+/-表示在生理生化鑒定中陽性/陰性反應(yīng)。+:陽性;-:陰性。

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》,結(jié)合菌株BA-16的形態(tài)、染色及生理生化特征,可將該菌株初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

2.316S rRNA 基因序列分析

提取菌株BA-16的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,凝膠電泳回收擴(kuò)增序列,得到一段1468 bp長度的16S rRNA基因,所獲序列提交至GenBank,登錄號(hào)No.KR31430。將其同GenBank中相近種屬進(jìn)行BLAST比對(duì),對(duì)BLAST結(jié)果進(jìn)行分析,通過MEGA 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。發(fā)現(xiàn)菌株BA-16與BacillusamyloliquefaciensAY603658的相似性達(dá)到99%,結(jié)合上述的生理生化鑒定結(jié)果,可將菌株BA-16最終鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

圖1　菌株BA-16 16SrRNA基因序列發(fā)育進(jìn)化樹Fig.1　Phylogenetic tree of 16s rRNA gene sequences of isolated strain BA-16

2.4離子注入誘變結(jié)果

2.4.1最佳誘變劑量的確定采用低能N+注入誘變BA-16,野生株在該離子能量作用下發(fā)生突變,不同注入劑量對(duì)菌株的存活率和正變率影響如圖2所示。

圖2　不同N+注入劑量對(duì)突變株的影響Fig.2　The effect of different does of N+ implantation on mutants

由圖中可以看出,一定范圍內(nèi),高劑量的離子注入可導(dǎo)致菌株正突變率的增加,同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致菌株存活率的下降,一般認(rèn)為,誘變菌株存活率在10%～20%,所得菌株正變率相對(duì)較高[15]。本實(shí)驗(yàn)中,注入劑量在1×1015ions/cm2和2×1015ions/cm2時(shí)存活率接近該范圍,而后者的正變率遠(yuǎn)高于前者,綜合考慮,以2×1015ions/cm2注入劑量為最佳誘變劑量。

研究發(fā)現(xiàn),剛開始注入離子時(shí),存活率急劇下降和正變率有所上升。推測其原因是帶能的氮離子最初作用于菌體細(xì)胞,可導(dǎo)致菌體細(xì)胞損傷從而導(dǎo)致存活率下降;同時(shí),能量在胞內(nèi)的積累也可導(dǎo)致菌體發(fā)生突變,故正變率有所上升。而當(dāng)注入劑量到達(dá)一定值(1.5×1015ions/cm2)時(shí),本來下降的存活率有了回升,而后又繼續(xù)下降。推測其原因可能是當(dāng)離子注入劑量達(dá)到一定程度,可通過作用于菌體細(xì)胞DNA而激活其修復(fù)機(jī)制,因而一直下降的存活率會(huì)有少量回升。而當(dāng)離子注入劑量進(jìn)一步加大,所致?lián)p傷已無法修復(fù),故存活率又進(jìn)一步下降。

2.4.2BA-16突變株的篩選及遺傳穩(wěn)定性分析采用不同劑量的N+注入共篩選出8 株抗擴(kuò)展青霉高于野生株解淀粉芽孢桿菌BA-16的正突變株,分別對(duì)這8 株突變株進(jìn)行平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)和牛津杯實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表3所示。選取抑菌帶寬和抑菌圈直徑在12以上的2 株突變型菌株:amyloliquefaciensBA-16-7和BacillusamyloliquefaciensBA-16-8進(jìn)行傳代培養(yǎng),并通過牛津杯法檢測各代拮抗病原菌的遺傳穩(wěn)定性,結(jié)果如表4所示。

由表4可知,經(jīng)過傳代,突變株BA-16-8抗菌性能差異不顯著,說明該突變株的遺傳穩(wěn)定性較好,而BA-16-7的抗菌能力在不同世代差異顯著且呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,說明該突變株的遺傳穩(wěn)定性較差,菌株退化較為嚴(yán)重。故選取突變株BA-16-8進(jìn)行后續(xù)研究。

表3　突變株抗擴(kuò)展青霉篩選結(jié)果Table 3　The screening results of mutants against Penicillium expansum

表4　突變株拮抗擴(kuò)展青霉的遺傳穩(wěn)定性分析結(jié)果Table 4　The Results of genetic stability analysis of mutants against Penicillium expansum

2.5磷脂酶A抑制實(shí)驗(yàn)

將拮抗菌的野生株和突變株的無細(xì)胞發(fā)酵液分別以不同梯度稀釋度的濃度定量加入磷脂酶反應(yīng)體系中,測定其酶活力比值,所得結(jié)果如圖3所示,隨著發(fā)酵液濃度的減少,所測得病原菌產(chǎn)磷脂酶A的活性直線上升,說明病原菌所產(chǎn)磷脂酶活受拮抗菌無細(xì)胞發(fā)酵液的抑制,且通過對(duì)比突變株和野生株的無細(xì)胞發(fā)酵液的抑制效果,發(fā)現(xiàn)突變株抑制效果顯著優(yōu)于野生株,當(dāng)用突變株的發(fā)酵液原液處理病原菌時(shí),其磷脂酶A活性幾乎完全被抑制。

據(jù)報(bào)道,芽孢桿菌代謝產(chǎn)物如豐原素等可抑制磷脂酶A的活性,本研究中,發(fā)現(xiàn)拮抗菌代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌所產(chǎn)磷脂酶A有抑制作用,且抑制作用隨濃度變化而變化,這一定程度上與前人報(bào)道結(jié)論是一致的[17-18],此外,由于磷脂酶A在病原菌侵染和定殖中起重要作用,因此,拮抗菌代謝產(chǎn)物對(duì)磷脂酶的抑制可緩解或阻止作物被病原菌感染的進(jìn)程。此外,研究發(fā)現(xiàn),與野生株相比,突變株對(duì)磷脂酶A的抑制作用要更明顯,這說明在誘變過程中突變株的代謝產(chǎn)物比如一些脂肽類抗生素的表達(dá)量有了增加,這種猜測將在進(jìn)一步的研究中加以驗(yàn)證。

圖3　不同濃度拮抗菌發(fā)酵液 對(duì)擴(kuò)展青霉分泌的磷脂酶A活性影響 Fig.3　Effects of fermentation broth in different concentration on the activity of PLA secreted by Penicillium expansum

3　結(jié)論

本研究主要針對(duì)蘋果采摘后主要致病菌擴(kuò)展青霉,從蘋果表面分離篩選出一株可有效拮抗擴(kuò)展青霉的細(xì)菌BA-16,經(jīng)鑒定,該菌為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)為進(jìn)一步提高菌株BA-16防治擴(kuò)展青霉的能力,我們采用低能N+注入技術(shù)對(duì)其進(jìn)行誘變。并研究了不同注入劑量對(duì)突變株存活率和正變率的影響。結(jié)果顯示,2×1015ions/cm2注入劑量為最佳誘變劑量。通過檢測突變株的菌體細(xì)胞和無細(xì)胞發(fā)酵液拮抗擴(kuò)展青霉的能力,篩選出抗菌性能最強(qiáng)且遺傳性能穩(wěn)定的突變株BA-16-8。將所得突變株和野生株的菌懸液和無細(xì)胞發(fā)酵液分別處理病原菌并檢測其對(duì)病原菌分泌磷脂酶A活性的影響,結(jié)果顯示,野生株和突變株均可不同程度地抑制病原菌所分泌磷脂酶的活性,其中突變株的抑制能力要明顯高于野生株,此外,隨著發(fā)酵液濃度的降低其抑制力也逐漸下降,說明,病原菌的代謝產(chǎn)物中有部分物質(zhì)比如Fengycin可影響磷脂酶A的活性,本研究結(jié)果有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

[1]Zhao L,Zhang H,Lin H,et al. Effect of trehalose on the biocontrol efficacy of pichia caribbica against post-harvest grey mould and blue mould decay of apples[J]. Pest management science,2013,69(1):983-989.

[2]Li R,Zhang H,Liu W,et al. Biocontrol of postharvest gray and blue mold decay of apples with rhodotorula mucilaginosa and possible mechanisms of action[J]. International Journal of Food Microbiology,2011,146(1):151-156.

[3]Hong P,Hao W,Luo J,et al. Combination of hot water,bacillus amyloliquefaciens hf-01 and sodium bicarbonate treatments to control postharvest decay of mandarin fruit[J]. Postharvest Biol Tec,2014,88(1):96-102.

[4]David HE,Tania CS. Hexadecylphosphocholine(Miltefosine)has broad-spectrum fungicidal activity and is efficacious in a mouse model of cryptococcosis[J]. Antimicrob Agents Chemother,

2006,50(2):414-421.

[5]Afsharmanesh H,Ahmadzadeh M,Javan-Nikkhah M,et al. Improvement in biocontrol activity of bacillus subtilis utb1 against aspergillus flavus using gamma-irradiation[J].Crop Protection,2014,60(2):83-92.

[6]姚磊,徐良雄,薛璟花,等. 枝頂孢屬真菌的抑菌活性及其代謝產(chǎn)物研究[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào),2012,20(1):192-196.

[7]劉雪,葉婧,穆長青,等. 枯草芽孢桿菌 b-332 菌株發(fā)酵條件的研究[J]. 農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù):英文版,2013,12(1):81-85.

[8]韓立榮,張華姣,高保衛(wèi),等. 放線菌 11-3-1 對(duì)油菜菌核病的防治作用與菌株鑒定[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào),2012,39(1):97-102.

[9]韓欣宇,陳志厚,羅定棋,等. Tpb55菌株發(fā)酵液中活性代謝產(chǎn)物的抑菌作用及穩(wěn)定性測定[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2012,28(1):260-264.

[10]韋婉,李少英,王夢姣,等. 益生乳酸菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的敏感性檢測方法的研究[J]. 食品科技,2013,10(1):22-26.

[11]黃文芳,張松. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 暨南大學(xué)出版社:2003.

[12]布坎南,吉本斯. 伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè),第八版[M],北京:科學(xué)出版社:1984.

[13]孫卓,楊利民. 人參病原菌拮抗細(xì)菌的分離篩選與鑒定[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào),2015,10(1):79-86.

[15]蔣益,鄭惠華,劉廣建,等. 低能 N+離子注入誘變選育云芝高產(chǎn)抗病菌株的研究[J]. 食用菌,2014,36(1):18-20.

[16]張瑞,周俊,王舒雅,等. 產(chǎn) γ-聚谷氨酸菌株的誘變選育及其種子液工藝優(yōu)化[J]. 生物加工過程,2015,13(1):47-53.

[17]Ivanovska N. Phospholipases as a factor of pathogenicity in microorganisms[J]. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2003(22):357-361.

[18]Ganendren R,Widmer F,Singhal V,et al.Invitroantifungal activities of inhibitors of phospholipases from the fungal pathogen cryptococcus neoformans[J]. Antimicrob Agents Chemother,2004(48):1561-1569.

Breeding of antagonistic bacteria againstPenicilliumexpansumand study on its inhibition mechanism

FU Rui-min1,2,XING Wen-hui1,ZHANG Hong1,ZHANG Li-qin1,CHEN Wu-ling2，*

(1.Henan Institute of Education,Zhengzhou 450046,China;2.Northwest University,Xi’an 710069,China)

To breed the antagonistic strain which can inhibitPenicilliumexpansumeffectively,and discuss its antibacterial mechanism preliminarily. An antagonistic strain BA-16,which could inhibitPenicilliumexpansum,was isolated from apple surface and identified based on phenotypic,physiological,biochemical and phylogenetic(16S rDNA)studies. In order to enhance its antagonistic capability,the mutation of BA-16 was carried out by using low energy N+implantation. Double enzyme reaction system was used to detect the phospholipase A(PLA)activity ofPenicilliumexpansumunder the action of wild-type antagonistic strain and its mutant. The strain BA-16 was identified as Bacillus amyloliquefaciens. After the low energy N+implantation,the mutant BA-16-8,which showed the strongest antagonist capability and stable hereditary stability was selected out. In phospholipase activity detection,mutant showed stronger inhibition against PLA activity secreted byPenicilliumexpansumthan its wild-type strain. Moreover,as the concentration of fermentation broth increased,the inhibition effect enhanced,which indicated that it was possibly the inhibitory mechanism of antagonistic strain againstPenicilliumexpansum. The mutant BA-16-8 will be a potential biological control agent against apple blue mold decay.

Penicilliumexpansum;Bacillus amyloliquefaciens;low energy N+implantation;phospholipase A

2015-04-27

付瑞敏(1981-)，女，在讀博士，講師，主要從事農(nóng)業(yè)及食品微生物研究，E-mail：angelaminmin@163.com。

陳五嶺(1954-)，男，碩士，教授，主要從事農(nóng)業(yè)、環(huán)境及食品微生物研究，E-mail：wulingchen@yeah.net。

農(nóng)業(yè)部科技成果與轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2012GB2G000451)；河南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(132102310253)；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(15B180002)；陜西省重大科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2009ZKC04-16)；河南教育學(xué)院青年科研課題項(xiàng)目(20100103)；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究(152300410092)。

TS201.3

B

1002-0306(2016)05-0154-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.021