孟丹陽,趙　偉,*,楊瑞金,讓一峰

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122;2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇無錫 214122)

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小麥面筋蛋白酶解過程中功能性質(zhì)的變化規(guī)律研究

孟丹陽1,趙偉1,*,楊瑞金2,讓一峰1

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122;2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇無錫 214122)

本文對小麥面筋蛋白在連續(xù)酶解過程中水解度(DH)、有效谷氨酰胺含量以及黏度、氮溶解指數(shù)(NSI)、起泡性、乳化性等功能性質(zhì)的變化規(guī)律進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,在酶底比相同的情況下,與中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶相比,堿性蛋白酶對小麥蛋白的酶解效率最高,同一反應(yīng)時(shí)間的DH最大,反應(yīng)至360 min時(shí),DH達(dá)到16.96%。隨著DH的增加:有效谷氨酰胺含量小幅度降低,在水解度小于15.13%的范圍內(nèi),其提取率大于86.2%;黏度減小,在DH 10.93%時(shí)出現(xiàn)短暫的上升;NSI、起泡能力指數(shù)、泡沫穩(wěn)定指數(shù)、乳化活力指數(shù)、乳化穩(wěn)定指數(shù)在DH 2.21%～15.13%范圍內(nèi)皆為先提高后降低,峰值分別為61.8%、225%、56.67%、10.57 m2/g、49.08,分別出現(xiàn)在DH 10.39%、8.81%、8.81%、9.64%、8.81%處,均在DH 8.8%～10.5%范圍內(nèi)。

小麥面筋蛋白,酶解,功能性質(zhì)

小麥面筋蛋白(wheat gluten)又稱谷朊粉、活性小麥面筋,粉末狀,由小麥面粉中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、提取、再烘干制成。Beccari在1728年最早發(fā)現(xiàn)[1]、并于1745年從小麥面粉生面團(tuán)中洗出谷朊粉。中國的谷朊粉生產(chǎn)起步晚,但是發(fā)展速度很快,產(chǎn)量已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過國內(nèi)的需求[2]。因此對谷朊粉進(jìn)行有效利用,提高其附加值具有重要的社會和經(jīng)濟(jì)意義。

谷朊粉的蛋白質(zhì)含量在75%～82%,氨基酸組成比較齊全,是食品加工中的重要原料,但其含疏水性氨基酸較多,離解度低,很難溶于水,因而影響其應(yīng)用[3],對其改性可改善其功能性質(zhì),拓寬應(yīng)用領(lǐng)域。酶法改性是一種較為溫和可控的改性方法,指利用堿性蛋白酶,中性蛋白酶,胰蛋白酶等水解酶類,專一或非專一性切斷肽鍵或者酰胺鍵,減小蛋白的分子量,改變空間結(jié)構(gòu),變成多肽或者小分子氨基酸,從而提高其溶解性[4]。然而深度水解往往會損壞其乳化性、發(fā)泡性等功能性質(zhì)[5],因此經(jīng)過有限酶解小麥蛋白提高其在水中的分散性即可拓展它的用途。齊軍茹[6]等人采用控制酶解提高了谷朊粉的功能特性。孔祥珍[7]等人用木瓜蛋白酶去酰胺改性谷朊粉,研究谷朊蛋白功能性質(zhì)的變化。

在小麥面筋蛋白的加工利用中,所需產(chǎn)品的功能性質(zhì)因用途而異,因此準(zhǔn)確把握蛋白的水解程度,高效地生產(chǎn)出目標(biāo)產(chǎn)品具有至關(guān)重要的意義。本文研究了小麥面筋蛋白在不同酶的作用下的水解進(jìn)程,并以水解度為自變量,深層次揭示了小麥面筋蛋白在酶解過程中的功能性質(zhì)變化規(guī)律,以期更好地指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

小麥面筋蛋白聯(lián)海生物科技有限公司;堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶諾維信酶制劑有限公司;福林酚試劑Sigma公司;L-2,4-二氨基丁酸(DABA,純度99.8%)上海翰鴻試劑有限公司;2,4-二硝基氟苯(DNFB)中國上海Sigma分公司;雙(1,1-三氟乙酸基)碘苯(BTI)美國Aldrich公司,大豆油金龍魚有限公司。

MP-501A超級恒溫循環(huán)槽上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DK-824電熱恒溫水浴鍋上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;C-MAG HS 4 S25磁力攪拌器上海圣科儀器設(shè)備有限公司;FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)梅特勒托利多儀器(上海)有限公司;高速分散器T25德國IKA;BS2202 S和BS 224 S精密天平賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;KDN-103F自動定氮儀上海纖檢儀器有限公司;UV-1100型紫外可見分光光度計(jì)上海美譜達(dá)儀器有限公司;Agilent 1100高效液相色譜儀安捷倫科技有限公司;NDJ-5S數(shù)顯旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)上海羽通儀器儀表廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1基本成分測定粗蛋白含量測定:微量凱氏定氮法(GB 5009.5-2010),蛋白質(zhì)換算系數(shù)為5.70;含水量測定:105 ℃恒重法(GB 5009.3-2010);灰分含量測定:灼燒法(GB 5009.4-2010)粗脂肪含量測定:索氏抽提法(GB/T 5512-2008)。

1.2.2氨基酸組成測定參照GB/T 5009.124-2003。

1.2.3蛋白酶活力測定福林法(GB/T 23527-2009)。

1.2.4小麥面筋蛋白的酶解將小麥面筋蛋白分散于已預(yù)熱至最適溫度的去離子水中,形成固形物濃度10%的懸浮液,加氫氧化鈉溶液調(diào)至最適pH并保持,加酶(150 U/g小麥面筋蛋白)后恒溫?cái)嚢?反應(yīng)結(jié)束采用100 ℃、10 min水浴滅酶,迅速冷卻并噴霧干燥。

1.2.5水解度的測定pH-Stat法。蛋白質(zhì)水解度指蛋白質(zhì)在水解反應(yīng)過程中被水解的肽鍵的百分?jǐn)?shù),參照Adler-Nissen[8]的方法,加酶之前用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)體系到蛋白酶最適pH,反應(yīng)過程中用濃度為0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH并使其保持恒定,分別每5 min(反應(yīng)時(shí)間0～30 min)、每15 min(反應(yīng)時(shí)間30～90 min)、每30 min(反應(yīng)時(shí)間90～360 min)記錄反應(yīng)過程中所使用的堿液量。水解度計(jì)算公式:

其中,B-所消耗的0.1mol/LNaOH的體積;mL;Nb-堿液的濃度,0.1mol/L;α-α-NH2的平均解離度;mp-底物中蛋白質(zhì)質(zhì)量,g;htot-底物蛋白總肽鍵,對小麥面筋蛋白,htot=8.38[4]。

1.2.6有效谷氨酰胺含量測定將非氮端谷氨酰胺定義為有效谷氨酰胺。樣品中的非氮端谷氨酰胺經(jīng)BTI衍生轉(zhuǎn)化為DABA,再經(jīng)紫外顯色后用超高效液相色譜儀檢測定量,具體操作步驟見參考文獻(xiàn)[9-10]。

1.2.7粘度的測定從酶解罐里取出適量樣品,立即用旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)測定溶液的粘度,每組樣品重復(fù)測定3次,取平均值。

1.2.8氮溶解指數(shù)(NSI)的測定將樣品溶于去離子水中,配制成1%(w/v)的溶液,攪拌1h,離心20min(4000r/min),取上清液,用微量凱氏定氮法(GB5009.5-2010)測上清液蛋白質(zhì)含量。NSI(%)=上清液中蛋白質(zhì)含量/樣品中總蛋白質(zhì)含量×100。

1.2.9起泡性、泡沫穩(wěn)定性的測定參照文獻(xiàn)[11]的方法,將蛋白溶于去離子水中,配制成1%(w/v)的溶液,取30mL用高速分散器10000r/min攪打1min后立即倒入量筒,記下泡沫體積V1,10min后記錄下泡沫體積V2。起泡能力指數(shù)=V1/30,泡沫穩(wěn)定指數(shù)=V2/V1。

1.2.10乳化性、乳化穩(wěn)定性的測定參考Pearce和Kinsella的方法[12],略做修改。將谷朊粉水解物溶于去離子水,配制成1%(w/v)的溶液,取35mL加入5mL大豆油,10000r/min攪拌1min,立即吸取底部樣液,以0.1%SDS(w/v)稀釋100倍,測定500nm處的吸光值A(chǔ),以0.1%SDS(w/v)為空白,10min后再次取樣、稀釋、測吸光度。乳化性以乳化活力指數(shù)(EAI)表示:EAI=2×(2.303A)×N×10-4/φLC

其中:EAI-每克蛋白質(zhì)的乳化面積(m2/g);N-稀釋倍數(shù);φ-油相占體系分?jǐn)?shù),為0.125;C-蛋白質(zhì)濃度(g/mL);L-比色池光徑(1cm)。

乳化穩(wěn)定性用乳化穩(wěn)定指數(shù)(ESI,單位為1)表示:ES=A0×ΔT/(A0-At)

其中:A0-0 時(shí)刻的吸光值;At-t時(shí)刻的吸光值。

2　結(jié)果與討論

2.1原料小麥面筋蛋白理化、功能性質(zhì)分析

2.1.1主要成分由表1可知,小麥面筋蛋白中蛋白質(zhì)含量豐富,灰分和脂肪含量很少,富含非氮端谷氨酰胺。

2.1.2氨基酸組成由表2可知,小麥面筋蛋白氨基酸組成比較齊全,必需氨基酸含量為20.2%,有較高的營養(yǎng)價(jià)值;酸水解后的谷氨酸含量為29.20%,其中23.41%是以非氮端谷氨酰胺的形式存在于原料中(表1);脯氨酸為疏水氨基酸,含量高達(dá)9.78%,而賴氨酸、精氨酸、組氨酸等親水氨基酸含量較少。氨基酸組成直接影響小麥蛋白的溶解性、起泡性等功能性質(zhì)。

表1　小麥面筋蛋白主要成分(g/100 g)Table 1　Main composition of wheat gluten(g/100 g)

表2　小麥面筋蛋白氨基酸組成Table 2　Amino acid composition of wheat gluten

注:*為必需氨基酸;表中未顯示的氨基酸代表未檢測出。

2.1.3功能性質(zhì)分析由表3可知,谷朊粉的各功能性質(zhì)有限,改性以改善其功能性質(zhì)有重要意義。

表3　小麥面筋蛋白主要功能性質(zhì)Table 3　Main functionalities of wheat gluten

2.2不同蛋白酶酶解的水解度進(jìn)程曲線

根據(jù)初步酶解實(shí)驗(yàn),各種酶最適溫度、pH條件如表4所示。分別采用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶(150 U/g)在最適溫度、pH下對谷朊粉進(jìn)行酶解。由圖1可知,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,三種酶解反應(yīng)DH不斷增大并趨于平緩,水解速率降低。水解速率降低的原因有[13]:隨著酶解的進(jìn)行,反應(yīng)體系中底物蛋白質(zhì)中用于水解的肽鍵濃度降低;酶解過程中產(chǎn)生的酶解產(chǎn)物對蛋白的酶解過程產(chǎn)生了抑制作用;二級酶自動失活,以及可溶性產(chǎn)物的增多使水分活度降低,導(dǎo)致蛋白酶的活力下降[14]。在酶底比相同的情況下,同一反應(yīng)時(shí)間的DH堿性蛋白酶>中性蛋白酶>風(fēng)味蛋白酶,反應(yīng)至360 min時(shí),a的水解度達(dá)到16.96%,b達(dá)到5.28%,c達(dá)到2.05%。3種酶相比,在相同的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)堿性蛋白酶能達(dá)到的DH最高,因此選擇堿性蛋白酶酶解作為后續(xù)研究的基礎(chǔ)。

圖1　小麥蛋白酶解進(jìn)程曲線Fig.1　Enzymatic hydrolysis of wheat gluten with different proteases

2.3酶解過程中有效谷氨酰胺含量的變化規(guī)律

谷氨酰胺是機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下的一種“條件必需氨基酸”,但游離谷氨酰胺或氮端谷氨酰胺在溶液中極易發(fā)生環(huán)化生成焦谷氨酸[15],失去本有的功效,因此將非氮端谷氨酰胺定義為有效谷氨酰胺。谷氨酰胺肽作為谷氨酰胺的穩(wěn)態(tài)化供體,可從小麥面筋蛋白酶解物中獲取。1993年,日本學(xué)者Tanabe等[16]首次以小麥面筋蛋白為原料,采用Molsin(XIII)和Actinase E兩種蛋白酶對底物進(jìn)行48 h酶解,再經(jīng)Sephadex G-15純化后得到高谷氨酰胺含量的小麥低聚肽。呂艷[17]采用酸性蛋白酶在小麥面筋蛋白[S]=15 g/100 mL、[E]/[S]=5%、pH2.5、溫度45 ℃條件下酶解3 h,制得谷氨酰胺肽中有效谷氨酰胺含量為11.2%。

表4　各種酶最適反應(yīng)溫度和pHTable 4　The optimal reaction temperature and pH of enzymes

圖2　有效谷氨酰胺含量隨DH的變化曲線Fig.2　The change curve of effective glutamine content with DH

由圖2可知,隨著水解度由0增長到15.13%,樣品中有效谷氨酰胺含量由23.41%降至20.18%,有效谷氨酰胺最終提取率86.2%。堿性蛋白酶是內(nèi)切酶,反應(yīng)過程中可能會水解酰胺基團(tuán),但本研究中,小麥面筋蛋白中的有效谷氨酰胺在堿性蛋白酶酶解過程中破壞程度較小,符合高含量谷氨酰胺肽的要求。

2.4酶解過程中粘度的變化規(guī)律

如圖3所示,隨著水解度的增加,樣品粘度由9.8 mPa·s快速下降至4.3 mPa·s,而后又以相對緩慢的速度降至2.7 mPa·s,在DH10.39%～11.71%范圍內(nèi)時(shí),粘度又略有上升,至3 mPa·s,隨后繼續(xù)緩慢下降。這可能與小麥面筋蛋白酶解時(shí)蛋白質(zhì)分子的變化有關(guān)。

圖3　粘度隨DH的變化曲線Fig.3　The change curve of viscosity with DH

小麥面筋蛋白主要成分為麥谷蛋白和麥醇溶蛋白。前者是由分子內(nèi)和分子間二硫鍵形成的大的多聚體;后者是單體分子,二硫鍵都分布于分子內(nèi)部,分子為非極性,呈球形。兩者之間通過化學(xué)鍵強(qiáng)烈纏繞而成為復(fù)雜的高分子聚合物。經(jīng)過適當(dāng)酶解后,小麥蛋白質(zhì)大分子肽鏈斷裂形成多肽和小分子短鏈物質(zhì),二硫鍵部分?jǐn)嗔?釋放谷蛋白亞基,網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到一些破壞,分子粒徑減小,粘度下降。而后粘度略有上升可能是由類蛋白反應(yīng)造成的。Danilevski和Okuneff于1902年在蛋白水解液中添加凝乳酶導(dǎo)致沉淀產(chǎn)生發(fā)現(xiàn)而發(fā)現(xiàn)類蛋白反應(yīng),其原理就是由較低的分子質(zhì)量的肽在反應(yīng)過程中受到水解作用、縮合作用、轉(zhuǎn)肽作用以及物理聚集作用的影響,而最終形成類似與蛋白質(zhì)的混合物體[18],通常被認(rèn)為是蛋白質(zhì)水解反應(yīng)的逆反應(yīng)。不同水解度的谷朊粉,分子間的相互作用不同,且本研究中固形物濃度較小(10%),不足以保持類蛋白反應(yīng)長期占優(yōu)勢,因此粘度略升高以后繼續(xù)下降,并趨于平穩(wěn)。

2.5酶解過程中NSI的變化規(guī)律

溶解度的影響主要因素為疏水性、電荷率,氨基酸分析表明:小麥蛋白中含有大量的谷氨酰胺(Gln)和脯氨酸(Pro)及非極性氨基酸,帶電氨基酸含量較少,因此難溶于水。小麥蛋白經(jīng)過蛋白酶水解后,分子內(nèi)氫鍵部分?jǐn)嗔?分子量減小,蛋白質(zhì)分子構(gòu)象展開,更多的氨基酸殘基暴露,使得蛋白與溶劑之間的作用力增大從而溶解性得以提高。如圖4所示,隨著水解度的增大,蛋白逐漸被酶水解為更小的分子,溶解性逐漸提高,同樣在DH10.39%達(dá)到峰值61.8%后,開始緩慢下降。這可能跟粘度略上升的原因相同,即類蛋白反應(yīng)產(chǎn)生了一些不溶物。

圖4　NSI隨DH的變化曲線Fig.4　The change curve of NSI with DH

2.6酶解過程中泡沫性能的變化規(guī)律

由圖5可知,隨著水解度的增大,樣品起泡能力指數(shù)逐漸由74%增大至峰值225%,而后逐漸減小;泡沫穩(wěn)定指數(shù)由59.46%迅速下降后上升至峰值56.67%,而后逐漸降低。酶解打破了谷朊粉大分子原有的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),所以酶解初期泡沫穩(wěn)定性迅速下降,隨著水解度繼續(xù)增大,肽鍵斷裂的數(shù)量增多,蛋白質(zhì)分子柔性增加,變得更舒展,更多的基團(tuán)暴露在水中,且界面張力降低,形成穩(wěn)定界面相的能力增強(qiáng),因此起泡能力指數(shù)和泡沫穩(wěn)定指數(shù)增大。蛋白質(zhì)的分子量減小到一定程度后,成為了多肽或者氨基酸,失去了蛋白質(zhì)固有的空間結(jié)構(gòu),不足以穩(wěn)定液膜,使起泡能力指數(shù)和泡沫穩(wěn)定指數(shù)又有所下降。

圖5　泡沫性能隨DH的變化曲線Fig.5　The change curve of foaming properties with DH

2.7酶解過程中乳化性能的變化規(guī)律

圖6　乳化性能隨DH的變化曲線Fig.6　The change curve of emulsifying properties with DH

蛋白質(zhì)表面性質(zhì)使蛋白質(zhì)具有一定的乳化性。如圖6所示,隨著水解度的增大,蛋白分子量減小,分子空間結(jié)構(gòu)打開,蛋白分子柔性增加,溶解性增加,使蛋白質(zhì)分子很快擴(kuò)散到界面膜上,增大了蛋白質(zhì)的乳化性。從圖中可以看出水解度9.64%時(shí)乳化活力指數(shù)最大,為10.57 m2/g,當(dāng)水解度為8.81%時(shí),乳化穩(wěn)定指數(shù)達(dá)到最大值49.08。而后水解度繼續(xù)增加,蛋白質(zhì)被水解為分子量更小的短肽或者游離氨基酸,雙親結(jié)構(gòu)改變,使乳化活力指數(shù)和乳化穩(wěn)定指數(shù)都降低。由此看出適度的酶水解可以提高溶解度,從而提高乳化性[19]。

3　結(jié)論

在酶解小麥面筋蛋白的研究中發(fā)現(xiàn),隨著反應(yīng)時(shí)間的延長,水解度持續(xù)增大并最終趨于平穩(wěn),在酶底比相同的情況下,堿性蛋白酶能達(dá)到更高的水解度。本文通過堿性蛋白酶酶解小麥面筋蛋白研究了其功能性質(zhì)隨水解度的變化規(guī)律,結(jié)果表明隨著水解度的增大,有效谷氨酰胺含量緩慢減少,但在水解度15.13%以下時(shí)能保持較高的提取率(大于86.2%);粘度下降并在DH10.39%時(shí)略回升,之后略有下降并趨于平穩(wěn);NSI、起泡能力指數(shù)、泡沫穩(wěn)定指數(shù)、乳化活力指數(shù)、乳化穩(wěn)定指數(shù)皆為先提高后降低,且峰值均在DH8.8%～10.5%范圍內(nèi)。由此可見在此水解度范圍內(nèi)小麥面筋蛋白各方面功能性質(zhì)改善效果良好,在實(shí)際應(yīng)用中不同產(chǎn)品的所需功能性質(zhì)不同,可根據(jù)側(cè)重點(diǎn)的不同來進(jìn)行適度酶解,以求高效地生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)品。

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Study on the change rules of functionalities in enzymatic hydrolysis of wheat gluten

MENG Dan-yang1,ZHAO Wei1,*,YANG Rui-jin2,RANG Yi-feng1

(1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.State Key Laboratory of Food Science & Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Change rules of degree of hydrolysis(DH),effective glutamine and functionalities such as viscosity,nitrogen solubility index(NSI),emulsification,foaming capacity in enzymatic hydrolysis of wheat gluten were investigated.The results showed that alcalase posed the highest enzymatic hydrolysis efficiency,which got the highest DH at any time in the process of enzymatic hydrolysis compared with neutral protease and flavorzyme in the case of the same enzyme substrate ratio,while DH reached 16.96% at the reaction time of 360 min.With the increase of DH,effective glutamine content decreased slightly,of which the retention remained at 86.2% or more with DH range of 0～15.13%.Viscosity kept decreasing in general while temporarily increased slightly at DH 10.93%.NSI,foaming ability,foam stabilizing index,emulsifying activity,emulsifying stability index all increased in the DH range of 2.21%～15.13% at first,reaching a maximum of 61.8%,225%,56.67%,10.57 m2/g,49.08 at DH10.39%,8.81%,8.81%,9.64%,8.81% respectively,which were in the DH range of 8.8%～10.5% and then dropped down.

wheat gluten;enzymatic hydrolysis;functionalities

2015-08-31

孟丹陽(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：食品加工與配料，E-mail：danyangmeng@163.com。

趙偉(1982-)，男，博士，教授，研究方向：食品加工，E-mail：zhaow@jiangnan.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271977)。

TS201

A

1002-0306(2016)05-0115-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.014